Молекулярно-генетические маркеры системы детоксикации при болезни двигательного нейрона

Боковой амиотрофический склероз является одним из самых тяжелых неврологических заболеваний. Несмотря на то, что первое описание бо-, лезни было дано еще в середине 19 века и все эти годы велось активное изучение этиопатогенетических механизмов развития данного заболевания, несмотря на сегодняшние впечатляющие успехи фундаментальных нейро-наук возможности терапевтической помощи больным остаются весьма скромными. Трагизм БАС заключается в том, что это заболевание (по крайней мере, на сегодняшний день), является фатальным, неуклонно прогрессирующим и поражает в большинстве случаев людей наиболее трудоспособного возраста, в расцвете физических, интеллектуальных и творческих сил. Пациенты по мере прогрессирования болезни не утрачивают свои интеллектуально — мнестические функции и (в силу осведомленности о характере своего заболевания, благодаря сегодняшней возможности доступа к любой медицинской информации, в т. ч. через Internet) до конца осознают тяжесть своего положения. Достаточно часто пациенты, несмотря на данную осведомленность об ограниченной возможности паллиативной терапии активно требуют у лечащих врачей применения всех возможных на сегодняшний день способов лечения и продления жизни (путем протезирования витальных функций) в надежде на то, что выяснение причины этого заболевания не за горами и врачам удастся применить этиопатогенитическое лечение. Очень характерен пример из наблюдения проф. JI.M. Поповой, когда заболевший БАС молодой человек требовал проведения ИВЛ в финальной стадии болезни и стойко прожил таким образом (на аппарате) 14 v лет, веря, что ученым вот-вот удастся «разгадать» БАС и помочь ему [46].

Все это не позволяет неврологам относиться к данной патологии пессимистично и пассивно. Вера и надежда пациентов, исследовательский и профессиональный интерес не только неврологов, но и представителей других клинических и фундаментальных наук (генетиков, биохимиков, морфологов, врачей функциональной диагностики, хирургов и многих других), успехи и потенциальные возможности современных нейронаук и других смежных дисциплин побуждают ученых и исследователей всех стран мира объединить свои усилия, направив их на углубление изучения всех аспектов этого тяжелого недуга. Этим продиктована актуальность исследований, направленных на уточнение тех или иных звеньев патогенеза. Это определяет необходимость и данной нашей работы.

Согласно современной классификации Исследовательской группы по нервно-мышечным заболеваниям Всемирной Федерации Неврологов [287], боковой амиотрофический склероз (БАС) относят к группе болезней двигательного нейрона (БДН), куда кроме БАС (подавляющее большинство всех БДН) относят прогрессирующий бульбарный паралич (ПБП), прогрессирующую мышечную атрофию (ПМА), и первичный боковой склероз (ИБС).

Следует отметить, что ввиду относительной немногочисленности пациентов с ПБП, ПБС и ПМА, и в отечественной, и в зарубежной литературе традиционно установилась некая терминологическая синонимичность между понятиями БДН (MND) и БАС (ALS). Эта синонимичность неизбежно будет допущена и в данной работе, но лишь в тех местах, где это не будет искажать смысл.

Болезнь двигательного нейрона (БДН) — это нейродегенеративное заболевание, сопровождающееся гибелью центральных и периферических мотонейронов, неуклонным прогрессирующим течением и летальным исходом. Согласно современным данным о возможных этиопатогенетических механизмах развития БДН, её- можно определить (ВОЗ) как мультифакто-риальное заболевание, в развитии которого играют роль как генетическая предрасположенность, так и факторы внешней среды.

Со времен описания клинической картины БАС выдвигалось множество гипотез возникновения данного заболевания. Имели место инфекционно-вирусная и наследственная теория, которые достаточно долгое время являлись ведущими. Также изучалась роль иммунных и трофических факторов, обсуждалось влияние различных метаболических расстройств, возможное влияние факторов окружающей среды и многие другие.

Еще в 1904 г. И. И. Иванов предположил, что БАС развивается под влиянием неизвестного токсического фактора, который, циркулируя в крови, «омывает» передние рога, поражая периферические, а затем, восходя вертикально, и центральные нейроны. [24]. Некоторое время была популярна авитаминозная теория, согласно которой предполагали этиопатогенетиче-ское участие недостатка витамина Е в развитии БАС. (Swank, Putnem, Wechsler et all.) Однако отсутствие эффекта от витаминотерапии Е вынудили исследователей отказаться от этой гипотезы.

Инфекционно — вирусная теория, основоположниками которой были И. П. Мержевский, А. Ф. Эрлицкий (1883 г), JI.O. Даркшевич (1910), М. С. Маргулис (1914г) некоторые другие отечественные и зарубежные ученые, долгое время была ведущей в СССР. Начиная с середины 20 века ряд исследователей выделяли БАС в группу т.н. «медленных инфекций ЦНС». Однако специфический вирусный агент выявить так и не удалось, и предпринятые в дальнейшем многочисленные попытки подтвердить данную этиологическую гипотезу, как основополагающую, оказались безуспешными (Salazar et al., обзор Kennedy, 1990).

Другой основной теорией возникновения и развития БАС является наследственная. Её- основоположниками и приверженцами являлись К. Schaffer, С. Н. Давиденков, Ottonello, Davisson, Г. Г. Соколянский и др. Aran (1850) [77], Norris (1975) [219] и Mulder (1982) [212], С. Н. Давиденков.

1933), W. Osler (1880) [225], Brown (1951) [100], Cudkowicz (1997) [118] описывали проявления БАС в нескольких поколениях или у нескольких родственников в одном поколении в одной семье. В 1933 г. выдающийся отечественный невролог С. Н. Давиденков описал семейные случаи БДН, выявив у родственников т.н. наследственную доминантную дизрефлексию с высокой пенетрантностыо, предположив аутосомно — доминантный тип наследования БДН (за 20 лет до аналогичных исследований американских ученых). Но, в связи с известными гонениями на генетику в СССР, подобные работы не были продолжены.

Последние десятилетия 20 века охарактеризовались значительными успехами молекулярной биологии, в том числе в понимании некоторых закономерностей патогенеза семейного БАС. Важной вехой в изучении патогенетических механизмов было выявление в 1993 году D. Rosen с соавторами ассоциации семейного БДН с мутациями в гене медь-цинк-зависимой супероксиддисмутазы (СОД-1). Но выявленные мутации не нарушали ан-тиоксидантной активности данного фермента, а влияли на какие-то другие его свойства и свойства антиоксидантной системы в целом, которые делали данный фермент участником патогенетической цепочки, приводящей к * развитию БАС, (Gurney et al., 1994; Reaume et al., 1996). Важным является тот факт, что, заболевание у пациентов, имеющих данные мутации и в семейных, и в спорадических случаях клинически протекает одинаково, что дает возможность предполагать общность патогенетических механизмов, связанных с определенными генетическими дефектами. В настоящее время большинство исследователей-нейрогенетиков полагают, что развитие спорадических случаев БДН связано с наличием генетически обусловленных ' дефектов метаболизма мотонейронов. Выделяют четыре наиболее вероятных механизма — это оксидантный стресс (в спорадических случаях), нарушение процессов детоксикации, изменения структуры цитоскелета и эксайтотоксичность. Вовлеченные в эти процессы гены могут рассматриваться как наиболее вероятные гены-кандидаты БДН.

Для уточнения патогенетических механизмов развития БАС необходимо изучать выявленные при БДН генетические дефекты в системах анти-оксидантной защиты, нейротрансмиссии и ряда других систем для оценки их патологического влияния на жизнедеятельность и функционирование ЦНС в целом и, в частности, на центральные и периферические мотонейроны. Результаты многочисленных патоморфологических и экспериментальных работ свидетельствуют о сочетании дефектов функционирования и дефектов структуры данных систем при БДН — например, наблюдения о сопутствующей патологии нейрофиламентов (система цитоскелета мотонейрона) и дисбаланса в системе регуляции апоптоза-антиапоптоза при БДН, ассоциированной с мутациями СОД-1, инактивация мутантной СОД-1 глиального глютаматного переносчика ЕААС-1 и др. (Огте11, 1995; КаЫ-га&ъЪ, 1995; ТгоШ, 2000).

Изучение влияния мутаций в гене СОД-1 на функцию фермента следует проводить с точки зрения не только его антиоксидантных свойств, но и параметров оксидантной системы, гипотетического воздействия на другие системы мотонейрона за счет неких цитотоксических свойств, возникших у данного белка при мутации.

Оценка особенностей развития оксидантного стресса требует анализа не только свойств СОД-1, но и свойств других антиоксидантных ферментов, функциональные особенности которых могут компенсировать или усугублять течение БДН (марганец-зависимой супероксиддисмутазы (СОД-2) и экстрацеллюлярной СОД, глютатионовых ферментов, каталазы и др.), возможного поиска первичных дефектов или лее известных полиморфных вариантов их генов, связь которых предполагается с БДН [34].

Одним из значимых патогенетических факторов БДН являются свободные радикалы [189].

В этом отношении интересной и пока малоизученной представляется возможная взаимосвязь между дефектами функционирования системы де-токсикации и развитием и поддрежанием оксидантного стресса и особенностями заболевания у пациентов с БДН. Гены, кодирующие ферменты, которые метаболизируют ксенобиотики, характеризуются значительным полиморфизмом, и наличие делеций или «медленных» аллелей может приводить к дисбалансу процессов детоксикации.

Детоксикация — сложный процесс, включающий три основные фазыактивацию ксенобиотиков, их нейтрализацию и выведение из организма [48]. Первые две фазы играют важную роль в накопление токсичных метаболитов, которые могут оказывать повреждающие действие на мотонейроны. Фаза активации, во время которой происходит образование в молекуле субстрата гидрофильных групп, обеспечивается в первую очередь семейством цитохромов — Р450, среди которых большой интерес представляет эта-нолиндуцибильная форма — СУРЕ1, способная генерировать супероксида-нионы. В ряде работ было показано, что СУР2Е1 и СУР206 могут участвовать в патогенезе некоторых неврологических заболеваний, в частности, такого нейродегенеративного заболевания, как болезнь Паркинсона [93, 133, 242, 262]. Главным назначением второй фазы является нейтрализация гидрофильных и зачастую токсичных продуктов фазы активации [33]. Основными участниками данного этапа являются глютатион-8-трансферазы (ОБГП, С8ТМ1, С8ТР1) и Ы-ацетилтилтрансфераз (ЫАТ2). Третья фазавыведение водорастворимых нетоксичных компонентов из организма.

В литературе описано немало особенностей строения и наличия дефектов в генах, отвечающих за синтез и функционирование ферментов системы детоксикации (например делеционный полиморфизм глютатион-8трансфераз, ответственный за частичное или полное отсутствие этих важных антиоксидантных ферментов у человека, участвующих в детоксикации ксенобиотиков (Salagovic, 1998), наличие в гене CYP2E1 регуляторного полиморфизма — инсерции (I) 100 п.н., который повышает уровень экспрессии гена [288], и др.) Представляется возможной взаимосвязь между дефектами функционирования ферментов с данными генетическими особенностями и их влиянием на развитие и течение БДН.

В свете вышеизложенного представляет интерес изучение возможного патологического влияния ферментов (с наличием генетических особенностей) системы детоксикации в развитии и поддержании оксидантного, стресса, а также вследствие этого возможности прямого (или опосредованного) токсического влияния промежуточных метаболитов на функционирование мотонейронов у пациентов, страдающих БДН, на течение и клинические особенности заболевания.

ЦЕЛЬ ИСЛЕДОВАНИЯ.

Изучение молекулярно-генетических маркеров системы детоксикации при спорадической БДН в российской популяции и их влияния на патогенез, течение и клинические особенности заболевания.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. Исследовать на наличие мутаций или полиморфизмов гены ферментов Фазы I процесса внутриклеточной детоксикации — представителей семейства цитохромов Р-450: CYP 2Е1 и CYP 2D6, и гены ферментов Фазы II: представителей семейства глутатионтрансфераз GSTT1, GSTM1, GSTP1 и К-ацетилтрансферазу-2 (NAT-2).

2. На основании результатов генетического исследования сделать вывод о характере участия и взаимодействия данных генетических маркеров системы детоксикации в патогененезе БДН.

3. Сопоставить полученные результаты с основными клиническими характеристиками заболевания (возрастом начала, формой/дебютом и вариантом, типом прогрессирования) для возможного прогнозирования особенностей течения болезни у пациентов с тем или иным генетическим дефектом ферментов системы детоксикации.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

В данном исследовании впервые произведена комплексная оценка генетических маркеров Фазы I I (СУР 2Е1 и СУР 2Б6) и Фазы II (ОБТТ!, 08ТМ1, 08ТР1 и МАТ-2) процесса внутриклеточной детоксикации у пациентов с болезнью двигательного нейрона (БДН) в российской популяции больных.

Впервые проанализирована взаимосвязь наличия изученных генотипов с клиническими характеристиками БДН.

Впервые установлена ассоциация различных клинических вариантов БДН с определенными полиморфными вариантами генов Фазы I (СУР 2Е1 и СУР 2Б6) и Фазы II (С8ТТ1, 08ТМ1, С8ТР1) процесса внутриклеточной детоксикации в российской популяции больных.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Проведенное исследование показало, что у пациентов с БДН, принадлежащих российской популяции, полиморфные варианты генов внутриклеточной системы детоксикации, меняющие (по данным литературы) активность соответствующих ферментов, достоверно связаны с заболеванием. Установлена и обоснована целесообразность назначения пациентам с наличием данных генотипов в качестве облигатной терапевтической стратегии антиоксидантов и других детоксицирующих агентов. Показано, что необходимо учитывать особенности «индивидуального генетического профиля» системы детоксикации у больных с БДН для подбора индивидуальных доз лекарственных препаратов, метаболизируемых через соответствующие изученным генам ферменты (антидепрессанты (амитриптилин, имипрамин и др.), нейролептики (галоперидол), некоторые бета-блокаторы и анти-аритмики, ряд других препаратов). Перспективно использование данных проведенного исследования при составлении индивидуального «генетического паспорта» пациентов.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1) Гены ферментов Фазы I (CYP 2Е1 и CYP 2D6) и Фазы II (GSTP1, GSTM1, GSTT1) внутриклеточной системы детоксикации ассоциированы с развитием БДН.

2) Полиморфные варианты генов Фазы I детоксикации (CYP 2E1*1D и CYP 2D6*4), меняющие активность соответствующих ферментов, приводя к избыточной продукции и накоплению токсических метаболитов и свободных радикалов, ассоциированы с развитием БДН и её- более тяжелыми клиническими формами.

3) БДН (классический клинический вариант заболевания) ассоциирована с полиморфными вариантами GSTM1 (+) и GSTP1*A генов Фазы II, синтезирующих ферменты с нормальной активностью.

4) Полиморфные варианты, снижающие функцию ферментов Фазы II детоксикации не ассоциированы с развитием БДН (GSTM1 (0) и NAT-2), либо приводят к развитию относительно благоприятных клинических вариантов болезни (GSTP1*B).

5) Исследование индивидуального генетического профиля внутриклеточной системы детоксикации у больных БДН целесообразно для оптимизации доз при назначении лекарственных препаратов, мета-болизируемых через соответствующие изученным генам ферменты.

выводы.

1. Комплексное клиническое и генетическое обследование 75 пациентов с болезнью двигательного нейрона (БДН) выявило вовлеченность генов ферментов Фазы I и Фазы II процесса внутриклеточной детск-сикации ((СУР2Е1, СУР20б, в8ТР1 и вБТЫ!) в развитие спорадической болезни двигательного нейрона в российской популяции больных.

2. Исследование гена фермента СУР2Е1 Фазы I процесса внутриклеточной детоксикации показало, что наличие аллеля СУР2Е1 *Ю достоверно коррелирует с развитием относительно более злокачественных (приводящих к более быстрой инвалидизации) форм болезни двигательного нейрона — прогрессирующего бульбарного паралича и БАС с дебютом грудной и диффузной локализации (р = 0,049), что, по-видимому, отражает повышение активности фермента СУР2Е1, приводящее к развитию оксидантного стресса.

3. Исследование гена фермента СУР2Б6 Фазы Г процесса внутриклеточной детоксикации показало, что гомозиготность по аллелю СУР206*4 гена данного фермента ассоциирована с развитием спорадической болезни двигательного нейрона в российской популяции (р= 0,04), вследствие образования дефектного белкового продукта, приводящего к феномену медленной метаболизации.

4. Болезнь двигательного нейрона в российской популяции ассоциирована (р = 0,033) с наличием аллеля С8ТМ1(+) гена фермента Фазы II внутриклеточной детоксикации, обеспечивающим нормальную активность данного фермента.

5. Наличие аллеля С8ТР1*В гена 08ТР1 (снижающего активность данного фермента Фазы II внутриклеточной детоксикации), ассоциировано с относительно более благоприятными по степени инвалидиза-ции сегментарно-ядерным и пирамидным вариантами болезни двигательного нейрона в российской популяции (р= 0,0102).

6. Исследование индивидуального генетического профиля внутриклеточной системы детоксикации позволяет оптимизировать патогенетическую терапию болезни двигательного нейрона. У больных — носителей аллеля СУР2Е1 *Ю (ген фермента Фазы I внутриклеточной детоксикации) является обоснованным использование препаратов с антиоксидантным действием.

7. Выявленные структурные особенности генов ферментов Фазы I и Фазы II процесса внутриклеточной детоксикации у пациентов с болезнью двигательного нейрона следует учитывать в будущем при индивидуализированном назначении препаратов с учетом положений фармакогеномики и при составлении индивидуального генетического паспорта пациентов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Наличие гомозиготности по аллелю СУР2Е1 *Ю может служить косвенным подтверждением БДН, прогностически является маркером более тяжелых клинических форм болезни (ПБП и диффузный дебют БАС), обусловливает целесообразность назначение антиоксидантной терапии.

2. Перспективно исследование генетического профиля системы детоксикации у пациентов с болезнью двигательного нейрона для оптимизации назначения препаратов с учетом положений фармакогеномики.