Клинико-биохимическое исследование биологически активных соединений Chelidonium majuus (чистотела большого)

Актуальность проблемы.

Одной из основных причин смертности в большинстве стран мира являются злокачественные новообразования. В общей структуре летальности они составляют до 15 — 20%. По данным ВОЗ заболеваемость различными опухолями колеблется от 150 до 400 случаев на 100 тыс. населения (Балаж А., 1987 г., Лемеш В. Mi', 1996 г.). В настоящее время достигнуты существенные успехи в химиотерапевтическом лечении опухолей (Kovala — Demertzi D., 2003 г.- Trevisan К., 2002 г). В настоящее время известно о 72 лекарственных растениях обладающих противоопухолевой активностью, например: аконит, календула, полынь, настой крапивы, и другие.

Как правило, такие растения содержат в своем составе алкалоиды: сангвинарин, бербирин, пальматин, способные взаимодействовать с ферментами и нуклеиновыми кислотами (Гудима С.О., 1994 г.). Несомненный интерес представляет Чистотел большой, экстракт которого обладает выраженной антибластомной активностью (Ьуршина С.Н., 1999 г.).

Однакоприменение лекарственных средств синтетического происхождения нередко приводит к побочным реакциям, вызывает интоксикацию организма (Трапезников Н.Н., 1992 г.). Лекарственные средства растительного происхождения имеют широкий спектр действия, менее токсичны, экономически более доступны-для больныхРастительные лекарственные средства можно применять длительно, т. к. не наступает эффекта их кумуляции в организме или привыкания/больных к подобным лекарственным препаратам (Kinura1 Т., 1992 г.).

Одним из перспективных источников, таких средств является надземнаячасть чистотела большого Ghelidonium majus L. Сем. Papaveraceae. Лекарственное сырье (трава) этого вида обладает многосторонней фармакологической активностью и применяется в научной и народной медицине как в России, так и за рубежом (Соколов С .Я, Замотаев И. П.,.

1993). Трава чистотела применяется при лечениимногих кожных заболеваний,. обладает противозудным, противовоспалительным, эпителизирующим, антимикробным, фунгистатическим, болеутоляющимдействием- (Крылов A.Av.Марченко' В.А., Максютина Н. П., Мамчур Ф. И-, 1991; Турова А. Д., Сапожникова Э. Н., 1983; Жоголев, Д.Т., Галин JI'.JL, Добросердова И. И., 1994). Заслуживает вниманияопыт использования травы чистотела. в> качестве противоопухолевого средства (Балицкий К.П., Воронцова, А. Л1,. 1976; Балицкий К. П., 1976): Экспериментально доказано, что препараты, чистотела задерживают рост злокачественных опухолей и могут использоватьсятакже Вдополнительной терапии злокачественных заболеваний^ оказывая противометастатическое действие- (Амосова Е.Н., Зуева Е. П-, Исаков В. Г. и др, 1991). Это действие очень, актуально, так как одной: из основных причин смертности! в большинстве стран мира являются злокачественные новообразования. В общейструктуре летальности они составляют до 15−20%. По данным ВОЗ заболеваемость различными опухолями колеблется от 150 до 400 случаев на 100 тыс. населения.

Столь. разнообразное1 медицинское применение травы чистотела^ обусловлено' богатым набором > биологически: активных веществ^ прежде всего алкалоидов, содержание которых в* сырье достигает 2,0% (Соколов С. Я, Замотаев И. П., 1993; Акопов И: Э., 1990; Беркало Л1А., 1990; Растительные ресурсы СССР., под ред. Федорова А. А., 1985), а также флавоноидов и аскорбиновой кислоты. На фоне: большой популярности растения: следует признать явно недостаточными использование в официальной российской медицине лишь одной лекарственной формы — настоятравы чистотела большого. Сырьевые запасы данного растения в Саратовской области представленыв большом объеме (Атлас ареалов: и ресурсов лекарственных растений СССР- 1983; Забалуев А. П., 2000; Эколого-ресурсный атлас, 1996; Энциклопедия Саратовского края, 2002). Алкалоидный состав чистотела, произрастающего в, вышеупомянутом регионе не изучался, тогда как существует достаточное количество литературыпо* исследованию качественного' и количественногосостава алкалоидов^ чистотела, большого^ из различных мест произрастания (БазукЕ.Н, Ловкова-М1Я, Сабйрова-Н!С., Булатов 1991i);

Следует отметить,., что=изучениевлиянияэкстракта чистотела* большого, на центральные клетки мишени- - нуклеиновыекислотыи плазмидные ДНК, а также исследования* тонких биохимическихпроцессов, инициируемых, биологически активными соединениями, которые содержатсяв- экстрактеЧистотела большого в настоящее время не производилось. Вышеизложенное позволило нам сформулировать цель и задачи настоящего исследования.

Целью настоящей работы является выделение алкалоидов из чистотела большого, произрастающего* в. Саратовской?- области, а также выяснение клинико-биохимических основ действияэкстракта чистотела большого на модельных системах in vivo и in vitro.

Задачи исследования.

1. Разработать наиболее оптимальныеметоды, экстрагирования биологическиактивных соединений из лекарственногорастения' чистотела большого.

2. Провести' хроматографическое разделение биологически активных соединений^ содержащихся в. экстракте .чистотела большого;

3: Изучитьбиохимические показатели' кровибелых беспородных мышей-самцов после введения им экстракта чистотела.

4. Исследовать, противоопухолевую! ицитотоксическую активность экстракта чистотела1 накультурах клеток.

5: Исследовать изменение активностидиагностического, фермента^ лактатдегидрогеназьь, in. vitro в крови доноров: в присутствии различных^ концентраций чистотела.

6. Изучить антибактериальноедействие чистотела на клетки Е. coli, выделенные от больных хроническимгпиелонефритом.

7. Изучить взаимодействие биологически активных соединений чистотелас нуклеиновыми кислотами и плазмидными ДНК, выделенными из бактериальных клеток Е. coli больных хроническим пиелонефритом.

Научная новизна.

Исследована биологическая активность соединений экстракта чистотела большого. Проведено исследование цитотоксичной и противоопухолевой активности экстракта чистотела. Изучено антибактериальное действие экстракта чистотела. Исследованы процессы взаимодействия биологически активных соединений: экстракта чистотела с нуклеиновыми кислотами. Определены дозы чистотела, вызывающие развитие повреждающих эффектов на ткани.

Практическая ценность.

Разработаны наиболее: оптимальные методы прямой экстракции биологически активных соединений из лекарственного растения чистотелабольшого.

Обнаружена антибактериальная и антибластомная активность экстракта чистотела большого.

Внедрение результатов исследования.

Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный, процесс на кафедрах биохимии, фармакологиии клинической фармакологии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ Росздрава».

Основные положения выносимые на защиту.

1. Экстрагирование биологически активных соединений чистотела лучше осуществлять вводные растворы, по сравнению с органическими растворителями;

2. Тонкослойная хроматография является равноценным методом наряду с колоночной хроматографией для выделения биологически активных соединений чистотела.

3. Экстракт чистотела оказывает биологический эффект на прокариотические, эукариотические клетки и многоклеточные организмы.

4. Алкалоиды чистотела взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами и плазмидными ДНК.

5. Экстракт чистотела изменяет активность диагностического фермента лактатдегидрогеназы.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на 65-й научно-практической конференции студентов и молодых специалистов СГМ: «Молодые ученые — здравоохранению региона» (Саратов, 2004).

Публикации.

По результатам проведенных исследований опубликовано 6 работ в центральной и местной печати.

Структура и объем диссертации

.

Диссертация изложена на 125 страницах, машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы и методов исследованиячетырех глав, отражающих результаты собственных исследованийзаключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 65 отечественных и 13 зарубежных источников.

116 Выводы.

1. Наиболее оптимальным методом экстракции биологически активных соединений из чистотела является водная экстракция, по сравнению с использованием органических растворителей.

2. Биологически активные вещества, выделяемые из чистотела большого (Chelidonium majus), произрастающего в г. Саратове, вероятнее всего относятся к алкалоидам, процентное содержание которых составляло примерно 1% от сухого остатка растения.

3. Присутствие алкалоида сангвинарина в экстракте чистотела большого подтверждено хроматографическими и спектральными методами исследования.

4. Обнаружено выраженное противоопухолевое действие экстракта чистотела. Установлено, что экстракт чистотела большого в разведении 1:10 от исходной концентрации вызывает уменьшение. числа клеток миеломы мышей линии Sp-2X в S-фазе митоза на 45%, а в разведениях 1:100 и 1:1 ООО достоверного ингибирования роста клеток миеломы в S-фазе митоза не выявлено. Определено, что изучаемый экстракт чистотела большого не оказывает токсического действия на спленоциты белых линейных мышей линии Balb-C во всех разведениях.

5. Антибактериальное действие экстракта чистотела, обнаружено в о концентрации 1(Г' М на бактериальные клетки Е. coli больного пиелонефритом.

6. Биохимические показатели плазмы крови белых беспородных мышей-самцов изменялись в основном в сторону увеличения. Практически не изменялась концентрация альбуминов и общего белка плазмы, крови у мышей. Выявлено, что экстракт чистотела большого вызывает дозозависимое нарушение функций печени (повышении активности АлАТ, АсАТ, ГГТ, ЩФ в плазме крови), почек (повышение содержания креатинина в плазме крови). Активность диагностического фермента лактатдегидрогеназы in vitro уменьшается в присутствии экстракта чистотела.

7. Алкалоиды чистотела взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами и плазмидными ДНК, выделенными из бактериальных клеток Е. coli больного пиелонефритом.

8. Предложен алгоритм использования экстракта чистотела для лечения больных хроническим пиелонефритом или циститом.

Практические рекомендации.

1. Целесообразно готовить раствор экстракта чистотела с использованием воды в качестве растворителя.

2. Обнаружено, что алкалоиды сангвинарин и хелеретрин, по всей видимости, обладают выраженной биологической активностью, присущей экстракту чистотела большого. :

3. Экстракт чистотела большого обладает антибактериальным, анти-бластомным и в меньшей степени выраженным цитотоксическим действием.

4. Раствор экстракта чистотела может применяться для лечения гнойничковых поражений кожи, хронических приелонефритов или обструктивных циститов.

5. При опухолях мочевого пузыря, возможно, наряду с другими лечебными мероприятиями применение экстракта чистотела.

6. Экстракт чистотела целесообразно применять или наружно или вводить в организм с применением катетера для минимизации процессов повреждения активными соединениями экстракта чистотела здоровых тканей организма.

1Ш.