Индуцированные теплом структурные и релаксационные переходы в ДНК с различной степенью гидратации

За последние почти пять десятилетий, с тех пор как была открыта двойная спираль ДНК, эта «самая главная» молекула стала несомненно уже неким символом молекулярной биологии. Она притягивает к себе взоры многих ученых. На помощь биологам пришли химики, математики и физики. Важную роль в расширении возможностей биологических исследований сыграло внедрение в практику рентгеноструктурного анализа, электронной микроскопии, инфракрасной и ультрафиолетовой спектрофотометрии, электрофореза и многих других физических методов. Среди них занимает видное место и метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии.

Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) является одним из наиболее прямых и информативных методов для изучения энергетических параметров структурных переходов в биополимерах и различных эффектов межмолекулярного взаимодействия. ДСК, представляя собой удачное сочетание дифференциального термического анализа и классической адиабатической калориметрии, обладает достаточной для решения широкого круга задач чувствительностью. К числу многих других достоинств ДСК относятся, безусловно, и широкая область рабочих температур, и достаточно высокая скорость получения первичной информации, и наличие разных термических режимов, включая большой диапазон скоростей нагревания, и возможность использования малых количеств исследуемых веществ. Изучение тепловых свойств биополимеров в растворах и в твердом состоянии (пленки, дегидратированные образцы) и, в частности, измерение их теплоемкости в широком интервале температур позволяет получить значения фундаментальных термодинамических параметров этих соединений и связать их с динамическими свойствами и с конформационными особенностями макромолекул.

Настоящая диссертационная работа посвящена изучению основных конформационных и релаксационных переходов таких, как денатурация, ренатурация, образование и плавление гелей, стеклование в системе ДНК 4 вода в широком диапазоне изменения содержания воды и температур методом ДСК. Отметим, что существующие к настоящему времени исследования ДНК сосредоточены, как правило, на изучении разбавленных растворов макромолекулы. В представленной же работе, напротив, одновременно в рамках единого эксперимента рассмотрены системы как с низкой влажностью, так и с высоким содержанием воды. При этом на основе полученных экспериментальных данных с единой точки зрения обсужден широкий круг проблем, связанных с ролью гидратного окружения в обеспечении стабильности спиральной структуры ДНК, ее динамического поведения и ряда других особенностей.

Изучение внутримолекулярных структурных переходов в важнейших биологических макромолекулах — нуклеиновых кислотах и белках, на протяжении многих лет остается одной из центральных задач молекулярной биофизики. В настоящее время установлено, что именно способность переходить из одного конформационного состояния в другое является важнейшим свойством биомакромолекул, в значительной степени определяющим их функционирование. В то же время, после утраты в результате денатурации своего уникального пространственного строения, целиком и полностью определяющего специфические биологические свойства биомакромолекул, такая макромолекула может рассматриваться как простая полимерная молекула и, следовательно, в целом изучение ее свойств, в частности, тепловых, представляет несомненный интерес не только для биофизики, но и для молекулярной физики и физики полимеров.

В настоящей работе большое внимание уделено рассмотрению влияния концентрации воды на тепловые свойства системы ДНК — вода в целом. Вопрос о роли воды в биологических системах и на сегодняшний день остается одним из самых актуальных, поскольку, как известно, водаважнейший компонент, входящий в состав всего живого и без которого невозможна жизнь. Так, например, полная утрата жиров и понижение наполовину содержания белков в организме в результате голодания не настолько опасны, как потеря 20% воды. Это объясняется тем, что вода в 5 организме выполняет важные и очень разнообразные функции. В качестве основного компонента вместе с другими соединениями она участвует в формировании единой внутриклеточной структуры и в значительной степени способна регулировать ее функциональную активность. Иными словами, нуклеиновые кислоты и вода образуют единую систему, которую нельзя разделить на отдельные компоненты без разрушения ее сущности.

В данной работе изучен нетипично широкий диапазон степеней гидратации ДНК — от практически сухого препарата (2% воды) до концентрированного раствора (90% воды). Особенное внимание при этом уделено системам с малыми степенями гидратации. Это обусловлено прежде всего тем, что биосистемы с малым содержанием воды имеют важное значение в связи с проблемой консервации жизни, т. е. сохранения способности обезвоженной ДНК к восстановлению нативной структуры при последующем растворении в воде. Известно, что и природные (семена, споры, грены), и лабораторные (лиофилизация, криоконсервация) способы сохранения генетического материала основаны на подавлении проявления биологических функций именно при дегидратации и связаны с изменением взаимодействия воды и биообъекта. Можно надеяться, что предпринятое нами ДСК — исследование процесса гидратации ДНК так же, как и закономерностей стабилизации ее структуры при изменении содержания воды, внесет свой вклад в дальнейшее решение задач, связанных с разработкой и выбором наиболее эффективных способов сохранения ДНК без утраты ею нативных свойств.

Основной целью представленной работы является проведение комплексного калориметрического исследования индуцированных теплом процессов разрушения как нативных, так и постденатурационных структур ДНК в зависимости от водного окружения в широком интервале температур, а также изменений теплоемкости системы и связанной с ней молекулярной подвижности ДНК при переходах из стеклообразного состояния в высокоэластическое при нагревании и из твердого состояния в раствор при гидратации.

В первых двух главах диссертации представлен обзор существующих данных о процессах гидратации, денатурации, ренатурации ДНК, преимущественно в разбавленных растворах, а также приведены базовые сведения о процессе стеклования — размягчения аморфных синтетических полимеров, и дана краткая характеристика используемого метода дифференциальной сканирующей калориметрии и условий проводимого эксперимента. Анализ имеющихся литературных данных показал, что, несмотря на обширный материал, накопленный к настоящему времени, проблема, связанная с пониманием механизмов стабилизации ДНК, до сих пор до конца нерешена. Ценную информацию о взаимодействиях, определяющих структуру и стабильность двухспиральных молекул ДНК, дает изучение процессов ее денатурации и ренатурации. Получение фундаментальных термодинамических параметров, характеризующих эти конформационные переходы в ДНК в широком интервале концентраций биополимера, на наш взгляд, представляется чрезвычайно актуальным, поскольку известно, что жизнеспособность клетки в существенной степени определяется устойчивостью генома к воздействию различных факторов окружающей среды. Этому вопросу посвящена глава 3 настоящей работы. В результате выполненного исследования впервые получена достаточно полная картина влияния степени гидратации на термостабильность молекулы ДНК. Наряду с этим подробное изучение денатурации и сопутствующих ей процессов позволило также впервые обнаружить обратимо плавящиеся постденатурационные структуры (молекулярные гели) в высококонцентрированных системах ДНК — вода.

Далее, биомакромолекулы, утратившие в результате денатурации свою уникальную пространственную структуру, обладают, как известно, рядом свойств, характерных для синтетических полимеров. Хорошо известно также, что аморфные синтетические полимеры могут существовать в стеклообразном состоянии, которое характеризуется отсутствием дальнего порядка в расположении звеньев полимерной цепи в пространстве. Стеклование — размягчение синтетических полимеров является хорошо 7 изученным явлением и этому процессу посвящен ряд монографий. Представление о биомакромолекулах в водном окружении как о системах, обладающих некоторыми свойствами стекла в интервале температур от 1 до 270 К, также развивалось ранее в целом ряде работ. Однако в них не шла речь об основной особенности этих биомакромолекул — об их способности переходить при повышении температуры из состояния стекла в так называемое высокоэластическое состояние в результате изменения молекулярной подвижности, свойственной только полимерам, а именно, за счет возникновения трансляционного движения сегментов макромолекул. В нашей лаборатории впервые сначала на примере фибриллярного белка коллагена, а затем и на глобулярных белках был изучен непосредственно сам процесс стеклования — размягчения. В представленной диссертации (глава 4) нам удалось экспериментально доказать, что при определенном содержании воды ДНК не только может находиться в состоянии стекла, но и при повышении температуры переходит из стеклообразного состояния в высокоэластическое, причем расстекловывание (размягчение) реализуется в случае ДНК при достаточно высоких температурах, от 0 до 150 °C в зависимости от степени ее гидратации. Изучение влияния на процесс стеклования — размягчения ДНК таких факторов, как содержание в системе воды, тепловой предыстории образца, скорости его нагревания и охлаждения ярко продемонстрировало общность ДНК с белками и аморфными синтетическими полимерами. В этой же главе также рассмотрен вопрос о том, как влияет прогревание до высоких температур на способность влажной ДНК к восстановлению своей нативной структуры при последующем растворении ее в воде, и какую роль при этом играет стеклообразное состояние ДНК. Несомненно, что полученные по этому вопросу сведения представляют большой интерес, поскольку имеют непосредственное отношение к одной из актуальных проблем современной биофизики — проблеме самоорганизации пространственной нативной структуры биомакромолекул, и наглядно демонстрируют тесную связь между термостабильностью ДНК, ее способностью находиться в стеклообразном 8 состоянии и степенью гидратации молекулы, а тем самым, и с исходной структурой ДНК. Обнаруженная связь, на наш взгляд, существенно расширяет сложившиеся к настоящему времени представления о «самой главной» из биомакромолекул.

И, наконец, предпринятое нами калориметрическое изучение изменения теплоемкости в процессе гидратации ДНК (глава 5) позволило впервые провести исследование суммарной теплоемкости системы ДНКвода в столь широком диапазоне влажностей и разделить вклады в нее собственно ДНК и воды, что, в свою очередь, дало возможность определить теплоемкость в состояниях, соответствующих хорошо установленным формам ДНК. Из полученных результатов был сделан важный вывод о том, что интерпретация данных по гидратации молекулы невозможна без учета такого фактора, как переход стеклования — размягчения.

Кроме того, систематическое исследование термодинамических параметров процесса фазового перехода лед — вода при наличии свободной воды в образце как в нативном, так и в денатурированном состояниях ДНК, с одной стороны, и изучение удельной теплоемкости воды во всем диапазоне изменения ее процентного содержания с целью оценки теплоемкости воды, связанной с биополимером, с другой, имеют, на наш взгляд, большое значение в связи с упоминавшейся выше проблемой консервации генетического материала.

Можно надеяться, что, в целом, проведенное в настоящей работе исследование будет способствовать дальнейшему развитию и углублению фундаментальных представлений о природе индуцируемых теплом структурных и релаксационных переходов в системах биополимер — вода и роли в них водного окружения.

Структура и объем диссертации

:

Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения и списка цитируемой литературы. Общий объем составляет 175 страниц, включая 49.

Основные выводы.

1. Изменение тепловых свойств ДНК в зависимости от ее водного окружения отражает известные границы существования макромолекулы как в неупорядоченной (0ч<20% воды), так и в различных упорядоченных формах (20ч-90% воды). При этом наблюдаемый одновременный рост и теплоты, и температуры денатурации в диапазоне концентраций воды от -20 до 50% непосредственно связан с процессом формирования упорядоченной (нативной) структуры ДНК.

2. Образующиеся постденатурационные структуры ДНК в присутствии свободной воды являются нативноподобными и представляют собой узлы пространственной сетки обратимо плавящегося молекулярного геля.

3. Денатурированная ДНК, также как и исходно нативная дегидратированная ДНК, подобно белкам и аморфным синтетическим полимерам, при определенном соотношении температуры и влажности способна претерпевать переход стеклование — размягчение, обладающий всеми основными признаками калориметрического проявления этого релаксационного процесса. Исходно нативная дегидратированная ДНК так же, как и денатурированная при влажностях 20% и ниже при комнатных температурах находятся в состоянии стекла.

4. Тот факт, что исходно нативная дегидратированная ДНК в неупорядоченной Р-форме продолжает находиться в состоянии стекла и при достаточно высоких температурах играет определяющую роль в сохранении ее нативных свойств после высокотемпературного прогревания.

5. Изменение теплоемкости ДНК при формировании гидратной оболочки носит нелинейный S-образный характер. При этом на полученных кривых могут быть отчетливо выделены участки теплоемкости и соответствующие им диапазоны концентрации воды, при которых существуют известные упорядоченные и неупорядоченное состояния ДНК. Переходу ДНК из неупорядоченного состояния в упорядоченную форму при гидратации соответствуют наиболее интенсивные изменения теплоемкости, связанные с процессом стеклования — размягчения. При этом теплоемкость ДНК в растворе превышает теплоемкость твердого состояния, по крайней мере, на величину скачка АСР при расстекловывании в процессе нагревания.

Заключение

.