Изучение полиморфизма отдельных регуляторных белков, функционирующих в эпителиальных и мышечных клетках человека в норме и при раке простаты

Актуальность темы

.

В биохимических исследованиях белков традиционно в особые группы объединяют различные макромолекулы, выполняющие сложные регуляторные функции, в том числе связанные с клеточной пролиферацией, апоптозом, ростом и развитием [Culig Z. et al., 1996; Zinkel S. et al., 2006]. Изучение свойств и особенностей функционирования таких белков-регуляторов, а также кодирующих их генов, часть из которых относится к онкогенам, усилилось в постгеномную эру в связи необходимостью выяснения молекулярных основ возникновения различных злокачественных опухолей, в частности, рака предстательной железы (РПЖ) [Yu Н., Rohan Т., 2000; Peltonen L., McKusick V.A., 2001; Bidosee М. et al., 2009; Turner N., Grose R., 2010].

РПЖ является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин. Согласно статистике, в 2009 г. в США РПЖ занимал лидирующее значение по количеству выявленных случаев заболевания и второе место по количеству летальных случаев [Jemal А. et al., 2009]. В России РПЖ находится на 4-м месте в структуре онкологической заболеваемости мужчин [Чиссов В.И. с соавт., 2008]. Более того, за период с 1998 по 2008 гг. отмечается значительный рост заболеваемости РПЖ, составляющий в странах Запада в среднем 3% за год [Boyle Р. et al. 1996], а по оценкам, сделанным в нашей стране — более 7% в год [Чиссов В.И. с соавт., 2008]. Широкая распространенность РПЖ, вариабельность клинических симптомов и высокий процент летальности больных РПЖ во многом определяют пристальное внимание к этому заболеванию не только онкологов, но и биохимиков, молекулярных биологов, а также специалистов других биологических дисциплин.

Хотя к настоящему времени получен ряд данных, указывающих на участие в развитии РПЖ различных ростовых факторов и регуляторных белков [Russell et al. 1998; Reynolds A.R., Kyprianou N., 2006], однако остается много нерешенных вопросов, связанных с определением их непосредственного вклада в онкогенез. Среди них наиболее активно исследуемыми являются белки, входящиев так называемую ось «гормон рос-та/инсулиноподобный фактор роста-1» (axis GH/IGF-1) [Cohen Р. et al., 2000; Koyama S. et al., 2010]. В числе особенно актуальных и интенсивно изучаемых вопросов — перспективы использования белковых факторов, вовлеченных в патогенез РПЖ, для диагностики и определения риска возникновения заболевания. О важности поисков новых биомаркеров и разработок на этой основе молекулярных диагностикумов РПЖ говорят накапливающиеся сведения о недостатках традиционно используемого в клинике теста на простат-специфический антиген (ПСА) [Stamey Т.А. et al., 2004].

Проблему осложняет то, что для многих ростовых факторов и других регуляторных белков характерен выраженный биохимический полиморфизм, проявляющийся их качественными и/или количественными изменениями. Эти изменения, в свою очередь, играют важные роли в процессах пролиферации клеток, приобретении ими способности к инвазии и метастазированию, что приводит, в конечном счете, к формированию злокачественного фенотипа клеток [Djavan В. et al., 2001; Weber G.F., 2007; Bidosee M. et al., 2009].

Известно, что биохимический полиморфизм белков человека может быть обусловлен как генетическими, так и эпигенетическими причинами [Beaudet A.L. et al. 1989; Zhang F. et al. 2009]. К генетическим причинам относят множественность генов, или поли-локусность, а также полиаллелизм и альтернативный сплайсинг. Среди эпигенетических причин наиболее распространены постсинтетические модификации белков [Вудс Р., 1983; Beaudet A.L. et al., 1989; Шишкин C.C. и др., 2007].

С началом постгеномного периода особое внимание исследователей привлекает полиморфизм белков, обусловленный однонуклеотидными заменами в соответствующих генах (так называемые single nucleotide polymorphisms, SNP’s) [Zhang F. et al., 2009]. В частности, ведутся многочисленные работы, направленные на выяснение ассоциации отдельных полиморфных вариантов с риском различных онкологических заболеваний [Gsur A. et al., 2001; Chen С. et al., 2006; Jain M. et al., 2007; Hirata H. et al., 20 096- Pilato B. et al., 2010]. По мнению ряда авторов, результаты таких исследований представляют интерес для развития представлений о молекулярных предпосылках возникновения раковых опухолей и могут найти применение для формирования групп высокого риска этих заболеваний, в частности, РПЖ [MononenN., Schleutker J., 2009].

Таким образом, ведущиеся в настоящее время исследования по изучению свойств регуляторных белков человека позволяют надеяться на получение важных результатов, которые расширят представления о молекулярных механизмах РПЖ и будут способствовать разработкам новых подходов к пресимптоматической диагностике, профилактике и лечению этого заболевания.

Цель и задачи исследования

.

Основной целью данной диссертационной работы стало изучение полиморфизма отдельных регуляторных белков, функционирующих в эпителиальных и мышечных клетках человека в норме и при раке предстательной железы, с помощью ряда традиционных и постгеномных технологий.

В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи: 1. Разработать биотест-систему, использующую в качестве тестируемого объекта культивируемые эпителиальные и мышечные клетки, которая позволяла бы определять биологические эффекты различных регуляторных белков, присутствующих в сыворотке крови.

2. Провести иммуноферментное определение сывороточной концентрации отдельных регуляторных белков у пациентов с раком предстательной железы и в группе контроля и оценить проявления количественного полиморфизма этих белков.

3. Провести посредством двумерного электрофореза сравнительный протеомный анализ белков в клеточных линиях, моделирующих рак и доброкачественную гиперплазию предстательной железы, для обнаружения качественного и количественного полиморфизма белков как потенциальных маркеров рака предстательной железы.

4. Изучить встречаемость отдельных регуляторных белков в образах тканей простаты у больных раком и гиперплазией.

5. Исследовать возможность ассоциации различных полиморфных вариантов в некоторых генах, относящихся к системе гормона роста/инсулиноподобного фактора роста-1, а также в генах отдельных актин-связывающих белков с риском рака предстательной железы у этнических русских.

Научная новизна работы.

Оптимизирована клеточная биотест-система, использующая в качестве тестируемого объекта культивируемые клетки рака простаты (ЬИСаР), и с помощью этой биотест-системы выявлен стимулирующий пролиферацию эффект сыворотки больных раком простаты на клетки.

В тканях простаты человека впервые обнаружены две электрофоретические изо-формы белка Ць1, различающиеся по р1, и, возможно, представляющие собой результат посттрансляционных модификаций. При иммуноферментном анализе сывороточного уровня Ць1 у больных раком и гиперплазией предстательной железы получены новые данные, свидетельствующие о достоверном повышении уровня данного белка в сыворотке крови больных РПЖ по сравнению с группой ДГПЖ.

Впервые проведен сравнительный анализ полиморфизма восьми генов (ОНЯ, ЮРВРЗ, ЮПИ, Ш1, МЭТИ, РШ1, АЫХА2, ТАЫЫ), вызванного десятью известными однонуклеотидными заменами (ЗЫР'э), у этнических русских и в представительной группе пациентов с раком простаты. Показано, что распределение частот аллелей и генотипов полиморфного сайта 1388Т/С (Ьеи463Рго) в гене РМЫ1 достоверно различалось в группе больных и в контрольной выборке, в частности, была выявлена ассоциация генотипа ТТ с повышенным риском развития рака простаты. Кроме того, при анализе полиморфного сайта 2911 О/А (01и917Агд) гена ШБ7 обнаружено достоверно значимое накопление алле-ля, А у больных раком по сравнению с контрольной группой. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможном участии полиморфизма генов БМШ и ГОШ в формировании предрасположенности к раку предстательной железы.

Научно-практическая значимость.

Оптимизированная клеточная биотест-система может быть использована для изучения биологических эффектов ростовых факторов на культивируемые клетки рака предстательной железы и для исследований молекулярных нарушений клеточной пролиферации при данном заболевании.

При протеомном изучении белков в клеточных линиях РС-3 (модель рака простаты) и ВРН-1 (модель доброкачественной гиперплазии) идентифицировано 49 белковых фракций, что позволило сформировать два дополнительных модуля в многоуровневую информационную базу данных «Протеомика рака простаты-2009», созданную в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А. Н. Баха РАН совместно с ООО «Инновационные биотехнологии» (http://ef.inbi.ras.ru).

При сравнительном исследовании идентифицированного белка Щ-1 в четырех клеточных линиях показано его более низкое содержание в клетках, моделирующих доброкачественную гиперплазию (ВРН-1), по сравнению с клетками, моделирующими рак простаты (РС-3, 01Ы45 и ЬИСаР).

Результаты проведенных протеомных и иммуноферментных исследований на образцах тканей простаты и сыворотках крови больных раком и гиперплазией простаты позволяют считать белок Ц)-1 перспективным маркером рака предстательной железы и дают основание поставить вопрос о расширении его исследований с целью валидации для последующего использования в диагностике заболевания.

Полученные данные о полиморфизме двух из десяти исследованных ДНК-локусов могут найти применение при урологических обследованиях мужчин для формирования групп высокого риска рака простаты.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Оптимизирована клеточная биотест-система, использующая в качестве биотест-объекта культивируемые клетки рака простаты (ЬИСаР), и с помощью этой биотест-системы у обследованных пациентов с раком предстательной железы выявлен стимулирующий пролиферацию эффект сыворотки больных раком простаты на клетки:

2. При протеомном изучении белков* в клеточных линиях РС-3 (модель рака) и ВРН-1 (модель доброкачественной гиперплазии) идентифицировано 49 белковых фрак9 ций, что позволило сформировать два дополнительных модуля в отечественный информационный ресурс «Протеомика рака простаты-2009».

3. Изучение белка Dj-1 в четырех клеточных линиях показало его наименьшее содержание в клетках, моделирующих гиперплазию (ВРН-1) по сравнению с клетками, моделирующими рак предстательной железы (РС-3, DU-145 и LNCaP).

4. Протеомные и иммуноферментные исследования образцов тканей простаты и сыворотки крови у больных*раком и гиперплазией позволяют считать белок Dj-1 перспективным биомаркером рака простаты.

5. Сравнительный анализ полиморфизма восьми генов (GHR, IGFBP3, IGFR1, IRS1, MSTN, FMN1, ANXA2, TAGLN), вызванного десятью известными однонуклеотидными заменами (SNP's), у этнических русских и в представительной группе пациентов с раком простаты показал достоверно значимое различие рапределения частот аллелей и генотипов по полиморфным сайтам 1388 Т/С (Leu463Pro) в гене FMN1и2911G/A (Glu917Arg) в гене 7i? iSi (rsl801278) у больных РПЖ по, сравнению с контрольной группой.

Апробация работы.

Материалы данной работы докладывались на международных и российских конференциях, в том числе: конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы лучевой диагностики и онкологии» (Москва,' 2008), IV Съезде Российског го общества биохимиков и молекулярных биологов,. (Новосибирску 2008), VII Съезде онкологов России (Москва, 2009), 25-ом-Ежегодном съезде, Европейской ассоциации урологов (25thAnniversary EAU Congress, Barcelona- 2010).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано, 15 научных работ (из них 2 в зарубежной печати), включая 4 статьи в профильных рецензируемых российских ^ международных журналах, 1, статью в сборниках, 2 информационно-методических письма и 8 тезисов докладов.. .

Структура и объем диссертации

.

Диссертация изложена на 146 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (386 наименований). Работа содержит 17 таблиц и 27 рисунков;

выводы.

1. Разработана клеточная биотест-система, использующая в качестве биотест-объекта культивируемые клетки рака предстательной железы (ЬЫСаР), с помощью которой выявлен стимулирующий пролиферацию клеток эффект сыворотки крови больных раком предстательной железы.

2. Иммуноферментный анализ сывороточной концентрации двух белков — регуляторов клеточной пролиферации ростового фактора ГСЯМ и его транспортного белка ЮРВР-З, а также белка Вс1−2 — регулятора апоптоза — не показал статистически достоверных различий между группами пациентов с раком и гиперплазией предстательной железы.

3. При протеомном изучении белков в клеточных линиях РС-3 (модель рака простаты) и ВРН-1 (модель доброкачественной гиперплазии): а) идентифицировано 49 белковых фракций, что позволило сформировать два дополнительных модуля в отечественный информационный ресурс «Протеомика рака простаты" — б) показано, что идентифицированный белок Ц)-1 характеризуется наименьшим содержанием в клетках, моделирующих гиперплазию (ВРН-1) по сравнению с клетками, моделирующими рак предстательной железы (РС-3, 011−145 и ЫчГСаР).

4. При протеомном исследовании биоптатов тканей простаты, полученных от пациентов с раком и гиперплазией предстательной железы, показано, что белок Цн1 в большинстве случаев присутствовал в виде двух электрофоретических изоформ, при этом содержание белка Щ-1 было существенно выше при раке, чем при гиперплазии.

5. Иммуноферментный анализ сывороточной концентрации белка ЦИ выявил статистически достоверные различия между группами больных раком и гиперплазией предстательной железы, что позволяет считать белок Ц]'-1 перспективным биомаркером рака простаты.

6. Методом дискриминации аллелей с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени обнаружено, что в обследованной группе пациентов с раком предстательной железы имеется достоверно значимое накопление аллеля, А в полиморфном сайте 291Ш/А (01и917А^) гена //?57 (ге 1 801 278) по сравнению с контрольной группой. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного сайта 1388 Т/С (Ьеи4бЗРго) в гене РМИ1 (гэ2 306 277) также различалось в группе больных и в контрольной выборке, в частности, была выявлена ассоциация генотипа ТТ с повышенным риском развития рака простаты.

4.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Белки человека, выполняющие сложные регуляторные функции, связанные с клеточной пролиферацией, апоптозом, ростом и развитием, представлены многочисленными семействами и суперсемействами [Le Roith D. et al., 1999; Blobe G.C. et al., 2000; Knillova J., Kolar Z., 2003; Reynolds A.R., Kyprianou N., 2006; Zinkel S. et al., 2006]. Как правило, их рассматривают в составе особых систем, включающих отдельные гормоны и/или ростовые факторы, соответствующие рецепторы и целые группы участников так называемых процессов сигналинга, которые обеспечивают целенаправленные изменения работы клеточного генома [Chang L. et al., 2004; Katz M. et al., 2007]. Одной из таких систем является система гормона роста/инсулиноподобного фактора роста-1 (GH/IGF-1) [Rodriguez S., et al., 2007; Baumann G.P., 2009; Rosenfeld R.G., Hwa V., 2009]. Функционирование этой системы представляется в виде целого ряда последовательных молекулярных процессов, в которых принимают участие десятки белков и пептидов. Система GH/IGF-1 распространяет свое действие на клетки с самыми разными типами дифференцировки [Thorey I.S. et al., 2004], в частности, на клетки ПЖ [Colao A. et al., 1998; 2000; Wang Z. et al., 2005]. Нарушения работы системы GH нередко становятся причинами тяжелой наследственной патологии [Phillips J.А., 1995; Le Roith D. et al., 1999], a также вовлекаются в патогенез онкологических заболеваний [Rodriguez S. et al., 2007; Creighton С J. et al., 2008].

Для многих белков — участников системы GH/IGF-1 характерен выраженный биохимический полиморфизм [Baumann G., 1991; Phillips J.A., 1995; Baumann G.P., 2009]. Это дало основание поставить в качестве одной из целей данной диссертационной работы изучение роли полиморфизма отдельных регуляторных белков, функционирующих в эпителиальных и мышечных клетках человека в норме и раке предстательной железы.

В 21 веке заболеваемость РПЖ оценивалась величиной 25,3 человека на 100 000 населения по всему миру, однако данный показатель сильно варьирует в разных странах [Ramon J., Denis L.J., 2007]. В России в начале 21 века заболеваемость РПЖ вышла на четвертое место в общей структуре онкологических заболеваний и характеризовалась весьма высокими темпами ежегодного прироста, занимая по этому показателю первое место среди онкопатологий [Чиссов В.И. и др., 2008]. Таким образом, эпидемиологические данные свидетельствуют о том, что РПЖ можно рассматривать уже не просто как медицинскую проблему, а более широко — ряд авторов отмечают ее существенные социальные и экономические аспекты [Stephenson A.J. et al., 2007].

Одной из существенных проблем РПЖ является ранняя диагностика данного заболевания, поскольку на ранних стадиях существуют методы радикального и эффективного лечения [Кушлинский Н.Е. с соавт., 2002]. Решение проблемы ранней диагностики РПЖ в настоящее время связывают с внедрением в клиническую практику методов, основнанных на определении в крови или моче некоторых биомаркеров, которые могли бы позволить диагностировать наличие злокачественной опухоли ПЖ.

Для развития исследований в данном направлении и оценки места в нем многочисленных разработок принципиально важным представляется создание общепринятого определения для термина «биомаркер» [Ludwig J.A., Weinstein J.N., 2005].

Биологические маркеры (биомаркеры) — молекулы, которые могут служить индикаторами нормальных или патологических процессов в организме или фармакологических ответов организма на действие терапевтических агентов [Cummings J. et al., 2008]. По мнению Ludwig J.A., Weinstein J.N. (2005), при онкологических заболеваниях биомаркеры могут использоваться как индикаторы различных проявлений канцерогенеза и найти применение в диагностике, могут иметь прогностический характер, а также могут являться индикаторами терапевтического эффекта.

Спектр исследований биомаркеров разных типов обычно начинается с обнаружения потенциального биомаркера и развивается как три основных варианта многостадийного пути, включающих определение связей с самочувствием, функциями или выживаемостью пациентов к валидации биомаркера до решения о применении его в клинике (Рис. 4.1).

Спектр исследований биомаркеров.

Научно-исследовательские технологии.

Развернутые клинические исследования 1.

Исследования (доклинический этап).

Определение вероятности валидации.

Установление валидации.

Выявление новых (потенциальных) биомарке.

Оценка ранних фармако-динамических пока «а те — лей.

Оценка поздних фарма-кодинамических показатвлей.

Пилотные клинические исследования.

Исследования биологии опухолей, поиск диагностических биомаркеров.

Оценки прогностической значимости или влияния течения заболевания.

Рис. 4.1. Схема основных вариантов в спектре исследований биомаркеров разных типов по Ситтищв J. й а1. (2008).

Хотя в ранней диагностике РПЖ в настоящее время фактически центральное место принадлежит определению в крови одного из наиболее изученных биомаркеров — простат-специфического антигена, однако известно, что этот тест сопровождается значительным количеством ложноположительных и ложноотрицательных результатов, которые помимо серьезных негативных медицинских последствий приводят и большим финансовым потерям [Stamey Т.А. et al., 2004]. Как следствие, в США и других западных странах, а также в нашей стране развернулись активные поиски новых, более эффективных биомаркеров РПЖ, для чего широко применяются постгеномные технологии [Примроуз С., Тваймен Р., 2008].

В связи с этим отдельные участники системы GH/IGF-1, а также целый ряд других регуляторных белков исследуются разными авторами как потенциальные биомаркеры РПЖ [Nam R.K. et al., 2003]. В частности, в данной работе было проведено изучение возможностей определения биологической активности отдельных регуляторных факторов, потенциально вовлеченных в патогенез РПЖ, с помощью созданной ранее [Черников и соавт., 1998; 2001] и оптимизированной в последующем клеточной биотест-системы. В результате оптимизированная клеточная биотест-система, использующая в качестве биотест-объекта культивируемые клетки рака простаты (LNCaP), дала возможность выявить стимулирующий пролиферацию клеток эффект сыворотки от обследованных пациентов с РПЖ. Однако, при исследовании методом ИФА содержания в образцах сыворотки крови двух белков — регуляторов клеточной пролиферации IGF-1 и его транспортного белка IGFBP-3, а также белка Вс1−2, регулирующего апоптоза, не было обнаружено статистически достоверных различий по изучавшимся показателям между группами пациентов с РПЖ и ДГПЖ.

В обзоре литературы данной работы отмечено, что в исследованиях биомаркеров РПЖ в настоящее время широко используются результаты успешного завершения международного проекта «Геном человека» (2000 — 2001 гг.) и целого комплекса других связанных с ним работ. По мнению многих авторов, выполнение геномных проектов привело к качественным изменениям в биологии и медицине 21-го века — в итоге фактически началась новая, так называемая постгеномная эра в развитии науки [Downes M.R. et al., 2006; Примроуз С., Тваймен Р., 2008]. Характерной чертой начала постгеномной эры стало возникновение ряда новых научных дисциплин, использующих в исследованиях системный подход и соответствующие технологии, в частности, протеомика.

В данной работе при протеомном изучении белков в клеточных линиях РС-3 (модель РПЖ) и ВРН-1 (модель ДГПЖ) было показано, что идентифицированный белок Dj-1 характеризуется наименьшим содержанием в клетках, моделирующих ДГПЖ (ВРН-1) по сравнению с клетками, моделирующими РПЖ (РС-3, DU-145 и LNCaP). Белок Dj-1 был ранее описан как продукт онкогена DJL Начиная с 2001 г., накапливаются сообщения об участии данного белка в патогенезе опухолевых заболеваний и его ценности как потенциf ального онкомаркера. Установлено, что белок Dj-1 присутствует в клетках многих злокаt 113 чественных опухолей и играет роль в повышении клеточной пролиферации и устойчивости опухолевых клеток к апоптозу. В частности, белок Dj-1 был обнаружен ранее и в клетках ПЖ.

При дальнейшем протеомном исследовании биоптатов тканей ПЖ, полученных от пациентов с РПЖ и ДГПЖ, было установлено, что содержание белка Dj-1 существенно выше при РПЖ, чем при ДГПЖ. Таким образом, указанные результаты давали основание для того, чтобы рассматривать белок в качестве потенциального биомаркера РПЖ.

Для проверки этой рабочей гипотезы было проведено с помощью ИФА пилотное исследование содержания белка Dj-1 в группах пациентов с РПЖ и ДГПЖ. Результаты выявили статистически достоверные различия между этими группами, что позволяет считать белок Dj-1 перспективным биомаркером РПЖ. При этом в доступной литературе не удалось найти публикаций об измерениях уровней белка Dj-1 в крови пациентов с РПЖ и ДГПЖ.

Основываясь на полученных результатах проведенных протеомных и иммунофер-ментных исследований, можно сделать заключение, что белок Dj-1 является перспективным биомаркером РПЖ, положительно зарекомендовавшим себя в ходе первых трех эта/ пов исследований. В целом, представленные данные дают основание поставить вопрос о продолжении изучения белка Dj-1 с целью его валидации как биомаркера РПЖ и, в случе успеха, для последующего использования при диагностике этого заболевания.

Продолжения изучения, очевидно, заслуживает и факт обнаружения в тканях простаты человека (в основном, при РПЖ) двух электрофоретических изоформ белка Dj-1, различающиеся по pl. Возможно, что эти изоформы представляют собой результат посттрансляционных модификаций общего белкового продукта онкогена DJ1.

К настоящему времени известно, что во многих случаях биохимический полиморфизм белков человека может быть обусловлен различными генетическими причинами. В частности, с развитием ДНК-технологий появился целый поток работ, направленных на изучение различных видов ДНК-полиморфизма в генах, включая однонуклеотидные замены (SNP's).

Соответственно, одной из задач данной работы стало изучение у этнических русских возможных ассоциаций отдельных полиморфных вариантов по 10 полиморфизмам в 8 генах, относящихся к системе GH/IGF-1 и актин-связывающим белкам, с риском РПЖ. В результате удалось обнаружить достоверно значимое накопление аллеля, А в полиморфном сайте 2911G/A (Glu917Arg) гена IRS1 (rsl801278) у больных РПЖ по сравнению с контрольной группой. Также было показано, что распределение частот аллелей и генотипов полиморфного сайта 1388 Т/С (Leu463Pro) в гене FMN1 (rs2306277) достоверно различалось в группе больных и в контрольной выборке. В частности, была выявлена ассоциация генотипа ТТ с повышенным риском развития РПЖ. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможном участии полиморфизма генов РМЫ1 и ШБ! в формировании предрасположенности к РПЖ.