Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Изучение хитозанолитической активности папаина с целью получения олигомеров и низкомолекулярного хитозана

Диссертация: Изучение хитозанолитической активности папаина с целью получения олигомеров и низкомолекулярного хитозана
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Практическая значимость работы заключается в разработке научных основ технологии промышленного способа биодеструкции высокомолекулярного хитозана с использованием недорогого ферментного препарата растительного происхождения. Совокупность полученных научных результатов явилась основой для создания технологического процесса и выпуска опытных партий солей хитозана с различными прогнозируемыми… Читать ещё >

Изучение хитозанолитической активности папаина с целью получения олигомеров и низкомолекулярного хитозана (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
  • Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Хитин — природный биополимер
      • 1. 1. 2. Пространственная организация хитина
      • 1. 1. 3. Комплексы хитина с полисахаридами, пигментами, белками
    • 1. 2. Пути метаболизма хитина
      • 1. 2. 1. Ферменты биосинтеза хитина
      • 1. 2. 2. Ферменты деградации хитина
  • Ф 1.2.2.1. Хитиназы: распространение, классификация
    • 1. 2. 2. 2. Хитиндеацетилазы: многофункциональность действия
    • 1. 3. Хитозан: получение, основные характеристики
    • 1. 4. Получение олигосахаридов и низкомолекулярного хитозана
    • 1. 4. 1. Зависимость биологической активности хитозанов от молекулярной массы
    • 1. 4. 2. Биологические способы получения олигосахаридов и низкомолекулярного хитозана
    • 1. 4. 3. Ферменты деградации хитозана — хитозаназы
      • 1. 4. 3. 1. Классификация
      • 1. 4. 3. 2. Механизм катализа
      • 1. 4. 4. Ферменты других классов, способные к гидролизу хитозана
      • 1. 4. 5. Папаин — представитель обширной группы амидгидролаз 1.4.5.1. Место папаина в современной классификации. щ. 1.4.5.2. Специфичность и эффективность
      • 1. 4. 5. 3. Эстеразная активность
  • Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
    • 2. 1. Объекты исследований
    • 2. 2. Материалы исследований
    • 2. 3. Методы анализов
      • 2. 3. 1. Определение молекулярно-массовых характеристик исходного хитозана и продуктов его гидролиза
      • 2. 3. 2. Определение электронейтральных точек хитозанов
      • 2. 3. 3. ИК-фурье-спектроскопический анализ хитозана и продуктов его гидролиза папаином
      • 2. 3. 4. Измерение величины поверхностного натяжения солей хитозанов и его олигомеров
      • 2. 3. 5. Определение бактерицидности солей низкомолекулярного хитозана
  • Ф 2.3.6. Определение аминогрупп хитозана и количества кислоты методом потенциометрического титрования
    • 2. 3. 7. Колориметрическое определение концентрации продуктов гидролиза хитозана в растворе
    • 2. 3. 8. Определение белка
    • 2. 3. 9. Вискозиметрические методы определения хитозанолитической активности папаина
      • 2. 3. 9. 1. Определение оптимальной температуры гидролиза хитозана папаином
      • 2. 3. 9. 2. Определение оптимальной рН гидролиза хитозана папаином
      • 2. 3. 9. 3. Определение остаточной активности папаина при различных температурах
      • 2. 3. 9. 4. Определение основных кинетических параметров реакции
      • 2. 3. 10. Статистическая обработка данных
    • Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
  • 3. 1. Окислительная деструкция хитозана пероксидом водорода
  • 3. 2. Установление оптимальных условий гидролиза хитозана папаином
    • 3. 2. 1. Выбор концентрации ферментного препарата папаина
    • 3. 2. 2. Выбор оптимальной температуры проведения реакции гидролиза
    • 3. 2. 3. Выбор оптимального значения рН проведения реакции гидролиза
  • 3. 3. Особенности гидролиза хитозана папаином
    • 3. 3. 1. Влияние молекулярной массы и степени деацетилирования хитозана на скорость реакции гидролиза
    • 3. 3. 2. Влияние концентрации субстрата на скорость реакции гидролиза
  • Ф 3.3.3. Гидролиз хитозана ферментными препаратами различного происхождения
    • 3. 4. Молекулярно-массовые характеристики олигомеров и низкомолекулярного хитозана
      • 3. 4. 1. Влияние молекулярной массы хитозана на характеристики продуктов гидролиза
      • 3. 4. 2. Эффективное использование ферментного препарата папаина в умеренно концентрированных растворах хитозана
      • 3. 4. 3. Вискозиметрическое определение молекулярной массы олигомеров хитозана
    • 3. 5. Получение солей олигомеров и низкомолекулярного хитозана Ф 3.5.1. Получение низкомолекулярного хитозана в среде различных органических кислот
      • 3. 5. 2. Получение опытной партии солей низкомолекулярного хитозана
    • 3. 6. Области применения олигомеров и низкомолекулярного хитозана
      • 3. 6. 1. Бактерицидные свойства солевых форм низкомолекулярного хитозана
  • Ф 3.6.2. Поверхностноактивные свойства солей олигомеров и низкомолекулярного хитозана
  • выводы

    • Актуальность проблемы. Хитозан (поли-|3−1—>4−2-амино-2-дезокси-D-глкжопираноза) и его солевые формы в настоящее время являются перспективной основой для получения препаратов фармацевтического и косметического назначения, биологически активных добавок. Это обусловлено комплексом уникальных свойств, присущих данному полисахариду — способности к биодеструкции, гипоаллергенности, совместимости с тканями живых организмов, высокой хелатои комплексообразующей способности (Муццарелли, 2001; Alsaxra et. al., 2002; Ilium, 1998; Majety, Kumar, 2000; Prasitsilp et. al., 2000).

    Известно, что биологическая активность хитозана, его бактериостатические, иммуностимулирующие и другие полезные свойства зависят от молекулярных характеристик — молекулярной массы (ММ) и степени деацетилирования (СД). Клинически подтверждены гипохолестеринемический и гиполипидимический эффекты хитозана ММ (1,0 — 3,0)х105 (Муццарелли, 2001). Хитозан с ММ (1,0−5,0)х104 и его олигомеры (менее 104) обладают выраженным бактерицидным действием на ряд патогенных грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, способностью образовывать устойчивые комплексы с полианионами различной природы (в т. ч. и ДНК), гепатопротекторной и противоопухолевой активностью (Варламов, Ильина, 2005; Герасименко и др., 2004; S-J Kimet al., 1998).

    Для получения низкомолекулярного хитозана и его олигомеров применяют различные методы: химические (среди которых наиболее распространены гидролиз высокомолекулярного хитозана при помощи пероксида водорода и гидролиз высококонцентрированными кислотами) и биологические (ферментативные) (Новиков, 2003; Lu et. al., 2004; No et. al., 2003). В настоящее время внимание исследователей все больше акцентируется на ферментативной деструкции хитозана, что позволяет считать получаемые продукты более натуральными, нежели при химическом гидролизе, менее затрагивает исходную природную структуру полимеров и соответствует требованиям экологической безопасности производства. При производстве олигомеров и хитозана с низкими значениями ММ высокоэффективны хитозанолитические ферменты со специфической активностью — хитозаназы различного происхождения (Fucamizo et al., 1994). Вместе с этим, при всех преимуществах и перспективах применения препаратов хитозаназ, для них отмечается несколько серьезных недостатков: аллергенность для человеческого организма, высокая цена, неспособность эффективно работать при значениях рН <5,0. Расширение областей использования хитозанов с различной ММ делает актуальным использование коммерческих препаратов с неспецифической активностью (целлюлаз, липаз, амидгидролаз) для деполимеризации природного высокомолекулярного хитозана (Vishi Kumar et. al., 2004).

    Эффективность действия амидгидролазы растительного происхождения папаина (К.Ф. 3.4.22.2) на высокомолекулярный хитозан по сравнению с ферментами других групп (липазами, лизоцимом) была констатирована многими авторами (Grigolon et. al., 2001, Muzzarelli et. al., 2001), однако до сих пор остаются открытыми вопросы о механизмах гидролитического расщепления хитозана папаином, о выборе оптимальных условий проведения реакции, о влиянии характеристик субстрата (ММ и СД) на скорость гидролиза.

    Актуальность темы

    диссертации связана с выявлением особенностей гидролиза хитозана с использованием папаина, определением кинетических характеристик процесса, а также с разработкой научной основы для технологичного ферментативного способа получения олигомеров и хитозанов с низкими регулируемыми значениями ММ. Полученные результаты оказались чрезвычайно важны для организации промышленного производства солей олигомеров и хитозанов с ММ (2,5−3,2)х104.

    Цели и задачи работы. Целью данной работы явилось изучение хитозанолитической активности папаина в различных условиях для разработки эффективных методов получения олигомеров и хитозана с низкими регулируемыми значениями ММ. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи: изучение молекулярных характеристик продуктов, полученных в результате гидролиза хитозана пероксидом водорода в присутствии аскорбиновой кислоты, выяснение возможности и преимуществ использования папаина для гидролиза хитозана, выбор оптимальных условий проведения ферментативной реакции (температура, рН, концентрация субстрата), определение кинетических параметров реакции гидролиза (кт, Vmax), и выявление особенностей гидролиза хитозана папаином по сравнению с другими ферментными препаратами амидгидролаз и хитозаназ растительного и микробиологического происхождения,.

    — изучение влияния ММ и СД исходного хитозана на скорость ферментативной реакции и на молекулярные характеристики получаемых продуктов, исследование влияния органических кислот на характеристики получаемых продуктов гидролиза хитозана папаином: средневязкостную ММ, бактерицидность, поверхностно-активные свойства, изучение возможности создания технологического процесса получения различных солей хитозана с прогнозируемыми значениями ММ.

    Научная новизна и практическая значимость.

    — Методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС-Na доказана высокая чистота используемого препарата папаина и подтверждено, что гидролитическое расщепление полимерной цепи хитозана осуществляет папаин, а не хитозаназы примесей.

    Впервые методом ИК-фурье-спектроскопии доказана полная идентичность структуры исходного хитозана и продуктов, получаемых в результате гидролиза хитозана папаином в среде различных органических кислот.

    Гидролиз хитозана пероксидом водорода в окислительно-восстановительной системе с участием аскорбиновой кислоты является перспективным методом получения олигомеров и низкомолекулярного хитозана, поскольку также не приводит к изменению структуры основной цепи хитозана.

    Впервые установлено влияние СД и ММ исходного хитозана на скорость ферментативного гидролиза хитозана папаином и свойства получаемых продуктов: с увеличением СД возрастает значение Vmax, в то время как ММ субстрата практически не оказывает влияния на данный кинетический параметр и на km. Вместе с тем, величина ММ существенно сказывается на ММР продуктов ферментативного гидролиза.

    Наибольшее значение Vmax наблюдается при рН реакции (4,8 — 5,5), когда аминогруппы хитозана переходят в непротонированное состояние, а макромолекула не несет никакого заряда.

    Величина поверхностного натяжения растворов солей олигомеров хитозана зависит как от природы аниона остатка органической кислоты, так и от ММ олигомеров.

    Изученные соли низкомолекулярного хитозана обладают бактерицидной активностью в отношении ряда грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.

    — В работе предложен и реализован ферментативный метод получения олигомеров и хитозана с ММ (2,5−3,2)х104 с использованием папаина в водных растворах различных органических кислот и умеренной концентрацией субстрата (до 10 мае. %). Метод основан на дробном введении ферментного препарата в высоковязкостную среду реакции. Обнаружено, что при этом ММ и индекс полидисперсности получаемых продуктов несколько выше, чем при проведении реакции в растворах с концентрацией менее 3 мас.%.

    Практическая значимость работы заключается в разработке научных основ технологии промышленного способа биодеструкции высокомолекулярного хитозана с использованием недорогого ферментного препарата растительного происхождения. Совокупность полученных научных результатов явилась основой для создания технологического процесса и выпуска опытных партий солей хитозана с различными прогнозируемыми значениями ММ (2,5−3,2)х104. Отличительной особенностью данного метода гидролиза хитозана от уже существующих является использование амидгидролазы растительного происхожденияпапаина в умеренно концентрированных растворах хитозана (до 10 мас.%).

    Апробация работы. Основные результаты работы доложены на 8-й Международной конференции по химии и физико-химии олигомеров «0лигомеры-2002» (Черноголовка, 2002), на 7-й Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Санкт-Петербург, 2003), на 8−9-й Нижегородских сессиях молодых ученых (Нижний Новгород, 2003,2004), на 8-й Международной школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), на конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2005), на третьем съезде Общества биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова (Москва, 2005), на заседании Нижегородского отделения биохимического общества (Нижний Новгород, 2005).

    Публикации. По материалам диссертации опубликовано и направлено в печать 18 работ.

    Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 33 рисунка. Список цитируемой литературы включает 131 наименование.

    108 ВЫВОДЫ.

    1. Гидролиз хитозана в условиях окислительно-восстановительной системы пероксид водорода — аскорбиновая кислота не приводит к изменению групп основного звена полимерной цепи даже при использовании высоких концентраций пероксида водорода (до 0,9 мас.% в системе реакции). Увеличение концентрации пероксида водорода с 0,15 до 0,9 мас.% приводит к сужению индекса полидисперсности (с 47 до 8) и сдвигу ММ продуктов гидролиза в низкомолекулярную область (с 4,4×104 до 4, Зх103).

    2. Гидролитическое расщепление полимерной цепи хитозана осуществляет папаин, а не хитозаназы примесей. Оптимальные условия для ферментативной реакции гидролиза папаином хитозанов с различными значениями ММ и СД: 45 °C, рН 4,8−5,5, концентрация субстрата 0,05 — 0,19 моль/л. Установлено, что на оптимальные значения рН и концентрации субстрата влияют характеристики исходного хитозана (ММ и СД).

    3. Впервые установлено, что Vmax реакции гидролиза хитозана папаином при проведении ее в оптимальных условиях зависит от СД хитозана и практически не зависит от его ММ. Впервые показано, что уменьшение количества ацетильных групп в молекуле хитозана значительно снижает значения Vmax реакции гидролиза. Так, при увеличении СД с 76 до 96%, значение Vmax уменьшается с 37×10″ 4 до.

    4х10″ 4 моль гл. св./(лхмин). Влияния ММ и СД исследуемых хитозанов на значения кт не было установлено, однако достаточно высокие значения кт 2 2.

    9,0×10″ - 0,7×10″ моль/литр свидетельствуют о небольшой специфичности папаина к хитозанам.

    4. ММР продуктов гидролиза, получаемых при помощи папаина, зависит от молекулярных характеристик субстратов. С увеличением Mw и.

    М п исходных хитозанов у продуктов реакции гидролиза наблюдается уменьшение средних значений Мп (от 1,92×104 до 1,11×104), и увеличением^, /М «(от 1,7 до 4,8).

    5. Впервые установлено, что соли сукцинат и никотинат хитозана с ММ (2,5−3,2)х104 проявляют бактерицидное либо бактериостатическое действие, по отношению к Streptococcus salivarius, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli и Proteus vulgaris, в то время как аскорбат не обладает подобной активностью.

    6. Хитозан с ММ от 2,8×104 до 1,8×103 проявляет поверхностноактивные свойства. Величина снижения поверхностного натяжения растворов зависит от природы кислоты-растворителя и от ММ хитозана.

    7. Совокупность полученных теоретических результатов явилась основой для создания технологического процесса и выпуска опытных партий солей хитозана с различными прогнозируемыми значениями ММ (2,5−3,2)х104.

    Показать весь текст

    Список литературы

    1. Абрамзон, А А. Поверхностные явления и поверхностно-активные вещества. Справочник / Под ред. А. А. Абрамзона, Е. Д. Щукина. J0L: Химия, 1984.-392с.
    2. Г. Э. Выделение хитозаназы штамма Bacillus sp. / Г. Э. Актуганов, А. В. Широков, А. Н. Мелентьев // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. — Т.39, № 5. — С.536−541.
    3. С.А. Эффективность протеолитических ферментов / С. А. Александров // Биоорганическая химия. 1994. — Т.20, № 2. — С. 126 133.
    4. В.К. Химия протеолиза / В. К. Антонов. М.: Наука, 1991. -510с.
    5. Г. Е. Гидролиз сульфата хитозана ферментным комплексом из Streptomyces kurssanovii / Г. Е. Банникова, П. П. Суханова, Г. А. Вихорева и др. // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. -Т.38, № 5. — С.486−489.
    6. В.Ю. Анализ полимеризационных пластмасс / Под ред. В. Ю. Безуглого. JL: химия, 1967. — 512с.
    7. И.В. Практический курс химической и ферментативной кинетики / И. В. Березин, А. А. Клесов. М.: Изд-во Московского университета, 1976. — 326с.
    8. В.И. Методы экспериментальной микологии. Справочник / Под ред. В. И. Билай. Киев: Наукова Думка, 1982. — 310с.
    9. М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования / Под ред. М. О. Биргера. М.: Медицина, 1982. -464с.
    10. Д.В. Антибактериальная активность водорастворимых низкомолекулярных хитозанов в отношении различных микроорганизмов / Д. В. Герасименко, И. Д. Авдйенко, Г. Е. Банниковаи др. // Прикладная биохимия и микробиология 2004. — Т.40, № 3. -С.301−306.
    11. С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. М.: Практика, 1998.-459с.
    12. С.Н. Изучение хитина / С. Н. Данилов, Е. А. Плиско // Журнал общей химии. 1954. — Т.24. — С.1761−1768.
    13. О.В. Экологические и физиолого-биохимические аспекты процесса биодеструкции хитозана микроскопическими грибами. Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.16. / О. В. Дормидонтова. Н. Новгород, 2003. — 23с.
    14. О.В. Возможность получения водорастворимых олигомеров хитозана с помощью микромицетов / О. В. Дормидонтова, В. Ф. Смирнов, JI.A. Смирнова // Биотехнология. 2002. — № 6. — С.27−34.
    15. Е.А. Модификация «холодного» способа деацетилирования хитина / Е. А. Ежова // Материалы седьмой Международной конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». С.-Петербург: Изд-во ВНИРО, 2003. — С. 17−19.
    16. Ю.С. Разрушение полимеров под действием агрессивных сред / Ю. С. Зуев. М.: Химия, 1972. — 340с.
    17. А.В. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом целловиридин Г 20Х // А. В. Ильина, Ю. В. Ткачева, В. П. Варламов // Прикладная биохимия и микробиология -2002. Т.38, № 2. — С.132−135.
    18. А.В. Деполимеризация высокомолекулярного хитозана ферментным препаратом целловиридин Г 20Х / А. В. Ильина, Ю.В.
    19. , В.П. Варламов // Прикладная биохимия и микробиология. -2003. Т.39, № 3. — С.273−277.
    20. А.В. Полиэлектролитные комплексы на основе хитозана (обзор) / А. В. Ильина, В. П. Варламов // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. — Т.41, № 1. — С.9−16.
    21. В.А. Практикум по высокомолекулярным соединениям / Под ред. В. А. Кабанова. М.: Химия, 1985. — 224с.
    22. .А. Некоторые проблемы инноваций с хитозансодержащими фитопрепаратами и перспективы исследований / А. Б. Комаров, А. И. Албулов, К. А. Трескунов и др. // Бутлеровские сообщения. 2001. -№ 5. — С.38−41.
    23. .А. Способ получения водорастворимых форм хитозана. Комаров Б. А., Албулов А. И. Пат. № 22 15 749 С2 11.10.2003
    24. Н.К. Методы химии углеводов / Под ред. Н. К. Кочеткова. -М.: Мир, 1967.-580с.
    25. Г. А. Практическое руководство по энзимологии / Г. А. Кочетов. М.: Высшая школа, 1980. — 346 с.
    26. Кочкина 3. М. Влияние хитозана на фаговые инфекции / З. М. Кочкина, С. Н. Чирков // Материалы пятой Международной конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». М.: ВНИРО. -1999.-С.1511
    27. Г. Г. Адресная доставка функциональных генов в генотерапии с помощью углеводсодержащих векторов / Г. Г. Кривцов, Р. И. Жданов // Вопросы медицинской химии. 2000. — № 3. — С.24−31.
    28. Л.А. Протеолитические ферменты в регуляции биологических процессов / Л. А. Локшина // Биоорганическая химия. -1994. Т.20, № 2. — С.134−141.
    29. Р. Биохимия человека / Р. Марри, Д. Гриннер, П. Мейес, В. Родуэлл. Т.1. — М.: Мир, 1993. — 382с.
    30. Г. Диск-электрофорез / Г. Маурер. М.: Мир, 1971. — 247с.
    31. В.В. Протеолитические ферменты / В. В. Мосолов. М.: Наука, 1971.-321с.
    32. И.Р. О деструкции хитозана под действием пероксида водорода / И. Р. Муллагалиев, Ю. Б. Монаков, Г. Г. Галиаскарова // Доклады РАН. 1995. — Т.345, № 2. — С.199−204.
    33. И.Р. О деструкции хитозана под действиемперекиси водорода / И. Р. Муллагалиев, Ю. Б. Монаков, Г. Г. Галиаскарова // Доклады РАН 1995. — Т.345. № 2. — С.199−204
    34. К.Ю. Окислительная деструкция хитозана под действием гипохлорита натрия, пероксида водорода. Автореферат на соисканиеученой степени кандидата химических наук 02.00.04. физическая химия. — Уфа. — 2002
    35. К.Ю. Хемшпоминисценция, сопровождающая деструкцию хитозана в присутствии пероксида водорода в солянокислых растворах / Муринов К. Ю., Волошин А. И., Красногорская Н. Н" Соков Ю. Ф. // Известия Академии наук, серия химическая 2002. — № 1. -С.52−55
    36. Муццарелли Р.А. А. Хитозан per os. Нижний Новгород: Вектор-Тис, 2001.-370с.
    37. Нието Акоста О. М. Изучение хитина из скелетов лангустов Panulirus argus / Нието Акоста О. М., Энрикас Родригес Р. Д., Витовская Г. А., Блинов Н. П. // Прикладная биохимия и микробиология 1977. — № 13. — С.782−785
    38. С.Ю. Экспериментальные методы в адсорбции и молекулярной хроматографии / Под ред. С. Ю. Никитина, Р. С. Петровой. М.: Изд-во МГУ, 1990. — 315с.
    39. В.Ю. Деполимеризация хитозана под действием ферментов гепетопанкреаса камчатского краба Paralithodes camtschaticus / В. Ю. Новиков, В. А. Мухин // Прикладная биохимия и микробиология. -2003. Т.39, № 5. — С.530−535.
    40. В.Ю. Химический гидролиз хитина и хитозана // Материалы седьмой Международной конференции «Новые перспективы в исследовании хитина и хитозана». Санкт-Петербург: Изд-во ВНИРО, 2003. — С.38−43.
    41. JI.A. Получение хитозана и изучение его фракционного состава / JI.A. Нудьга, Е. А. Плиско, С. Н. Данилов // Журнал общей химии. 1973. — Т.43. — С.2555−2558.
    42. JI.A. Реологические свойства и надмолекулярная организация умеренно концентрированных растворов хитозана в уксусной кислоте в зависимости от рН / Нудьга JI.A., Бочек A.M., Каллистов О. В.,
    43. С.А., Петропавловский Г. А. // Журнал прикладной химии 1993. — Т.66, Вып. 1. — С. 198−202.
    44. Остерман J1.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование / JI.A. Остерман. М.: Наука, 1981.-286с.
    45. Н.А. Макромолекулярные реакции / Н. А. Платэ, А. Д. Литманович, А. В. Ноа. М.: химия, 1977. — 247с.
    46. Е.А. Хитин и его химические превращения / Е. А. Плиско, JI.A. Нудьга, С. Н. Данилов // Успехи химии. 1977. — T. XLVI, Вып. 8. -С.1470−1487.
    47. Н.А. Биометрия / Н. А. Плохинский. М.: Изд-во МГУ, 1970.-367с.
    48. Н.В. Конформационные характеристики молекул хитозана по данным диффузионно-седиментационного анализа и вискозиметрии / Погодина Н. В., Павлов Г. М., Бушин С. В. и др. // Высокомолекулярные соединения. 1986. — Т.28,№ 2. — С.232−239.
    49. С.Р. Методы определения молекулярных весов и полидисперсности высокомолекулярных соединений. Рафиков С. Р., Павлова С. А., Твердохлебова И. И. М.: Изд-во АН СССР, 1963. -462с.
    50. Р. Спектрофотометрическая идентификация органических соединений / Р. Сильверстейн, Г. Басслер, Т. Моррил. -М.: Мир, 1977.-590с.
    51. Е.Е. Полиэлектролитные комплексы на основе хитозана / Скорикова Е. Е., Вихорева Г. А., Калюжная Р. И., Зезин А. Б., Гальбрайх
    52. Л.С., Кабанов В. А. // Высокомолекулярные соединения, серия, А -1988. Т. ХХХ, № 1. — С. 18−24.
    53. К.Г. Хитин и хитозан. Свойства, получение, применение / Под ред. К. Г. Скрябина, В. П. Варламова, Г. А. Вихоревой. М.: Наука, 2002. — 368с.
    54. И.И. Конформация макромолекул (вискозиметрический метод оценки). М.: Химия, 1981. 284с.
    55. Е.П. Клеточная стенка грибов / Е. П. Феофилова. М.: Наука, 1983.-258с.
    56. Е.П. О действии димилина на образование каротина Blakeslea trispora / Феофилова Е. П., Ушанова Е. А., Иванова Г. Б. // Микробиология. Вып.51. — С.267−272
    57. Е.П. Физико-химические свойства хитина крабов и некоторых микроскопических грибов / Феофилова Е. П., Терешина В. М., Иванова И. Н., Генин Я. В., Гопенгауз Ф. Л. // Прикладная биохимия и микробиология 1980. — № 16. — С.377−382
    58. Д.А. Курс коллоидной химии / Д. А. Фридрихсберг. -Л.: Химия, 1984.-368с.
    59. Ю.Г. Курс коллоидной химии / Ю. Г. Фролов. М.: химия, 1982.-400с.
    60. Н.Н. Практикум по коллоидной химии / Н. Н. Цюрупа. М.: Высшая школа, 1963. — 278с.
    61. В.Н. Хитозан вещество XXI века. Есть ли у него будущее в России? / Чернецкий В. Н., Нифатьев Н. Э. // Российский химический журнал им. Менделеева. — 1997. — T. XLI, № 1. — С.80−83.
    62. С.Н. Противовирусная активность хитозана / С. Н. Чирков // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. — Т.38, № 1. — С.5−13.
    63. В.А. Кинетика ферментативного катализа. М.: Наука, 1965. -265с.
    64. A.I. / Molecular weight and degree of deacetylation effects on lipase-loaded chitosan bead characteristics // Alsarra A. I, Betigeri S.S., Zhang H., Evans B.A., Neau H.S. Biomaterials. 2002. — № 23. — P. 36 373 644.
    65. A. / Primary structure of chitosanase produced by Bacillus circulans MH-K1. Ando A., Noguchi K., Yanagi M., Shinoyama H., Kagawa Y., Hirata H., Yabuki M., Fujii T. Journal of General and Applied Microbiology. 1992. — № 38. — P. 135−144
    66. C.Y. / An Aspergillus chitosanase with potential for large-scale preparation of chitosan oligosaccharides. Cheng C.Y., Li Y-K // Biotechnology and Applied Biochemistry. 2000. — № 32. — P. 197−203.
    67. Cheng C-Y. // An Aspergillus chitosanase with potential for large-scale preparation of chitosan oligosaccharides // Cheng C-Y, Li Y-K. BiotechnologyApplay Biochemistry. 2000. — Vol. 32. — P. 197 — 203.
    68. D.M. / Purification and mode of action of a chitosanase from Penicillium islandicum // Fenton D.M., Eveleigh D.E. Journal of General Microbiology. 1981. — № 126. — P. 151−165.
    69. Fu J.Y. / Characterization of three chitosanase isozymes isolated from a commercial crude porcine pepsin preparation // Fu J.Y., Wu S.H., Chang S.T., Sung H.Y. Journal agriculture food chemistry. 2003. -Vol. 51, № 4. -P. 1042−1048.
    70. T. / Chitinous components of the cell wall of Fusarium oxysporum// Fukamizo Т., Ohkawa Т., Sonoda K., Toyoda H., Nishiguchi Т., Ouchi S., Goto S. Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 1992.- № 56. P. 1632−1636
    71. T. / Reaction mechanism of chitosanase from Streptomyces sp. N174 // Fukamizo Т., Honda Y., Goto S., Boucher I., Brzezinski R. Biochemical Journal. 1995. — № 311. — P. 377−383.
    72. T. / Specificity of chitosanase from Bacillus pumilus // Fukamizo Т., Ohkawa Т., Ikeda Y., Goto S. Biochimica et Biophysica Acta 1994. -№ 1205.-P. 183−188.
    73. L.B. / Modification of chitosan with free and immobilized papaine // Grigolon L.B., Azevedo A., Santos R.R., Franco T.T. In Chitin Enzymology Atec, Italy: 2001. — P. 63 — 71.
    74. B. / Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases // Henrissat В., Bairoch A. Biochemical Journal. 1996. -№ 316. P. 695−696.
    75. Hu Zhang / Preparation of Chitooligosaccharides from Chitosan by a Complex Enzyme // Hu Zhang, Yuguang Du, Xingju Yu, Masaru Mitsutomi, Sei-ichi Aiba. Carbohydrate Research. -1999. № 320. — P. 257- 260.
    76. Т.Н. / Purification and characterization of hydrolase with chitinase and chitosanase activity from commercial stem bromelain // Hung Т.Н., Chang Y.M., Sung H.Y., Chens C.T. Journal Agriculture food chemistry. -2002. Vol. 50, № 16. — P. 4666 — 4673.
    77. L. / Chitosan and its use as a pharmaceutical excipient // Ilium L. Pharmaceutical Research. 1998. — Vol. 15, № 9. p. 1326−1331.
    78. M. / Action pattern of Bacillus sp. No. 7-M chitosanase on partially N-acetylated chitosan // Izume M., Nagae S., Kawagishi H., Mitsutomi M., Ohtakara A. Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 1992. — № 56. -P. 448−453.
    79. I. / Deacetylation of chitin in two-stage chemical and enzymatic process // Kolodziejska I., Wojtasz Pajak A., Ogonowska G., Sikorski Z. Bulletin of the sea fisheries institute. — 2000. — Vol. 150, № 2. -P. 15−24.
    80. G. / Enzymatic gelation of the natural polymer chitosan // Kumar G., Bristow J.F., Smth P. S., Payne G.F. Polymer. 2000. — № 41.- P. 21 572 168.
    81. Lee M. / Water-soluble and low molecular weight chitosan-based plasmid DNA delivery // Lee M., Nah J-W, Kwon Y., Koh J.J., Ко K.S., Kim S.W. Pharmaceutical Research. 2001. — Vol.18, № 4. — P. 427−431.
    82. Lowry O.N., Rosenbrough N.J., Tarr A.L., Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem.-1951.-V. 193 ,№ 1 .-P.265−275.
    83. Lu S. // Preparation of water-soluble chitosan / Lu S., Song X., Cao D., Chen Y., Yao K. // Journal of applied Polymer Science. 2004 — Vol. 91, № 6.-P. 3497−3503.
    84. Lu Z. / Analysis of 94 kb of the Chlorella virus PBCV-1 330-kb genome: map positions 88 to 182 // Lu Z., II Y., Que Q., Kutish G.F., Rock D.L., Van Etten J.L. Virology. 1996. — № 216. — P. 102−123.
    85. N.V. / A review of chitin and chitosan applications // Majeti N.V., Kumar R. Reactive and functional polymers. 2000. — № 46. — P. 2−27.
    86. E.M. / X-ray structure of an anti-fungal chitosanase from Streptomyces N174 // Marcotte E.M., Monzingo A.F., Ernst S.R., Brzezinski R., Robertas J.D. Nature Structural Biology. 1996. — № 3. — P. 155−162.
    87. Masson J.-Y. / A new chitosanase gene from a Nocardioides sp. is a third member of glycosyl hydrolase family 46 // Masson J.-Y., Boucher I., Neugebauer W.A., Ramotar D., Brzezinski R. Microbiology 1995. -№ 141.-P. 2629−2635.
    88. Masson J-Y. / Primary sequence of the chitosanase gene from Streptomyces N174 and comparison with other endoglycosidases // Masson J-Y., Denis F., Brzezinski R. Gene 1994. — № 140. — P. 103−107.
    89. S. / Highly deacetylated chitosan and its properties. // Mima S., Mima H., Iwamoto R., Yoshikawa S. Journal of Applied Polymer Science. 1983. — Vol. 28, № 6. — P. 1909−1917.
    90. M. / Action of chitosanase on partially N-acetylated chitosan // Mitsutomi M., Kidoh H., Ando A. Chitin and Chitosan Research. 1995. -№ 1.-P. 132−133.
    91. M. / The action of Bacillus circulans WL-12 chitinases on partially N-acetylated chitosan // Mitsutomi M., Kidoh H., Tomita H., Watanabe T. Bioscience Biotechnology and Biochemistry. 1995. — № 59. -P. 529−531.
    92. Muzzarelli R.A.A. / Depolymerization of chitosan and substituted chitosans with the aid of a wheat germ lipase preparation // Muzzarelli R.A.A., Xia W., Tomasetti M., Ilari P. Enzyme and Microbial Technology. 1995. -№ 17. P.541−545.
    93. Muzzarelli R.A.A. / Partial depolemerization of chitosans with the aid of papaine // Muzzarelli R.A.A., Terbojevich M., Muzzarelli C., Miliani M., Francescangeli O. In Chitin Enzymology. Atec, Italy: 2001. P. 63 — 71.
    94. Muzzarelli R.A.A. Advances in N-acetyl-beta-D-glucosaminidases. Chitin Enzymology (R.A.A. Muzzarelli, editor) European Chitin Society, Ancona: 1993, P. 357−373.
    95. F. / Purification and characterization of an exo-beta-D-glucosaminidase, a novel type of enzyme, from Nocardia orientalis // Nanjo F., Katsumi R., Sakai K. Journal of Biological Chemistry. 1990. — № 265 -P. 10 088−10 094.
    96. K. / Adjuvant activity of chitinderivatives in mice and guinea pigs // Nishimura K., Nishimura S., Nishi N. Vaccine. — 1985. — Vol.3, № 5.-P. 375−383.
    97. K. / Immunological activity of chitin and its derivatives // Nishimura K., Nishimura S., Nishi N. Vaccine. -1994. — Vol 2, № 1. — P. 93−99.
    98. K. / Macrophage activation with multi-porous beadspreparad from partially deacetylated chitin // Nishimura K., Nishimura S., Seo H. J. Biomedical Materials Research. 1986. — Vol 20, № 9. — P. 1359 — 13 721.
    99. No H.K. / Effect of time-temperature treatment parameters on depolymerization of chitosan. // No H.K., Nah J.W., Meyers S.P. Journal of Applied Polymer Science. 2003. — Vol 87, № 12. — P. 1890−1894
    100. Nwe N. / Production of fungal chitosan by solid substrate fermentation followed by enzymatic extraction // Nwe N, Stevens W.F. Biotechnology Letters. 2002. — № 24. — P. 131 — 134.
    101. T. / A modular family 19 chitinase found in the prokaryotic organism Streptomyces griseus HUT 6037 // Ohno Т., Armand S., Hata Т., Nikaidou
    102. N., Henrissat В., Mitsutomi M., Watanabe T. Journal of Bacteriology. -1996. № 178. — P. 5065−5070.
    103. M. / Cellular responces to chitosan in vitro: the importance of deacetylation // Prasitsilp M., Jenwithisuk R., Kongsuwan K., Damrongchai N., Watts P. Journal of materials science: materials in medicine. 2000. -№ 11.-P. 773−778.
    104. K. / Purification and hydrolytic action of a chitosanase from Nocardia orientalis // Sakai K., Katsumi R., Isobe A., Nanjo F. Biochimica et Biophysica Acta. 1991. — № 1079. — P. 65−72.
    105. Se-Jae Kim / Effects of chitooligosaccharides on liver function in the mouse // Se-Jae Kim, So-Young Kang, Seung-Lim Park, Taekyum Shin and Young Hwan Ко. Korean J. Food Sci. Technol. 1998. — Vol. 30, № 3. — P. 693−696.
    106. , M. / Cloning and characterization of a chitosanase gene from the plant pathogenic fungus Fusarium solani // Shimosaka M., Kumehara M., Zhang X.-Y., Nogawa M., Okazaki M. Journal of Fermentation and Bioengineering. 1996. — № 82. — P.426−431.
    107. B.T. / Sequence specificities for lysozyme depolymerization of partially N-acetylated chitosans // Stokke, B.T., Varum, K.M., Holme, H.K., Hjerde, R.J.N., Smidsrod, O. Canadian Journal of Chemistry. 1995. -№ 73.-P. 1972−1981.
    108. H. / The confirmation study of chitin and chitosan oligomers in solution. // Sugiyama H, Hisamichi K., Sakai K., Usui Т., Ishiyama J. I., Kudo H., Ito H., Senda Y. Dioorganic and medicinal chemistry. — 2001. -№ 9.-P. 11−216.
    109. A. / On the influence of deacetylation process on the physicochemical characteristics of chitosan from squid chitin. // Tolaimate A., Desbrieres J., Rhazi M., Alagui A., VincendomM., Vottero P. Polymer. 2000.-№ 41. — P. 2463−2469.
    110. H. / A common molecular signature unifies the chitosanases belonging to families 46 and 80 of glycoside hydrolases // Tremblay H., Blanchard J., Brzezinski R. Canadian Journal of Microbiology. 2000. -№ 46.-P. 952−955.
    111. Vishu Kumar A.B. / Low molecular weight chitosans: preparation with the aid of papain and characterization. // Vishu Kumar A.B., Varodaraj M.C., Lalitha R.G., Tharanathan R.N. Biochemical Biophysiology Acta. 2004. -№ 1670. — P.137−146
    112. Vishu Kumar A.B. / Non-specific depolymerization of chitosan by pronase and characterization of the resultant products // Vishu Kumar A.B., Gowda L.R., Tharanathan R.N. European journal Biochemistry. 2004. — № 271. -P. 713−723.
    113. K.M. / Determination of enzymatic hydrolysis specificity of partially N-acetylated chitosans // Varum K.M., Holme H.K., Izume M.,
    114. Stokke B.T., Smidsrod О. Biochimica et Biophysica Acta. 1996. -№ 1291.-P. 5−15.
    115. W. / Determination of the Mark-Houwin K. equation for chitosan with different degrees of deacetylation. / Wang W., Bo S.Q., Li S.Q., Qin W. / Internetional Journal Biological Macromolecular. -1991.-№ 1315.-P. 281 -285.
    116. T. / Alternative expression of a chitosanase gene produces two different proteins in cells infected with Chlorella virus CVK2 // Yamada Т., Hiramatsu S., Songsri P., Fujie M. Virology. 1997. — № 230. — P. 361−368.
    117. H. / Preparation of chitosanoligosaccharides from chitosan by a complex enzyme // Zhang H., Du Y., Yu X., Mitsutomi M., Aiba S. Carbohydrate Research. 1999. — Vol. 320. — P. 257 — 260.
    118. H. / In vitro degradation of chitosan by a commercial enzyme preparation: effect of molecular weight and degree of deacetylation / Zhang H., Neau S.H. // Biomaterials 2001. — № 22. — P. 653 — 1658.
    Заполнить форму текущей работой

    Сессия? Спокойно!