Актуальность проблемы.
Одной из наиболее серьезных проблем современной медицины является стремительный рост числа возбудителей инфекционных заболеваний, как внутрибольничных, так и внебольничных, имеющих множественную лекарственную устойчивость (МЛУ). Неудачи клинического лечения, подъем заболеваемости и смертности, увеличение продолжительности пребывания в стационаре зачастую связаны с инфекциями, вызываемыми такими микроорганизмами [79]. Устойчивость микроорганизмов к антибактериальным препаратам является неизбежным следствием широкого клинического применения антибиотиков. В различные периоды времени, в зависимости от перечня антибиотиков разных функциональных групп, интенсивно используемых в лечебных учреждениях, в популяциях бактериальных патогенов развиваются разные механизмы резистентности к антибактериальным препаратам и способы распространения генов МЛУ [143]. Терапия инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, наиболее часто основывается на использовании бета-лактамных антибиотиков, фторхинолонов и аминогликозидов. Общее потребление антибиотиков за последние годы значительно возросло, а расширенное их использование привело к повышению резистентности к данным классам лекарств. Распространение генов устойчивости к антибактериальным средствам среди возбудителей инфекционных болезней человека и, прежде всего, возбудителей госпитальных инфекций, приняло угрожающий характер [3, 139].
Горизонтальный перенос генов посредством плазмид, имеющих мозаичную генетическую структуру, формируемую в результате процессов рекомбинации и транспозиции, является причиной наблюдаемого повсеместно быстрого распространения генов устойчивости к разным классам антибиотиков [57]. Фенотип МЛУ у бактерий формируется в результате аккумуляции внутри плазмид или транспозонов генов, обеспечивающих устойчивость к отдельным антибиотикам и/или кодирующих эффлюксные насосы, которые могут удалять из клетки несколько видов лекарств одновременно [94].
Быстрое определение видовой принадлежности возбудителей инфекций и их чувствительности к антибактериальным препаратам зачастую является вопросом жизни и смерти пациентов. Методы, используемые для этого в рутинной практике, варьируют в зависимости от оснащенности клинических лабораторий и подготовленности персонала — от микробиологических, в разной степени автоматизированных, до молекулярно-биологических. Наиболее перспективными с точки зрения быстроты и точности получаемого ответа являются разные варианты скрининга, основанного на амплификации ДНК с помощью специфичных праймеров, особенно полимеразная цепная реакция (ПЦР), в стандартном режиме и в режиме реального времени [47]. Преимуществами данного метода являются быстрота, надежность и специфичностьнедостатком — то, что выявлению подлежат только уже описанные ранее последовательности ДНК, гены или мутации. Поэтому исследования, направленные на увеличение списка генетических детерминант, доступных тестированию, проводятся постоянно и основываются на изучении генотипов бактерий, циркулирующих в настоящее время в конкретном регионе. При этом большое значение приобретают не только детекция генов резистентности как таковых, но также выявление и характеристика молекулярных механизмов их эволюции и распространения (кассеты МЛУ, мобильные генетические элементы, плазмиды). Такой подход позволяет оценить современную эпидемиологическую ситуацию по распространению антибиотикорезистентности среди популяций бактериальных патогенов, определить молекулярные механизмы природы этой резистентности, прогнозировать ее развитие на будущее и представить клиницистам рекомендации по оптимизации схем лечения определенных типов инфекционных заболеваний [10]. г 7.
Цель исследования.
Целью настоящего исследования является выявление и молекулярно-генетическая характеристика маркеров резистентности к антибактериальным препаратам у бактерий семейства Enterobacteriaceae, выделенных в стационарах Российской Федерации в 2003;2007 гг.
Задачи исследования.
1. Создание коллекции антибиотикорезистентных госпитальных (нозокомиальных) штаммов семейства Enterobacteriaceae, выделенных в разных регионах РФ в 2003;2007 гг.
2. ПЦР-скрининг нозокомиальных штаммов семейства Enterobacteriaceae на наличие генов устойчивости к бета-лактамным антибиотикам и антибактериальным средствам других функциональных классов. Анализ распространенности генов устойчивости.
3. Разработка алгоритма идентификации генов ЫаСтх детерминирующих синтез наиболее распространенного типа бета-лактамаз расширенного спектра (БЛРС), с помощью ПЦР-ПДРФ анализа.
4. Изучение генетического окружения генов 6/<�ясгх-м и определение мобильных генетических элементов, обеспечивающих эпидемическое распространение данных генов.
5. Детекция конъюгативных плазмид и интегронных структур в госпитальных штаммах семейства Enterobacteriaceae.
6. Создание перечня генетических маркеров антибиотикорези-стентности для ПЦР-детекции у возбудителей госпитальных инфекций семейства Enterobacteriaceae.
Научная новизна работы.
Проанализирована коллекция МЛУ бактерий семейства Enterobacteriaceae — возбудителей госпитальных инфекций, выделенных в РФ в течение 2003;2007 гг., на наличие генов устойчивости к антибиотикам разных функциональных классов. Выявлено, что в подавляющем большинстве случаев.
75%) устойчивость к этому классу антибиотиков обусловлена продукцией БЛРС СТХ-М типа. Разработан алгоритм ПЦР-ПДРФ анализа для идентификации генов ?/"стх-м, позволяющий определить до индивидуального гена 49 генов из 96, а остальные 47 — в составе небольших групп. Изучено генетическое окружение генов 6/ясгх-м подтипов (кластеров) 1, 2 и 9, выявлено и размещено в базе данных GenBank 46 последовательностей, аналогичных ранее описанным и 15 новых вариантов последовательностей. Идентифицирован новый ген 6/ястх-м-пб и размещен в базах данных GenBank и Lahey. Показано, что гены 6/астх-м локализованы преимущественно на высокомолекулярных конъюгативных плазмидах (>80 т.п.н.), принадлежащих к различным группам несовместимости, в зависимости от кластера фермента: IncF, IncA/C, IncN, Incll и IncL/M — для кластера 1- Incll и IncP — для кластера 2- IncF, IncA/C, IncK, Incll, IncB/O, IncFlA и IncFIB — для кластера 9. Показано, что гены, обеспечивающие устойчивость к другим классам антимикробных веществ (аминогликозидам, сульфаниламидам, хлорамфениколу), часто располагаются на тех же плазмидах, что и гены Ыас гх-м> внутри вариабельных участков интегронов классов 1 и 2. Размещены в базе данных GenBank 43 последовательности интегронных вставок, в том числе новых — 3.
Практическая значимость работы.
Собрана и охарактеризована коллекция штаммов энтеробактерийвозбудителей нозокомиальных инфекций (п=923). Депонированы в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ (Федеральный уровень внедрения) штаммы (п=141), охарактеризованные по уровням и спектрам устойчивости к антибактериальным средствам разных функциональных классов, в том числе штаммы, депонированные в качестве референсных для детекции генов антибиотикоустойчиво-сти (п=33). Созданы электронные каталоги «Нозокомиальные штаммы энтеробактерий, выделенные в России в 2003;2007 гг.» и «Генетические маркеры для изучения антибиотикоустойчивости у энтеробактерий», доступные для использования в научной библиотеке ФБУН ГНЦ ПМБ. Разработаны методические рекомендации «Идентификация генов Ыасх-м> детерминирующих устойчивость к цефалоспоринам III-IV поколений, методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов» (Учрежденческий уровень внедрения, 2010 г.) и «Молекулярно-генетические методы выявления генов лекарственной устойчивости в популяциях возбудителей бактериальных инфекций» (Учрежденческий уровень внедрения, 2010 г.). Материалы диссертации используются Пущинским государственным университетом в процессе подготовки магистрантов по специальности 03.02.03 — «микробиология» в курсах «Генетика и молекулярная микробиология микроорганизмов» и «Лекарственная устойчивость микроорганизмов». Размещены в базе данных GenBank 136 последовательностей ДНК генов антибиотикоустойчивости и их генетического окружения, доступные для использования исследователям во всем мире.
Положения, выносимые на защиту.
1. Госпитальные штаммы энтеробактерий, выделенные в различных регионах РФ в 2003;2007 гг., в большом проценте случаев являются носителями генов резистентности к антимикробным препаратам различных функциональных групп одновременно, что определяет их множественную устойчивость.
2. Устойчивость изученных штаммов к бета-лактамным антибиотикам определяется наличием генов бета-лактамаз ТЕМ, SHY, ОХА, АтрС и СТХ-М типов, присутствующих в геномах преимущественно по два (49% изолятов) или три (18% изолятов) гена в разных сочетаниях.
3. Гены Ыастх. м — превалирующие детерминанты устойчивости к бета-лактамам (77% штаммов) — локализованы преимущественно на высокомолекулярных плазмидах (>80 т.п.н.), имеющих гибридную природу и относящихся к группам несовместимости IncF, IncA/C, Inc L/M. Генетическое окружение данных генов включает мобильные генетические элементы ISEcpl, IS26, IS903, orf513 и др., в зависимости от кластера гена и вида микроорганизма.
4. Разработанный алгоритм ПЦР-ПДРФ-анализа позволяет идентифицировать описанные к настоящему времени гены 6/ястх-м До индивидуального гена (51%) или в составе небольших подгрупп (49%).
5. В геноме нозокомиального штамма Proteus mirabilis, выделенного в Москве в 2005 г., идентифицирован ген ?/остх-м-пб (учетный номер в международной базе данных GenBank JF966749- учетный номер в специализированной базе данных Lahey — «СТХ-М-116»), кодирующий ранее не описанный фермент СТХ-М-типа, имеющий гибридную природу.
6. Интегроны классов 1 и 2 играют важную роль в формирование антибиотикоустойчивости к аминогликозидам, хлорамфениколу, эритромицину, сульфаниламидам и др. препаратам у значительной части (38%) госпитальных штаммов энтеробактерий, выделенных в РФ в 2003;2007 гг.
7. Устойчивости к хинолонам у 23% штаммов Enterobacter spp. определяется наличием плазмидных генов qnr, сравнительно новым молекулярным механизмом устойчивости к данному классу препаратов.
8. Перечень генетических маркеров для ПЦР-детекции генов резистентности, включающий в себя детерминанты устойчивости к бета-лактамам (13), к аминогликозидам (7), к сульфаниламидам (5), к хинолонам (3), к другим антибактериальным препаратам (4), может обеспечить информативную генетическую характеристику госпитальных штаммов Enterobacteriaceae, циркулирующих в клиниках РФ.
Работа выполнена в лаборатории антимикробных препаратов отдела молекулярной микробиологии ФБУН ГНЦ ПМБ в рамках темы НИР «Исследование генетических структур, ответственных за устойчивость к расширенному спектру антибактериальных средств у возбудителей внутрибольничных и пищевых инфекций» (2006;2010 гг.) и международного проекта ISTC#2913/BTEP#61 «Изучение распространенности и молекулярно-генетических механизмов устойчивости грамотрицательных возбудителей нозокомиальных инфекций к бета-лактамным антибиотикам» (2005;2007).
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена лично авторомрезультаты, описанные в отдельных главах получены в сотрудничестве с к.б.н. Фурсовой Н. К., к.м.н. Абаевым И. В., к.б.н. Кругловым А. Н., н.с. Печерских Э. И., к.б.н. Коробовой О. В., к.б.н. Шишковой Н. А., к.м.н. Аниси-мовой В.Н., к.б.н. Ковалёвым Ю. Н., к.м.н. Асташкиным Е. И., к.б.н. Пачкуно-вым Д.М., д.в.н., проф. Светочем Э. А., д.м.н., проф. Сидоренко С. В. и д.м.н., проф. Дятловым И.А.
Апробация работы. Основные материалы по теме диссертационной работы были представлены, доложены и обсуждены на 18 российских и международных конференциях: The 16th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Nice, France, April 1−4, 2006; VII Международный Конгресс MAKMAX/ASM по антимикробной терапии. 30 мая — 1 июня 2006 г., МоскваThe 2006 NIAID Research Conference, Opatija, Croatia, June 24−30, 2006; The 46th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. San Francisco, USA, September 27−30, 2006; VII Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ, 3−5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл., РоссияThe 17th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID) & 25th International Congress of Chemotherapy (ICC), Munich, Germany, March 31-April 4, 2007; IX Международный конгресс MAKMAX/BSAC по антимикробной терапии. Москва, 30 мая — 1 июня 2007 г.- The 47th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago, IL, USA, September 17−20, 2007; «Молекулярная диагностика-2007». Москва, 28−30 ноября 2007 г.- Всероссийская научная конференция «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». Санкт-Петербург, 18−19 апреля 2008; The 18th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Barcelona, Spain, April 19−22, 2008; I Оболенская школа-конференция молодых ученых. 22−23 апреля 2008 г.- X Международный конгресс МАКМАХ по антимикробной терапии. Москва, 21−23 мая 2008; The 19th European Congress on Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ECCMID), Helsinki, Finland, May 16−19, 2009; The 12th SAC Seminar «Combating Global Infections», Irkutsk, Sept., 21−25, 2009. Международная научная конференция «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями», Санкт-Петербург, 18−20 мая 2010 г.- Первая международная научная-практическая конференция «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Москва, 17−19 ноября 2010 г.- XIII Международный конгресс МАКМАХ по антимикробной терапии. Москва, 18−20 мая 2011.
Публикации. Основное содержание работы отражено в 22 публикациях, в том числе в трех научных работах, опубликованных в изданиях, рекомендованных ВАК.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
.
Представители семейства ЕмегоЬаМепасеае играют важнейшую роль в этиологии госпитальных инфекций — они составляют около 20% среди общего количества возбудителей. В данном исследовании проведено сравнительное изучение изолятов, выделенных в 2003;2004 гг. из крупных городов РФ, и в 2005;2007 гг. — из клиник ММА им. И. М. Сеченова. Показано, что штаммы обеих коллекций устойчивы к бета-лактамам, аминогликозидам, фторхинолонам и сульфаниламидам. Большая часть коллекции (89%) представлена штаммами, одновременно устойчивыми к трем и более классам антибактериальных препаратов. Показано, что геномы штаммов, устойчивых к бета-лактамным антибиотикам, содержат от одного до трех генов различных бета-лактамаз. Наиболее распространенным геном является ген Ь/астх-м-15, принадлежащий к кластеру Ь/ястх-м-ь Генетическое окружение генов, кодирующих бета-лактамазы СТХ-М типа, включает в себя мобильные генетические элементы, набор которых характерен для индивидуальных генов и вида микроорганизма. Показана значительная вариабельность данных последовательностей, что указывает на бурные эволюционные процессы, проходящие в данных участках генома. Подтверждением данного тезиса явилось открытие нового гена Ь/ястх-м-пб5 который представляет собой гибрид между генами 6/астх-м-2з и 6/ястх-м-22> и содержит в середине последовательности соге-сайт, в области которого, предположительно, произошла рекомбинация. Показано, что гены 6/астх-м локализованы преимущественно на высокомолекулярных плазмидах, имеющих гибридную природу и относящихся к группам несовместимости 1псР, 1псА/С, 1пс Ь/М, и др., специфичным для вида микроорганизма и кластера гена. В ходе работы разработан алгоритм ПЦР-ПДРФ-анализа генов ЫаСтх-м> позволяющий идентифицировать около половины генов до индивидуального гена, а остальные — в составе небольших подгрупп.
Установлено, что устойчивость штаммов к антибиотикам других функциональных классов (не бета-лактамам) в большой степени определяется наличием интегронов классов 1 и 2, которые присутствуют в геномах 38% изученных штаммов. Интегроны несут генные кассеты устойчивости к аминогликозидам, хлорамфениколу, эритромицину, сульфаниламидам и стрептотрицину. Кроме того, в геномах 23% энтеробактеров обнаружены детерминанты нового механизма устойчивости к хинолонам — плазмидно-кодируемых генов диг.
На основании проведенных исследований создан перечень генетических маркеров для ПЦР-детекции генов резистентности в штаммах энтеробактерий, включающий 48 позиций: 13 — к бета-лактамам, 7 — к аминогликозидам, 3 — к хинолонам, 5 — к сульфаниламидам, 4 — к другим антибактериальным препаратам.
