Исследование активного центра и механизма действия пероксидазы с помощью функционально активных веществ

Для активной жизнедеятельности растениям и животным необходим кислород. Основное количество кислорода расходуется на выработку энергии и участие в окислительном метаболизме. Однако, небольшая его часть около 2% может переходить в активные формы кислорода (АФК): 02″, н202, НО-, НОС1 и др. (Ш>ш & а1., 1989). Для защиты от их разрушительного действия используются компоненты антиоксидантной системы, среди которых высокомолекулярные (СОД, каталаза, пероксидаза) и низкомолекулярные (аскорбиновая кислота, гидрохинон, стероиды, флавоноиды и др.) антиоксиданты.

Интенсивность аэробных процессов может быть оценена по активности пероксидазы, которая катализирует реакции оксидазного и пероксидазного окисления неорганических и органических соединений (Рогожин, Курилюк, 1998). Последними могут быть функционально активные вещества (ИУК, гидрохинон, аскорбиновая кислота, НАДН, фенотиазины), способные участвовать в оксидазных и пероксидазных реакциях, катализируемых пероксидазой. Среди этих веществ следует выделить антиоксиданты, которые способны подавлять образование свободных радикалов, понижая таким образом уровень ПОЛ в клетках живых организмов.

Таким образом, между пероксидазой и антиоксидантами должна наблюдаться взаимная зависимость, которая недостаточно изучена. Механизм действия пероксидазы в реакциях пероксидазного окисления достаточно сложен. Реакция инициируется перекисью водорода, в результате которой образуются окисленные формы фермента (Е1 и Е2).

Е + Н202 -> Е, Е! + АН2 Е2 + АН Е2 + АН2 -> Е + АН.

В восстановлении фермента участвуют соединения, являющиеся донорами водорода и донорами электронов.

Многообразие субстратов позволяет предположить, что в реакциях пероксидазного окисления могут реализовываться различные механизмы действия фермента. Все субстраты пероксидазы условно можно разделить на быстро и медленно окисляемые. К быстро окисляемым относят о-дианизидин, гидрохинон, фенолы и амины, а к медленно окисляемым ферроцианид калия, аскорбиновая кислота, НАДН и др. Исследование механизмов пероксидазного окисления органических соединений позволили высказать предположение, что перенос электронов, сопровождаемый переносом протонов происходит с участием функциональных групп белковой глобулы фермента. Показано, что в каталитическом процессе участвует один из остатков гистидина (Гис42). Выявлена функциональная группа с рК 6,5, депротонирование которой приводит к понижению скорости окисления одного из органических субстратов — о-дианизидина. Тогда как модификация трех поверхностных СООН-групп белка пероксидазы, не влияет на кинетические параметры окисления ферроцианида калия, но в 10 раз уменьшает константу скорости реакций Е1 с о-дианизидином, что свидетельствует об участии белковой глобулы пероксидазы в окислении органических субстратов. Таким образом, при пероксидазном окислении органических субстратов реализуется периферийные механизмы переноса электронов (Лебедева и др., 1996) и активный центр фермента в этом случае включает функциональные группы белка. Причины широкой субстратной специфичности пероксидазы объясняются тем, что на поверхности белка реализуются несколько различных каналов электронного транспорта с субстратов, контактирующих с поверхностью белковой глобулы на железо гема (Угарова и др., 1984).

В реакциях совместного окисления субстратов наблюдается активация или ингибирование окисления одного субстрата другим, а в реакциях совместного окисления быстро и медленно окисляемых субстратов, наблюдается активация медленно окисляемого субстрата и частичное или полное ингибирование превращения быстро окисляемого субстрата (Угарова и др., 1981).

В литературе приводятся данные об активации оксидазного окисления некоторых субстратов пероксидазы (НАДН и ИУЬС) в присутствие ряда фенолов (7еп е1 а1., 1971; 8а1китаг е1 а1., 1994; Ноп е1 а1, 1994). Отмечается, что механизмы субстрат-субстратной активации различаются для разных субстратов. Так, для р-крезола и аскорбиновой кислоты и люминола и замещенных фенолов методами спектроскопии ЭПР показано, что активация происходит за счет неферментативных процессов. Тогда как в реакции совместного окисления ферроцианида калия и о-дианизидина предложено, что частицей, эффективно окисляющей ферроцианид, является не свободный радикал о-дианизидина, комплекс пероксидазы с полу окисленным субстратом.

Поэтому механизмы совместного окисления соединений в присутствии пероксидазы во многом зависят от структуры субстратов и способны активно реализовываться в биогенных системах. Знание этих механизмов позволит расширить наши представления о функционировании сложных систем и позволит объяснить многие эффекты действия функционально активных веществ. Поэтому актуальность и значимость изучения строения активного центра пероксидазы и протекание механизмов пероксидазного окисления субстратов, реализуемых в реакциях индивидуального и совместного окисления позволили нам сформулировать цель и задачи данной работы.

Цель настоящего исследования — изучить строение активного центра, механизмы действия пероксидазы в реакциях совместного окисления субстратов и предложить возможности использования выявленных механизмов в биогенных системах.

В этой связи необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать влияние индолил-3 -уксусной кислоты на реакции пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты и выявить механизмы регуляторного действия.

2. Изучить механизмы действия индолил-3 -уксусной кислоты на пероксидазные реакции быстро окисляемых субстратов (о-дианизидин и гидрохинон) и проявить места связывания этих субстратов в области активного центра пероксидазы.

3. Исследовать реакции пероксидазного окисления фенотиазинов и предложить механизмы их участия в этих реакциях.

4. Изучить реакции совместного окисления фенотиазинов с о-дианизидином и выявить проявления их индивидуальных свойств в этих реакциях.

5. Установить роль строфантина в реакциях пероксидазного окисления фенотиазинов и о-дианизидина.

6. Выявить влияние аскорбиновой кислоты и сердечных гликозидов в прорастании семян и установить регуляторную роль пероксидазы в этом процессе.

Научная новизна. Исследования влияния ИУК на реакции пероксидазного окисления АК позволили установить, что ауксин ингибирует фермент по конкурентному типу при связывании в активном центре фермента одной молекулы аскорбиновой кислоты. Тогда как в реакциях пероксидазного окисления АК с участием двух и более молекул субстрата ИУК проявляла неконкурентный характер ингибирования. Предложено, что местом связывания АК в активном центре фермента является дистальная область. Изучение реакций совместного пероксидазного окисления о-дианизидина, гидрохинона и ферроцианида калия в присутствии индолил-3-уксусной кислоты позволило высказать предположение, что преимущественным местом связывания ИУК и о-дианизидина в активном центре пероксидазы является гидрофобная область. Тогда как для гидрохинона местом связывания является область на поверхности фермента, содержащая большее число полярных или заряженных аминокислотных остатков. Подтверждением различных мест связывания о-дианизидина и гидрохинона в активном центре пероксидазы служат данные по совместному пероксидазному окислению этих субстратов.

Впервые изучены пероксидазные реакции окисления фенотиазинов (аминазина, трифтазина и тиопроперазина). Показано, что они являются медленно окисляемыми субстратами пероксидазы. При совместном присутствии аминазина и ферроцианида калия, скорость пероксидазного окисления последнего возрастала за счет того, что аминазин связывался в активном центре пероксидазы вблизи места связывания молекулы ферроцианида, стабилизируя промежуточный комплекс фермента с ферроцианидом. Предложено, что при совместном окислении о-дианизидина и различных фенотиазинов, фермент реализует различные пути переноса электрона с окисляемого субстрата, выбор которых определяется доступностью функциональных групп субстрата каналам переноса электронов на поверхности белковой глобулы.

Установлено, что в реакциях индивидуального и совместного окисления в действии пероксидазы реализуются сложные регуляторные механизмы, обеспечивающие протекание каталитического процесса. Причем фермент, не проявляющий избирательность по отношению природы окисляемого субстрата в реакциях индивидуального окисления, приобретает избирательность в реакциях совместного окисления.

Практическая значимость работы. В результате исследований разработана научно-обоснованная программа по изучению механизмов пероксидазного окисления биологически активных веществ. Предложено, что выявленные эффекты влияния ИУК на пероксидазное окисление аскорбиновой кислоты, катализируемое пероксидазой, имеют важное биологическое значение. ИУК может регулировать пероксидазное окисление медленно окисляемого субстрата, имея специфичный участок связывания в составе дистального домена активного центра пероксидазы. По-видимому, избирательность типов ингибирования пероксидазы ИУК обусловлена специализированностью ауксина, служить оксидазным субстратом фермента. При этом ИУК может изменять направленность реакций пероксидазы с одного типа на другой, меняя специфичность фермента с пероксидазного на оксидазный, превращая пероксидазу в высокоспецифичную оксигеназу, генерирующую свободные радикалы, необходимость в которых может возникать у растений в процессе развития. При этом ИУК может выполнять роль «триггера» в реакциях окисления, катализируемых пероксидазой. Реализация действия ауксина, возможно, проявляется при выходе семян из состояния вынужденного покоя. В этот период в семенах резко возрастает активность пероксидазы, которая способна активировать процессы прорастания. Возможным механизмом действия фермента в этих процессах может быть его способность к генерированию свободных радикалов, необходимых на конечных этапах эмбриогенеза для активизации механизмов прорастания. Исследования механизмов пероксидазного окисления фенотиазинов позволило высказать предположения о возможных сроках нахождения фенотиазинов в организме человека, а также дать предположительную оценку эффективности их действия. Среди изученных фенотиазинов выраженное седативное действие трифтазина можно объяснить за счет того, что поскольку он в присутствии быстро окисляемого субстрата не окисляется пероксидазой, то он должен дольше сохранять свое функциональное действие. Быстрее всех в организме может окисляться аминазин и его действие должно быть за счет этого не продолжительным. Кроме этого обосновано действие фенотиазинов в присутствии строфантина в при их совместном использовании. Поскольку строфантин в ускоряет окисление тиопроперазина, то при их совместном введении пероксидазное окисление тиопроперазина будет возрастать, что приведет к образованию различных продуктов его окисления и к быстрой потере фармакологического действия. Тогда как пероксидазное окисление трифтазина и аминазина в присутствии строфантина О будет замедляться, обеспечивая, таким образом, пролонгированность действия вводимых препаратов.

Защищаемые положения. 1. В области активного центра фермента имеется обширная субстратсвязывающая площадка, в составе двух специализированных участков связывания субстратов, в действии которых принимают участие две функциональные группы с рК]~5,0 и рК2~6,5.

2. В действии пероксидазы заложены сложные регуляторные механизмы, позволяющие ферменту инициировать процесс пероксидазного окисления широкого спектра субстратов, а в механизмах совместного окисления использовать способы регулирования, ускоряя каталитический процесс за счет улучшения связывания окисляемого субстрата или с участием в окислении комплекса фермента с полуокисленным субтратом.

3. Пероксидаза и антиоксиданты (аскорбиновая кислота и стероидные гликозиды) принимают непосредственное участие в механизмах формирования гипобиотических состояний и ответственны за поддержание высокой жизнеспособности семян.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР Глава I. Строение пероксидазы.

Пероксидаза относится к двухкомпонентным ферментам, в составе которого гемин, представленный протопорфирином IX в комплексе с трехвалентным железом, и полипептидная цепь (рис.1). Последняя включает от 203 до 308 аминокислот, и в зависимости от природы изофермента, формирует компактную третичную структуру, представленную двумя доменами (большим и малым). [Welinder et al., 1972]. Фермент имеет размер белковой глобулы равный 50 A [Clementi, Palade, 1969], содержащий около 43% а-спиральных участков [Strickland, 1968]. Гемин нековалентно закреплен в углублении полипептидной цепи между доменами, и удерживается там за счет гидрофобных связей и.

Рис. 1. Схема формирования нативной структуры пероксидазы. солевого мостика, образованного между остатком пропионовой кислоты гемина с одной из аминогрупп апобелка [Угарова и др., 1981]. Гемин можно обратимо отделить от белка при кислых рН [Maehly, 1952]. Железо протопорфирина может находиться в высокоспиновом ?/55/2 или низкоспиновом d5y2 состояниях, образует четыре координационные связи с пиррольными атомами азота порфирина и одну координационную связь с функциональной группой апобелка [Угарова и др., 1981]. По данным ЯМР спектроскопии пятым аксиальным лигандом железа является имидазольная группа гистидинового остатка апобелка [Ishimaru, 1980; Teraoka, Katagauwa, 1981].

Располагаясь в гидрофобной полости апобелка, гемин ориентирован так, что его пропионовокислые остатки направлены к поверхности, а винильные группы протопорфирина обращены во внутреннюю часть белка [Угарова и др., 1981; Савицкий и др., 1977]. Планарная структура гемина предполагает его фиксацию внутри белка за счет я-электронных взаимодействий пиррольных колец протопорфирина с аминокислотными остатками, главным образом с остатком тирозина, фенилаланина, триптофана, гистидина и метионина. Используя замещенные гемины, с этерифицированными карбоксильными группами в 6 и 7 положениях, было показано, что реконструированные ферменты реагируют с перекисью водорода с образованием промежуточного соединения Е1 с теми же скоростями, как и нативная пероксидаза [Araiso et al., 1979; Araiso, Dunford, 1981]. Авторами было высказано предположение, что карбоксильные группы пропионовокислых остатков гемина не играют роли в образовании соединения Е1 пероксидазы. Однако в работе [DiNello, Dolphin, 1981] показано, что даже незначительные изменения структуры заместителей в 6 и 7 положениях резко уменьшает скорость связывания модифицированных геминов с апопероксидазой и активность реконструированных ферментов. По-видимому, пропионовокислые остатки гемина участвуют в его связывании с белком и важны для правильной ориентации тема на белке и поддержании активной нативной структуры фермента.

Комплексообразование апопероксидазы с гемином резко повышает устойчивость фермента к действию УФ-облучения и температуры. Удаление гемина приводит к потере пероксидазной активности, но не сказывается на ее оксидазной функции [Siegel, Galston, 1967].

Нативный фермент имеет в составе нейтральные и аминосахара в количестве до 20% общего веса [Shannon et al., 1966]. Молекулы Сахаров могут присоединяться только к пяти аминокислотным остаткам из тех двадцати, которые входят в состав полипептидной цепи [Sharon, 1974]. Углеводные цепи предохраняют фермент от инактивации радикалами, образующимися в ходе реакций, и увеличивают термическую стабильность пероксидазы. Удаление углеводов хотя и не влияет на каталитическую активность фермента, однако приводит к ускорению его инактивации в ходе реакции [Клячко, 1997].

В составе полипептидных цепей пероксидаз содержится от 6 до 8 SH-групп, которые связаны в 3−4 дисульфидные связи [Shin et al., 1971]. В состав молекулы пероксидазы включены два иона кальция, которые мало влияют на каталитическую активность, однако необходимы для поддержания высокой термической стабильности фермента [Haschke, Friedhoff, 1978;Ogawa et al., 1979].

Известно, что белки являются амфотерными полиэлектролитами, т. е. сочетают в себе кислотные и основные свойства. Кислотные свойства белку придают кислые аминокислоты (аспарагиновая, глутаминовая), а щелочные свойства — основные аминокислоты (лизин, аргинин, гистидин). Чем больше кислых аминокислот содержится в белке, тем ярче выражены его кислотные свойства, и чем больше входит в состав белков основных аминокислот, тем сильнее проявляются его основные свойства. Причем р1 каждого белка определяется соотношением кислых и основных групп боковых радикалов аминокислот: чем выше соотношение кислые/основные аминокислоты в белке, тем ниже его изоэлектрическая точка [Строев, 1986]. Нами проведена оценка содержания заряженных аминокислот в различных изоферментах (Аь В и С) пероксидазы (табл. 1). Видно, что в составе полипептидной цепи фермента содержится всего от 22 до 26% заряженных аминокислот. Таким образом, 3Л части полипептидной цепи пероксидазы представлены гидрофобными и незаряженными аминокислотами. Наличие высокой степени гидрофобности белковой молекулы позволяют предположить, что пероксидаза может являться мембранным ферментом, что и было доказано изучая каталитическую активность пероксидазы в системах обращенных мицелл, в том числе и АОТ [Клячко, 1990; Клячко и др., 1997]. В экспериментах использовались нативная и рекомбинантная пероксидазы. Последняя не содержала углеводных остатков на поверхности белковой молекулы. Показано, что.

Таблица 1. Состав аминокислот, входящих в первичную структуру изоферментов пероксидазы, и их некоторые физико-химические свойства [Delincee, Radola, 1970; Phelps et al., 1971; Shin et al., 1971; Welinder, Mazza, 1977; Welinder, 1979].

ИзоферВсего Аминокислоты (%) менты аминонепополярзаряженные Кислые пероккислот лярные / сидазы (%) ные всего положительно отрицательно Pi основные.

HRP-Ai 267 104 104 59 14 45 3,6−4,2 3,2.

100) (39) (39) (22) (5) (17).

HRP-B 300 129 92 79 29 50 8,7 1,7.

100) (43) (31) (26) (9) (17).

HRP-C 308 130 99 79 30 49 9,0 1,6.

100) (42) (32) (25) (Ю) (16) стабильность фермента зависит от степени гидратации ПАВ (w0=[H20]/[A0T]). В экспериментах использовались два подхода нековалентной модификации микросреды внутренней полости мицеллы. Во-первых, в водный буферный раствор, солюбилизируемый добавление 10%-ной глюкозы не приводило к изменению стабильности реконструированной пероксидазы при степени гидратации 10. Отсутствие стабилизирующего эффекта было объяснено тем, что размеры внутренней полости мицеллы и белка при этой степени гидратации совпадают и, по-видимому, вода вместе с растворенными в ней низкомолекулярными компонентами оказывается вытесненной из внутренней полости в район первых СН2-групп углеводородных остатков ПАВ.

Для реализации второго подхода были использованы ПАВ твин и спан, содержащие в своем составе сорбитовое кольцо.

Введение

1 мМ (1% относительно концентрации АОТ) спана 80 приводило к достижению стабильности, характерной для нативной пероксидазы хрена в тех же условиях [Клячко и др., 1997].

На основании полученных данных было высказано предположение, что повышение активности и стабилизирующий эффект нативной пероксидазы в растворах ПАВ [Левашов, 1987], по-видимому, обусловлены наличием на поверхности белковой глобулы фермента углеводных фрагментов, ковалентно связанных с белком, содержащих галактозу, глюкозу, арабинозу, фруктозу, глюкозамин, маннозу, ксилозу и фукозу [Klapper, Hackett, 1965; Андреева, 1988]. Эти углеводные фрагменты на поверхности белковой молекулы могут быть использовании при связывании пероксидазы с углеводами клеток. Так, показано сродство одной из пероксидаз — перонектина к фибронектину — одному из углеводсвязывающих белков — лектинов [Johansson, 1997]. При этом растительные пектинсвязывающие белки иммунохимически сходны с витронектином и некоторые из них являются пероксидазами. Кроме этого пероксидаза хрена способна связываться с поперечно сшитой агарозой [Lascu et al., 1986]. Выявлена высокая специфичность в связывании анионных пероксидаз корней пшеницы к хитину, полимеру N-ацетил-О-глюкозамина, входящего в состав клеточной стенки грибов, что может реализоваться в защитной роли этих изоформ пероксидазы в растениях при грибной инфекции [Максимов, 1994; Максимов и др., 1995].

Для полного понимания механизмов функционирования пероксидаз необходимо знание их пространственной структуры [Упоров, Егоров, 1997]. К настоящему времени методом рентгеноструктурного анализа (РСА) разрешены третичные структуры некоторых пероксидаз — цитохром С пероксидазы из дрожжей [Poulos et all., 1987], грибной пероксидазы [Kurishima et all., 1994], марганцевой пероксидазы [Sundaramoorthy et all., 1994], пероксидазы арахиса [Schuller et all., 1996]. Для изофермента С пероксидазы хрена также установлена пространственная третичная структура фермента методом РСА с разрешением около 2 A [Gajhede et al., 1996], однако координаты атомов этого белка до сих пор закрыты для пользователей. Поэтому построение модели активного центра пероксидазы хрена основано на гомологии с первичной последовательностью пероксидазы арахиса, имеющей высокую степень сходства в строении третичной структуры и координаты которой открыты для доступа. Причем степень идентичности аминокислотных последовательностей этих ферментов превышает 50%. Используя такую высокую гомологичность, в работе [Упоров, Егоров, 1997] построили модель пространственной структуры пероксидазы хрена, которая предполагает в основном такой же фолдинг, как и пероксидаза арахиса: 10 а-спиралей A-J (рис. 2). В спирализованные участки белковой молекулы входят аминокислотные остатки с номерами полипептидной цепи: А спираль — 14−28, В спираль -31−45, С спираль — 76−90 и D спираль — 92−112. Третичная структура фермента скрепляется четырьмя дисульфидными мостиками между.

Рис. 2. Кристаллическая структура пероксидазы арахиса [Schuller et al., 1998]. Показаны дистальные остатки His-42, Arg-38, Phe-41, проксимальный His-169, координирующий гем в активном центре пероксидазы, Phe-142, Phe-143 на входе в активный центр. аминокислотными остатками: 11−91, 44−49, 97−301 и 177−209, которые расположены внутри молекулы. Центры гликозилирования пероксидазы хрена расположены на поверхности белка и доступны для формирования комплекса с углеводами, которые включают аминокислотные последовательности состава Asp-X-Ser/Thr с номерами 13−15, 57−59, 158 160, 186−188, 198−200, 214−216, 255−257 и 268−270. Молекула пероксидазы содержит восемь олигосахаридных цепочек. Высказано предположение, 2+ что два иона Са, участвующие в стабилизации трехмерной структуры молекулы пероксидазы хрена, координируют с аминокислотными остатками (43, 46, 48, 50, 64) и (171, 222, 225, 228, 230) — в координации железа гемина (Phe-41, Phe-152, His-170, Leu-250) и в связывании ароматических субстратов (Не-180, Phe-221, Ile-244). Активный центр фермента представлен Arg-38, Phe-41, His-42. В дистальной области гемового кармана находятся две молекулы воды [Gajhede et al., 1996].

Одним из новых подходов к изучению линейных антигенных детерминант является антигенное картирование белков методом пептидного сканирования (PEPSCAN). Суть этого метода заключается в синтезе коротких перекрывающихся олигопептидов — фрагментов аминокислотной последовательности изучаемого белка и их тестирование с помощью иммуноферментного анализа на взаимодействие с поликлональными антителами [Аммосова и др., 1997]. Непрерывные или линейные антигенные детерминанты представляют собой непрерывный участок полипептидной цепи, и конформационные антигенные детерминанты состоят из аминокислот, но сближенных в пространстве и не обязательно связанных пептидной связью [Максютов, Загребельный, 1993].

Используя этот метод были определены линейные антигенные детерминанты изофермента С пероксидазы хрена (рис. 3) [Аммосова и др., 1997]. Показано, что линейные антигенные детерминанты фермента,.

Рис. 3. Схематический вид эпитопов НЯРС. Участки полипептидной цепи, входящие в эпитопы, представлены в виде затемненных сплошных лент. Также на рисунке изображены гем и аминокислотные остатки, входящие в активный центрионы кальция (в виде шариков) и дисульфидные связи (в виде цилиндров) [Аммосова и др., 1997]. некоторые из которых пространственно локализованы в регулярных элементах вторичной структуры a-спиралях, расположены как с наружи, так и внутри белковой глобулы. Часть эпитопов локализована в петлях и изгибах пептидной цепи пероксидазы, обладает «нерегулярной» конформацией. В составе полученных антигенных детерминант наиболее часто встречались десять аминокислот — Arg, Ser, Ala, Thr, Leu, lie, Val, Phe, Pro, Asn. В состав эпитопов входили заряженные аминокислоты Arg и Asp, неполярные аминокислоты Ala, Leu, lie, Val, Phe, Pro и Trp и незаряженные полярные аминокислоты — Asn, Thr, Ser, Gin, Туг, Gly (составляющие 13,4, 51,2 и 35,4% соответственно от общего состава детерминант). Таким образом, на поверхности белковой глобулы фермента, преимущественно располагаются гидрофобные аминокислотные остатки. Три из восьми пептидов, гликозилированные в нативной молекуле пероксидазы хрена (13−15, 198−200, 268−270), входили в состав эпитопов, остальные же гликозилированные аминокислотные остатки были расположены достаточно далеко от антигенных областей. Выявленные эпитопы содержали несколько функционально важных остатков: Arg-38, входящий в активный центр пероксидазы хрена и Phe-142, Phe-143, формирующих канал доступа ароматических субстратов к активному центру фермента. Большая часть аминокислотных остатков, участвующих в связывании кальция, в координации железа гемина и в образовании субстратсвязывающего участка, не входили в состав антигенных детерминант, согласуются с предположениями о том, что эти участки являются консервативными и стабильными структурами [Welinder, 1985], расположенными внутри белковой глобулы.

Используя методику ренатурации рекомбинантной пероксидазы хрена, были получены формы фермента с точечными мутациями F41H и Н143Е [Газарян и др., 1995]. При этом известно, что Phe-41 локализован между остатками дистальных His-40 и His-42. Последний координирует атом железа гемина в активном центре пероксидазы хрена. Тогда как, остаток Phe-143 расположен в проксимальной области гемина вблизи входа в гемсвязывающую полость и совместно с Phe-142, способен формировать субстратсвязывающий участок активного центра пероксидазы. Данные мутации приводили к падению удельной ферментативной активности более чем в 40 раз, с проявлением влияния на различные стадии каталитического механизма. Замена F41H вызывала понижение каталитической константы скорости по перекиси водорода на два порядка и на один порядок по АБТС. При окислении иодида мутация приводила к смене каталитического механизма. Тогда как замена НИЗЕ влияла преимущественно на стадию окисления АБТС и отщепление продукта его окисления. При этом в реакции окисления иодида данный мутант имел на порядок меньшие константы скорости как по перекиси водорода, так и по иодиду. На основании проведенных исследований высказаны предположения, что роль замещенных остатков фенилаланинов (Phe-41 и Phe-143) состоит в формировании гидрофобной полости, обеспечивающей прочное нековалентное связывание порфиринового цикла гемина [Газарян и др., 1995].

Таким образом, активный центр пероксидазы представляет область на поверхности белковой глобулы, расположенной с дистальной стороны гемина, образованной из спиралей А, В, С, D (рис. 4). Активную роль в каталитическом процессе пероксидазного окисления субстратов принимает участие Fe3+, координирующее с четырьмя атомами азотов пирролов протопорфирина, проксимальным лигандом которого является остаток имидазола гистидина белка (His-170). Шестым лигандом является молекула воды. В процессе восстановления перекиси водорода участвуют His-42 и Arg-38, расположенные в спирали В (Schuller et al., 1996; Gajede et all., 1996; Аммосова и др., 1997; Газарян и др., 1998).

Рис. 4. Модельная структура пероксидазы хрена. Показаны участки, структурно-сходные с ауксин-связывающими белками (серым цветом), ос-спирали А, В, С, О, Н и I, гем и остатокТгр-117 [Савицкий и др., 1998].

В координации гемина принимают участие остатки фенилаланинов (РЬе-41 и РЬе-143), роль которых заключается в формировании гидрофобного окружения нековалентносвязанного гемина и обеспечении его прочного встраивания в белковую глобулу [Газарян и др., 1995].

Субстратсвязывающая площадка для соединений органической природы представлена протяженной гидрофобной областью, включающей Аг§—38, РЬе-142, РЬе-143. Местом связывания для оксидазных субстратов пероксидазы, в частности ИУК, может быть дистальный субдомен, включающий спирали, А (целиком), В (середина), С (начало), Б (целиком) и переход спирали Э к Б' (Упоров, Егоров, 1997; Савицкий и др., 1998).

Выводы.

1. Используя ИУК было показано, что местом локализации участка связывания молекул аскорбиновой кислоты является дистальная область активного центра фермента, при связывании в которой двух и более молекул аскорбиновой кислоты наблюдается ускорение реакции пероксидазного окисления аскорбиновой кислоты, обусловленное кооперативными взаимодействиями между участками связывания этих двух молекул субстрата.

2. Изучение влияния ИУК на реакции окисления быстро окисляемых субстратов пероксидазы позволило выявить тип ингибирования, при котором связывание ИУК препятствует как связыванию, так и превращению о-дианизидина. Тогда как по отношению к гидрохинону ИУК и субстрат связываются в различных местах активного центра, что наблюдается вследствие удаленности мест связывания эффектора и субстрата.

3. Изучение реакций пероксидазного окисления фенотиазинов (хлорпромазина, тиопроперазина и трифтазина) позволило установить, что они являются медленно окисляемыми субстратами пероксидазы и их окисление перекисью, осуществляется по одноэлектронному механизму, аналогично окислению неорганических субстратов пероксидазы.

4. Исследование реакций совместного окисления о-дианизидина с различными фенотиазинами позволило установить, что фермент реализует различные пути переноса электрона с окисляемого субстрата, при этом среди изученных фенотиазинов, расположение функциональных групп хлорпромазина, обеспечивают его преимущественное пероксидазное окисление по сравнению с о-дианизидином.

5. В реакциях совместного окисления тиопроперазина и о-дианизидина установлен сложный регуляторный механизм, который обусловлен тем, что при рН 4,5−5,0 проявлялся антиконкурентный тип ингибирования, тогда как с возрастанием рН (рН>5,5), за счет депротонирования одной из функциональных групп активного центра фермента, происходило переключение механизма переноса электронов с донора водорода о-дианизидина, на преимущественное окисление донора электронов — тиопроперазин.

6. Исследование реакций пероксидазного окисления тиопроперазина, трифтазина, хлорпромазина и о-дианизидина в присутствии строфантина в позволило установить, что при кислых значениях рН строфантин в активирует пероксидазу в реакциях окисления тиопроперазина по бесконкурентному типу, а при окислении трифтазина, хлорпромазина и о-дианизидина проявлялись соответственно неконкурентный, конкурентный и антиконкурентный типы ингибирования.

7. Установлено, что пероксидаза необходима для сохранения жизнеспособности семян и при запуске процессов, связанных с их прорастанием, сопровождаемое интенсификацией аэробных биоэнергетических процессов, активацией оксидаз, включая пероксидазу, активность которой у непроросших семян, остающихся в покое, не изменяется, в то время как в прорастающих семенах наблюдается возрастание активности фермента.

8. Показано, что в непроросших семенах концентрация стероидных гликозидов всегда понижается, возрастая при активации ростовых процессов. Тогда как концентрация АК в покоящихся семенах всегда выше, чем у активно метаболизирующих. Это позволяет предположить о том, что АК необходима семенам для участия в метаболических процессах, а стероидные гликозиды являются их регуляторами.

Заключение

.

Исследование кинетики пероксидазных реакций позволило установить, что неспецифическое связывание субстратов различной природы может происходить в протяженной субстратсвязывающей области активного центра пероксидазы, расположенной на поверхности белковой глобулы фермента, в составе доменов которой присутствуют преимущественно гидрофобные аминокислотные остатки. Непосредственно в активном центре пероксидазы не проявляются аминокислотные остатки, содержащие БН-, ОН-, 1чГН2- и СООН-группы.

Большие размеры субстратсвязывающей области позволяют связываться в активном центре пероксидазы неорганическим и органическим соединениям, что проявляется в неизбирательности действия фермента по отношению к природе окисляемого субстрата в реакциях индивидуального окисления, на протекание которых могут оказывать влияние, присутствующие в среде активаторы или ингибиторы фермента. Так, например, изучение пероксидазных реакций окисления о-дианизидина и гидрохинона в присутствии индолил-3-уксусной кислоты позволило установить индивидуальные участки связывания этих субстратов и ингибитора в активном центре пероксидазы. Поскольку место связывания ИУК на поверхности белковой глобулы было изучено методом антигенного картирования [Аммосова и др., 1997].

В реакции окисления о-дианизидина в присутствии ИУК, проявляемый конкурентный тип ингибирования свидетельствовал о том, что о-дианизидин и индол ил-3-уксусная кислота связываются в одном и том же месте активного центра фермента. При этом связывание ИУК препятствовало как связыванию, так и превращению о-дианизидина. Тогда как по отношению к гидрохинону тип ингибирования несколько другой. ИУК и гидрохинон связывались в различных местах активного центра, однако, если индол ил-3-уксусная кислота связывалась на поверхности фермента, то дальнейшее превращение гидрохинона становилось невозможным. Это может наблюдаться вследствие удаленности мест связывания эффектора и субстрата или в результате конформационных изменений глобулы фермента при связывании ингибитора, или наличием регуляторного участка на поверхности белковой глобулы. Причем при рН 4,5−6,5 тип ингибирования ИУК пероксидазы в реакции окисления гидрохинона неконкурентный, однако при увеличении рН он меняется и становиться смешанным. При этом ухудшалось связывание субстрата, т. е. при наличии ИУК происходит понижение сродства гидрохинона к активному центру фермента. Однако, если все-таки гидрохинон связался в активном центре, то дальнейшее его превращение ухудшалось. Причем связывание ИУК с пероксидазой зависело от рН среды и природы субстрата. Субстраты, имеющие близкую с ИУК полярность, значительно повышали эффективность связывания ингибитора с пероксидазой. Поэтому преимущественным местом связывания ИУК и о-дианизидина в активном центре пероксидазы, по-видимому, должна быть гидрофобная область. Тогда как для гидрохинона местом связывания является область на поверхности фермента, содержащая большее число полярных или заряженных аминокислотных остатков. Подтверждением различных мест связывания о-дианизидина и гидрохинона в активном центре пероксидазы служат данные по совместному пероксидазному окислению этих субстратов.

Использование ИУК в качестве ингибитора реакций пероксидазного окисления АК, позволило определить место локализации участка связывания молекул аскорбиновой кислоты в активном центре пероксидазы. По-видимому, таким участком является дистальная область активного центра пероксидазы. Связывание ИУК в этой области при низких концентрациях субстрата создает конкуренцию за участок связывания, проявляемую в реакциях пероксидазного окисления АК, когда в активном центре фермента связывается по крайней мере одна молекула субстрата. При связывании двух и более молекул АК с пероксидазой наблюдается ускорение реакции окисления АК, что, возможно, вызвано кооперативными взаимодействиями между участками связывания этих двух молекул субстрата. Использование ИУК позволяет высказать предположение, что участки связывания молекул АК пространственно удалены, проявлением этого является неконкурентный характер ингибирования пероксидазы ИУК при окислении АК в присутствии второй молекулы субстрата. При этом связывание ИУК в активном центре пероксидазы создает препятствие для протекания реакции пероксидазного окисления АК. Однако ингибитор проявляет неконкурентный характер ингибирования при окислении двух и более молекул АК.

Сложность механизмов пероксидазного окисления органических субстратов, таких как о-дианизидин, гидрохинон, аскорбиновая кислота, фенотиазины и другие, позволяет предположить, что область активного центра пероксидазы разделена на несколько участков, где могут упорядоченно связываться окисляемые субстраты, и регуляторный участок, связывание в которым субстратов может регулировать протекание каталитического процесса. Последовательное связывание в этих участках субстратов, создает условия для управления ферментативным процессом, основанного на принципе корпоративного взаимодействия субстратов.

Наличие регуляторного участка на поверхности белковой глобулы фермента выявлено в исследованиях реакций совместного окисления аскорбиновой кислоты и ферроцианида калия, а также аскорбиновой кислоты и гидрохинона. Проведенное картирование активного центра пероксидазы на основании кинетических данных индивидуального и совместного окисления субстратов позволило выделить два разных участка в активном центре пероксидазы, связывание в которых субстратов обусловлено природой и индивидуальностью их строения. Особенно это проявляется в реакциях совместного окисления субстратов, при осуществлении которых утрачивается неизбирательность в действии фермента и приобретается специфичность выбора окисляемого субстрата, а также устанавливается упорядоченное окисление субстратов. Т. е. каждый из участвующих в реакции субстратов приобретает сродство к индивидуальному участку связывания в активном центре фермента, которые условно можно обозначить согласно природе связывающихся субстратов. Один участок связывания о-дианизидина, а другойгидрохинона. В о-дианизидиновом участке кроме о-дианизидина среди исследуемых нами субстратов могут связываться: хлорпромазин, ИУК, триптофан, строфантин G, аскорбиновая кислота, НАДН, амид III, салицилат натрия, а в гидрохиноновом участке — ферроцианид калия, трифтазин, тиопроперазин, дигоксин. Причем субстраты, связывающиеся в одном участке, могут конкурировать между собой за участок связывания, что проявляется в дифференцированном их окислении. При этом избирательность обусловливается природой субстрата и его сродством к участку связывания, доступностью электроннотранспортных путей к гемину.

Наличие обширной субстратсвязывающей области в активном центре пероксидазы, создает условия для связывания сразу нескольким молекулам субстратов одинаковых или разных по строению. При возможности только одному из них участвовать в каталитическом процессе. Тогда как действие другого субстрата проявляется в регулировании (активировании или ингибировании) ферментативной реакции. При этом реализуется принцип: один окисляется, а другой регулирует каталитический процесс. Причем разные по природе субстраты, связываются в различных участках активного центра фермента или в области расположения регуляторного участка.

Кроме того, нами установлено взаимное влияние пероксидазы и низкомолекулярных антиоксидантов при прорастании семян пшеницы. Показано, что пероксидаза активно участвует в формировании пусковых механизмов прорастания семян пшеницы. Поскольку в реакциях пероксидазного окисления различных субстратов, в том числе и антиоксидантов, могут образовываться свободные радикалы, способные ускорять процессы свободнорадикального окисления, инициирующие ПОЛ на начальных этапах прорастания семян пшеницы. Таким способом пероксидаза, являясь окислительно-восстановительным ферментом, по-видимому, осуществляет контроль за уровнем перекиси водорода и содержанием антиоксидантов в семенах и проростках пшеницы, а АО накапливаясь в тканях участвуют в реакциях подавления образования свободных радикалов, при этом их избыток может ингибировать фермент. Тогда как в процессе метаболизации антиоксидантов изменяется их концентрация, что может проявляться в регулировании активности пероксидазы и осуществлении общего контроля над деятельностью системы антиоксидантной защиты.