Совершенствование лабораторной диагностики онихомикозов на основе метода полимеразной цепной реакции

Актуальность проблемы.

Дерматомикозы относятся к числу наиболее распространенных инфекций человека. В международных исследованиях установлено, что грибковые инфекции ногтей обусловливают до 25% обращаемости к дерматологу [Roseeuw D., 1999]. Данные сплошной диспансеризации в России показали, что онихомикоз может быть выявлен у 5% взрослого городского населения [Сергеев А.Ю. и соавт., 2002].

До настоящего времени диагностика микозов кожи и ногтей включала методы, которые требуют либо существенных временных и материальных затрат (микробиологическая, реже гистологическая и иммунологическая диагностика), либо недостаточно чувствительны и зависят от субъективного мнения врача-лаборанта (световая микроскопия) [Lawry М.А. и соавт., 2000; Lilly K.K. и соавт., 2006; Weinberg J.M. и соавт., 2003]. Для того чтобы преодолеть эти недостатки в повседневной практике, приходится выполнять повторные или множественные исследования [Kane J. et al. 1997; Суколин Г. И. и соавт., 2005]. До сих пор существуют разногласия в интерпретации результатов микологического исследования, оценки роли разных видов и групп грибов в этиологической структуре онихомикоза [Степанова Ж.В., 2002; Summerbell R.C. и соавт., 2005].

Новое развитие лабораторная диагностика микозов получила с появлением молекулярно-генетических методов, позволяющих выделить ДНК возбудителей [Verweij P.E. и соавт., 2000]. В данной области появляется возможность разрабатывать эффективные, применимые на практике, организационно и экономически приемлемые методики. Возможность использования одношагового подхода к диагностике (в частности, ПЦР), доступного во многих лабораториях и не требующего переподготовки персонала, не нуждающегося в дополнительной обработке материала или особых предосторожностях по сбору образцов, делает разработку этого метода перспективной для врачей общей практики [Feuilhade de Chauvin М., 2005; Tietz HJ., 2005].

Вплоть до настоящего времени за рубежом не удалось внедрить и на достаточном числе больных показать эффективность и практическую применимость какой-либо одношаговой технологии по определению возбудителей дерматомикозов непосредственно в клиническом материале. Внедрение нового метода, претендующего на роль золотого стандарта в диагностике онихомикозов, требует тщательной оценки точности, чувствительности и специфичности, для чего необходимы повторные обследования значительных контингентов, катамнестические наблюдения.

Учитывая перечисленные выше факты, разработка и внедрение микологической ПЦР диагностики представляет актуальную задачу современной дерматологии, решение которой будет способствовать эффективному выявлению и совершенствованию терапии онихомикозов.

Цель исследования.

Оценить точность и возможности клинического использования метода полимеразной цепной реакции при онихомикозах для совершенствования на этой основе диагностики, лечения и профилактики заболевания.

Задачи исследования.

1. Провести сравнительный анализ результатов регламентированных методов диагностики онихомикозов и ПЦР на различных стадиях заболевания и в различных группах обследованных.

2. Изучить точность, специфичность и чувствительность ПЦР как метода лабораторного подтверждения диагноза онихомикоза.

3. Изучить возможности ПЦР как метода контроля излеченности и оценки результатов лечения онихомикоза в динамике.

4. Изучить современную этиологию онихомикозов с помощью видоспецифичной генодиагностики.

5. Разработать алгоритм современной диагностики онихомикозов на основе применения полимеразной цепной реакции.

Научная новизна исследования.

Впервые на большом клиническом материале изучены результаты использования отечественной диагностической ПЦР системы с использованием пары видоспецифичных праймеров Т. rubrum и Т. mentagrophytes var. interdigitale. Показаны высокая точность, специфичность и чувствительность нового метода.

Впервые на основе методов высокоточной видоспецифической молекулярной диагностики уточнена современная этиологическая картина онихомикозов, выявившая увеличение доли дерматофитов.

На основе полученных данных предложена новая концепция диагностики онихомикозов (выделяющая ПЦР-позитивный и ПЦР-негативный онихомикоз) и разработан эффективный диагностический алгоритм.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Изученная методика ПЦР — высокоточный диагностический тест, результаты которого достоверно соответствуют результатам регламентированных методов диагностики онихомикозов. По выявляемости заболевания ПЦР превосходит регламентированные методы.

2. Применение ПЦР в изучении этиологии онихомикозов позволяет достоверно уточнять значение и роль дерматофитов в этиологической структуре заболевания.

3. Внедрение ПЦР позволяет повысить качество лабораторной диагностики онихомикозов и совершенствовать лечебно-профилактические мероприятия.

Практическая значимость.

В клиническую практику предложен новый метод диагностики, позволяющий устанавливать диагноз онихомикоза с точностью, достоверно превосходящей существующие регламентированные методы.

Разработан новый диагностический алгоритм лабораторной диагностики онихомикозов, позволяющий резко сократить экономические и временные затраты на дорогостоящие микробиологические исследования у более 96% больных онихомикозами.

Метод ПЦР позволяет проводить экспресс-диагностику онихомикозов с одновременной видовой идентификацией главных возбудителей, что обеспечивает своевременную этиотропную терапию. Методика сбора материала не требует специальной подготовки и ПЦР можно рекомендовать для массовых обследований.

Метод ПЦР делает возможной раннюю оценку микологической излеченности и эффективности терапии онихомикозов в динамике, что позволит сократить сроки наблюдения больных.

Материалы исследования легли в основу «Инструкции по применению набора реагентов для определения ДНК Трихофитон рубрум (Trichophyton rubrum) и Трихофитон ментагрофитес, вар. интердигитале (Trichophyton mentagrophytes var. interdigitale) методом полимеразной цепной реакции ТрифАм», утвержденной Приказом Росздравнадзора от 16 июля 2007 года № 1563-Пр-07.

Апробация работы.

Основные положения диссертации представлены и обсуждались на заседаниях 2 международной конференции Trends in medical mycology (Берлин, 2005), V Всероссийского конгресса по медицинской микологии (г. Москва,.

2007 г.) и Московского научного общества дерматовенерологов имени А. И. Поспелова (г. Москва, 2007 г.), Областной научно-практической конференции врачей дерматовенерологов (г. Тула, 29.11.2007 г.), Юбилейной XXV научно-практической конференции с международным участием «Рахмановские чтения. Современная дерматовенерология: от истории к инновациям», Москва 2008, II Съезде микологов России, Москва 2008.

Диссертация апробирована на научной конференции кафедры кожных и венерических болезней лечебного факультета Московской медицинской академии имени И. М. Сеченова.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано в печати 13 научных работ, в том числе глава в фонографии «Грибковые инфекции. Руководство для врачей», изд. 2-ое, М.: Бином-пресс, 2008.

Структура диссертации.

Работа изложена на 159 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы и глав, содержащих изложение материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы.

Указатель литературы включает 29 отечественных и 137 зарубежных работ. Диссертация иллюстрирована 15 рисунками и 43 таблицами.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Задачи лабораторной диагностики онихомикоза.

Лабораторная диагностика онихомикоза производится с целью установления или подтверждения диагноза заболевания. Клиническая оценка онихомикоза неспособна однозначно установить диагноз и назначить лечение, основанное на противогрибковых препаратах. С этих позиций диагностика онихомикозов укладывается в концепцию диагностики любых инфекционных заболеваний, особенно принимая во внимание истинно контагиозную природу большинства возбудителей-дерматофитов.

Известно, что часть лечащих врачей, особенно за рубежом (в т.ч. семейные врачи, общей практики), вообще не проводит лабораторную диагностику онихомикоза перед началом противогрибковой терапии [Clayton Y.M., 1992; Daniel C.R., 3rd, 1991; Koshnick R.L. и соавт., 2007; Rajpar S.F., Abdullah A., 2006]. Тем не менее, современные руководства и клинические рекомендации исключают назначение антимикотиков без лабораторного подтверждения диагноза [Roberts D.T. и соавт., 2003], поскольку диагноз онихомикоза без определения возбудителя не считается надежным [Seebacher С. и соавт., 2007]. Одним из главных доводов в пользу необходимости лабораторного исследования является довольно высокая вероятность диагностической ошибки при клинической оценке, что наряду с длительностью и сложностью системной терапии онихомикоза делает практически недопустимым лечение ex juvantibus [Denning D.W. и соавт., 1995; Roberts D.T. и соавт., 2003].

Несмотря на то, что в последние годы установлены клинические признаки, статистически достоверно дискриминаторные для онихомикоза (в частности, изменение цвета ногтей и белые пятна на поверхности, одностороннее поражение ногтей стоп или одновременное поражение ногтей 1 и 5 пальцев на одной стопе) [Fletcher C.L. и соавт., 2004; Walling H.W., Sniezek P.J., 2007], существуют разногласия в оценке этих изменений между разными исследователями и лечащими врачами [Fletcher C.L. и соавт., 2003]. Клинические проявления онихомикоза, укладывающиеся в симптомокомплексы онихолизиса, гиперкератоза и иные типовые изменения ногтей, могут наблюдаться при ряде ониходистрофий [Рукавишникова В.М., 2008].

Организационная структура современной лабораторной диагностики онихомикозов приведена в «Руководстве по лабораторной диагностике онихомикозов» (2000). В настоящее время, как правило, преобладает направление собранного врачом материала в микологическую лабораторию/кабинет или сбор материала медицинской сестрой в самой лаборатории с последующей микроскопией и/или посевом [Сергеев А.Ю., 2000].

Регламентированные методы диагностики онихомикоза.

К регламентированным методам лабораторной диагностики онихомикозов относятся микроскопическое и микологическое (культуральное) исследования.

В силу недостаточно высокой точности каждой из методик рекомендуется выполнять оба исследования в каждом случае онихомикоза [Daniel C.R., 3rd, 1991; Elewski В.Е., 1996], кроме того, культуральное исследование имеет значение в определении тактики лечения [Denning D.W. и соавт., 1995; Сергеев А. Ю., 2001]. Обе методики требуют определенного времени для выполнения (до 24 ч. при микроскопии и 7−28 дней при культивировании) и квалификации персонала лаборатории или врача, выполняющего исследование непосредственно в кабинете/отделении дерматомикологии [Сергеев А.Ю., 2000].

В повседневной практике врачей считается допустимым подтверждение диагноза онихомикоза с помощью хотя бы одной регламентированной методики, при использовании обеих из них [Epstein Е., 1998]. Этот подход основывается на недостачной чувствительности каждой из методик, взятой в отдельности, хотя данных для доказательного анализа этого факта до сих пор не хватает [Bigby M.,.

1998; Elewski B.E., 1995; Liu H.N. и соавт., 1993]. В то же время, практика отечественного [Сергеев Ю.В., 1998; Кунгуров Н. В., 2004] здравоохранения показывает, что многие врачи-дерматологи выполняют только одно регламентированное исследование.

Недостатки обеих методик — низкие чувствительность и специфичность культурального исследования [Hull P.R. и соавт., 1998], субъективное восприятие результатов и отсутствие достаточно достоверных данных для анализа чувствительности микроскопии [Bigby М., 1998; Lawry М.А. и соавт., 2000], убеждают некоторых лечащих врачей вообще воздерживаться от лабораторной диагностики онихомикоза, что может иметь негативные последствия в диагностике и лечении [Denning D.W. и соавт., 1995; Сергеев Ю. В., 1998; Кунгуров Н. В., 2004].

Микроскопическое исследование.

Традиционные техники световой микроскопии, используемые в диагностике онихомикозов, подробно описаны в руководствах В. М. Лещенко (1982), П. Н. Кашкина и В. В. Лисина (1983), под редакцией J. Капе и соавторов (1998) и А. Ю. Сергеева (2000) [Лещенко В.М., 1992; Кашкин П. Н., Лисин В. В., 1983; Капе J. и соавт. 1998, Сергеев А. Ю., 2000]. В настоящее время наиболее широко используется микроскопия неокрашенных препаратов с предварительной обработкой (мацерацией, просветлением) материала раствором едкого калия в концентрациях 5−30% и временем выдержки 0,5−24 ч. (КОН-микроскопия).

Микроскопия является базовым и наиболее широко используемым методом лабораторной диагностики онихомикозов [Elewski В.Е., 1996], и дерматологи до настоящего времени испытывают к ней наибольшее доверие. За рубежом КОН-микроскопию как основной метод диагностики назначает не менее 63% дерматологов перед началом лечения онихомикоза [Koshnick R.L. и соавт., 2007].

Диагностическая ценность традиционной световой микроскопии.

Ранние сообщения отечественных авторов о точности диагностики онихомикоза с помощью микроскопии с трудом поддаются анализу, поскольку критерии оценки диагностических тестов (чувствительность, специфичность и др.) не применялись или не были опубликованы. Фактически первой работой, позволившей оценить точность однократной КОН-микроскопии в повседневной диагностике онихомикозов, является диссертация А. Ю. Сергеева, в которой проанализирован пятилетний опыт крупной отечественной лаборатории [Сергеев А.Ю., 2002]. По данным микологического кабинета лаборатории ЦКБ ГМУ УДП РФ, в 1997;2001 г., из 14 444 образцов материала из ногтей, направленных из разных клинических центров, получено 5439 положительных результатов микроскопии (37,6%). Средние показатели чувствительности микроскопии за 5 лет составили 87,81% при разбросе 84,9−90,2%. При этом в качестве истинно положительных результатов засчитывались положительные ответы хотя бы в одном из проведенных тестов [Сергеев А.Ю. и соавт., 2002]. Проводя ретроспективную оценку этого исследования и беря в качестве истинно положительных результатов данные обеих регламентированных методик, мы можем отметить, что чувствительность микроскопии составит уже 75%, а специфичность — 74%, при общей выявляемое&tradeонихомикоза любым методом в 42%. Показатель отношения вероятности в этом случае составляет 2,92, а в случае критерия истинности, приравненного к любому положительному результату — 3,4.

В.Е. Маликов продолжил анализ выявляемое&tradeонихомикоза в лаборатории ЦКБ в 2002;2004 г. По его сведениям, процент положительных результатов микроскопии в этот период составил 47,4 у 467 больных в 625 образцах материала [Маликов В.Е., 2005].

Приведенные в работе. A.A. Кубанова и Н. В. Фриго (2007) показатели 94,8% положительных результатов микроскопии 330 образцов ногтей из 11 разных ЛПУ не находят подтверждения в других отечественных и зарубежных исследованиях.

Это может быть объяснено выборкой в данном исследовании, включавшем не общую, а специальную популяцию пациентов с заведомо диагностированным онихомикозом. Кроме того, методики обследования пациентов, заявленные в данной работе, не были унифицированы (разные растворы и концентрации щелочи), несмотря на единый сайт диагностики [Кубанов A.A., Фриго Н. В., 2007].

Одной из ранних зарубежных работ, посвященных чувствительности световой микроскопии, было исследование R. Davies в 1968 г. [Davies R.R., 1968]. На большом клиническом материале (3955 образцов ногтей) чувствительность световой микроскопии была рассчитана как 88% (при 31,8% положительных результатов), при этом в анализе использовались результаты посева на Т. rubrum и лечения гризеофульвином тех же пациентов. Анализируя диагностические тесты при онихомикозе с позиций доказательной медицины, Bigby М. в 1998 г. отнес указанное исследование к наиболее достоверным и уточнил данные Davies. При этом показатель отношения вероятности (likelihood ratio) для микроскопии составлял от 4 (при клиническом диагнозе онихомикоза и положительном результате микроскопии или посева на Т. rubrum) до 15 (при клиническом диагнозе онихомикоза и обязательном положительном результате посева независимо от микроскопии) [Bigby М., 1998].

В североамериканском исследовании Drake L. и соавт. (1997), вошедшем в анализ Bigby, чувствительность микроскопии при обследовании 358 пациентов составила 89% [Drake L.A. и соавт., 1997].

В целом, обобщая проведенные за рубежом в последнее время исследования, можно заметить, что процент положительных результатов традиционной КОН-микроскопии колеблется между 40 и 70% [Lilly K.K. и соавт., 2006]. Этот процент может быть обратно пропорционален размеру выборки, при снижении которого вероятность включения в группу случаев клинически очевидного онихомикоза повышается.

В исследовании Grover M. и соавторов процент положительных результатов микроскопии образцов ногтей от 120 больных с заподозренным онихомикозом составил 82,5, при этом сочетание микроскопии и посева дало незначительный прирост-до 85,8% [Grover С. и соавт., 2003].

Gupta AK и соавт. позднее оценили процент положительных результатов в 77,4% (на группе из 62 больных онихомикозом, обусловленном Т. rubrum [Gupta A.K. и соавт., 2007].

Исследование Weinberg J. и соавторов было посвящено сравнению регламентированных методик диагностики онихомикоза, люминесцентной микроскопии с белым калькофлуором и биопсии ногтя. Обследовав 105 больных с подозрением на онихомикоз, авторы установили чувствительность микроскопии в.

80%, при ее положительной прогностической ценности в 88%, а отрицательнойв 58% [Weinberg J.M. и соавт., 2003].

Ключевое зарубежное исследование, оценивающее чувствительность световой микроскопии и различных вариантов ее использования при онихомикозе, проведено Lilly К. и соавторами в США. Сравнивая результаты КОН-микроскопии, проводимой непосредственно лечащим врачом-дерматологом, специалистом в лаборатории, с результатами КОН-микроскопии с ДМСО, контрастированием с хлоразоловым черным, гистопатологическим исследованием и различными методиками культивирования, авторы обследовали 204 пациента, назначая все вышеперечисленные тесты в каждом случае. Чувствительность (истинно положительные результаты) оценивалась при наличии положительных результатов любых 3 тестов. Наиболее чувствительньш методом оказалась гистопатология биоптата ногтя (98,8%). Чувствительность микроскопии, выполняемой лечащим врачом-дерматологом, была достаточно высокой, составляя 90,9%, при этом чувствительность диагностики специалистами лаборатории была ниже, составляя 87,8%. Оба последних варианта микроскопии были найдены наиболее экономически эффективными [Lilly K.K. и соавт., 2006].

Индийские авторы оценили чувствительность световой микроскопии в 64%, сравнивая ее с гистологической окраской PAS (наилучший результат) и культивированием (худший результат) в лабораторной диагностике заподозренного онихомикоза [Shenoy М.М. и соавт., 2008]. Другое индийское исследование отметило более высокие показатели при клинически диагностированном онихомикозе — 81,8% положительных результатов микроскопии [Veer Р. и соавт., 2007]. Иранские авторы оценили чувствительность световой микроскопии в 76,5%, что практически не отличалось от чувствительности гистопатологического исследования, но достоверно превышало показатели посева [Karimzadegan-Nia M. и соавт., 2007].

Поскольку результаты световой микроскопии воспринимаются визуально, их интерпретация субъективна и в большой степени зависит от квалификации исследователя. Кроме того, как и при посеве, важна квалификация врача, берущего материал для исследования. Это может отражаться на качестве диагностики. Так, Arnold В. и соавторы установили разброс положительных результатов в 55−85% между 4 разными специалистами [Arnold В. и соавт., 2005].

D. Ellis и соавторы, проанализировав результаты работы 83 австралийских лабораторий, указывают, что процент положительных результатов при световой микроскопии при больших объемах работы варьирует в пределах 10−40%. При этом опрос сотрудников лабораторий показал, что там, где процент выявляемое&tradeонихомикоза оказывался выше, увеличивалось время работы с каждым образцомдо 20−30 мин. [Suhonen R. и соавт., 1999].

В.М. Рукавишникова, анализируя опыт отечественных и зарубежных авторов до 2000 г., приводит показатели достоверности микроскопии для микозов стоп в целом, оценивая их в 70−80%. При этом рекомендуется просматривать «не менее 3−4 препаратов с каждого патологического участка» [Рукавишникова В.М., 2003].

Несмотря на продолжительное отсутствие аналитических работ, посвященных точности лабораторной диагностики онихомикозов, отечественные авторы всегда отмечали частую недостаточность однократного микроскопического исследования. Это нашло отражение в рекомендациях повторных (нередко трехкратных) микроскопий при дерматомикозах и онихомикозах. Г. И. Суколин и соавторы в 2004 г. проанализировали 182 случая онихомикоза, в каждом из которых неудача первичного микроскопического исследования сопровождалась направлением на повторную микроскопию. В первом исследовании положительный ответ был получен в 65%, во втором — в 17%, в третьем — в 11% и в четвертом — в 6% [Суколин Г. И. и соавт., 2004]. Показатель первого исследования может быть приравнен к чувствительности первичной микроскопии.

В работе A.A. Туманян и соавторов указывается, что для получения положительного результата микроскопии в ряде случаев онихомикоза могут потребоваться глубокие чистки гиперкератоза, а двухкратное стандартное микроскопическое исследование оказывается безрезультатным [Туманян A.A. и соавт., 2006].

Контрастирование препаратов и «усилители» микроскопии.

Чтобы улучшить визуализацию микроскопических препаратов (и тем самым — повысить чувствительность микроскопии как визуального определения возбудителя), используют разные методики. Простейшие из них — добавление в препарат чернил, анилиновых красителей или других составов, затемняющих/контрастирующих элементы гриба [Brodell R.T. и соавт., 1991; Feuilhade de Chauvin М., 2005]. Более сложная методика — использование флюоресцентных красителей (методика нередко обозначается как KONCFLU, где КО — от КОН, N — ноготь, С — указание на центрифугирование после растворения в щелочи, а FLU — использование флуоресцентного красителя, например белого калькофлуора или бланкофора), однако при этом нужен люминесцентный микроскоп [Ellis D.H., 1999; Richardson M.D., 1990].

Итальянские авторы провели оценку двух дополнительных методов окраски — хлоразола черного Е, окрашивающего хитин клеточных стенок грибов (методика иногда обозначается как KONCBE) и акридинового оранжевого. Используя в качестве референтного метода посев материала из ногтей, исследователи не нашли существенных отличий в чувствительности и специфичности этих методик [Panasiti V. и соавт., 2006].

В то же время, по данным Lilly К. и соавторов, чувствительность микроскопии с использованием хлоразолового черного (94,3%) уступала только гистопатологической окраске препаратов. Использование диметилсульфоксида (ДМСО) при микроскопии оказалось менее эффективным, чем традиционная методика без контрастирования. [Lilly K.K. и соавт., 2006].

По данным Lawry М, Haneke Е и соавторов, использование черного хлоразола или калькофлуора дало сходные показатели чувствительности в 53%, превосходя таковые для традиционной микроскопии [Lawry М.А. и соавт., 2000].

Gupta AK. и соавторы, сравнивая усиленную белым калькофлуором микроскопию с одним из вариантов ПЦР и культивированием отметили, что положительные результаты были получены только в 31,3% (26 из 83) образцов ногтей с подтвержденным онихомикозом [Gupta A.K. и соавт., 2008]. Недостатки флюоресцентного усиления с калькофлуоровым белым, сводящиеся к пропущенным на фоне традиционной микроскопии положительным результатам и низкой чувствительностью, были выявлены в работах Arnold В. и соавторов [Arnold В. и соавт., 2005], а также Sherer W. и соавторов [Scherer W.P., Kinmon К., 2000].

Общий процент положительных результатов при использовании калькофлуора и других красителей может составлять 20−72% [Lilly K.K. и соавт.,.

2006]. Однако большой разброс результатов [Scherer W.P., Scherer M.D., 2004], наблюдаемый и при традиционной световой микроскопии, затрудняет оценку целесообразности использования конкретных методик.

Биопсия и гистологические методы окраски ногтя.

Для визуализации грибковых элементов в материале из ногтей возможно использование гистологических методов окраски, например, PAS/ШИК (periodic acid Schiff, Шифф-йодистая кислота). В зарубежных публикациях этот тест называют также KONCPA, т. е. КОН-микроскопия с центрифугированием и дополнительной обработкой ШИК [Liu H.N. и соавт., 1993]. Возможна также биопсия ногтя с изучением гистопатологических препаратов ногтевого ложа и пластины (может обозначаться как PATHPAS) [Lawry M.А. и соавт., 2000].

По данным Liu H. и соавторов (Тайвань), использование дополнительной гистологической окраски PAS при онихомикозе дает процент положительных результатов 77%, а биопсии ногтя — 60% (на фоне 16% у посева и 44% у микроскопии) [LiuH.N. и соавт., 1993].

Shenoy M. и соавторы оценили точность гистологической окраски соскобов и фрагментов ногтей при онихомикозе методом PAS. Чувствительность была оценена в 90% (76 положительных образцов от 101 пациента с подозрением на онихомикоз), что превысило показатели световой микроскопии (54 положительных результата) и посева (35) [Shenoy M.M. и соавт., 2008].

По данным Lawry M., Haneke Е. и соавторов, биопсия ногтя с гистопатологическим исследованием PAS показала чувствительность 85%, по сравнению с дополненной PAS окраской КОН-микроскопией (57%) [Lawry М.А. и соавт., 2000].

Suarez M. и соавт. в 1991 г. нашли, что гистологическое исследование фрагментов ногтевой пластины по выявляемости онихомикоза превосходит посев [Suarez S.M. и соавт., 1991]. В американском исследовании 2001 г. гистопатологическое исследование ногтей у 36 больных в каждом случае дало положительный результат, существенно превзойдя показатели микроскопии (44% положительных результатов) и культивирования (33%) [Borkowski Р. и соавт., 2001]. С другой стороны, в итальянской работе того же года гистопатологическое исследование ногтей у 172 пациентов с подозрением на онихомикоз дало 54,6% положительных результатов, а световая микроскопия — 59,3% [Gianni С. и соавт., 2001].

В немецком исследовании 2003 г. дополнительная окраска PAS позволила выявить наибольшее число (182) из 387 образцов пораженных ногтей, по сравнению с традиционной микроскопией (156) и посевом (100). Процент положительных результатов гистологического исследования составил 41,6 [Reisberger Е.М. и соавт., 2003]. Cabrai А. и соавторы нашли, что специальная подготовка биопсийного материала и окраска PAS и гематоксилином обеспечила выявление 61% положительных результатов при изучении 990 биоптатов патологически измененных ногтей [Cabrai А. и соавт., 2006].

По данным Weinberg J. и соавторов, биопсия ногтевого ложа является наиболее чувствительным (92%) методом лабораторной диагностики онихомикоза, достоверно превосходящим традиционную микроскопию и посев [Weinberg J.M. и соавт., 2003].

Использование дополнительной окраски PAS может повысить чувствительность лабораторной диагностики онихомикоза до 47−100%. Однако в исследовании Lilly К. и соавторов использование окраски PAS, несмотря на лучшие показатели чувствительности, оказалось наименее экономически эффективным [Lilly К.К. и соавт., 2006]. Окраска биопсийного материала из ногтей метенамином и серебром по Гомори дает достоверно большее число положительных результатов, чем PAS [D'Hue Z. и соавт., 2008].

Перечисленные гистологические методики дают некоторый, а в ряде случаев — существенный прирост точности исследования по сравнению с традиционной световой микроскопией, однако едва ли могут быть использованы массово в повседневной практике дерматолога. Они требуют дополнительных реактивов, квалификации персонала лаборатории и времени на приготовление препарата, аналогичных гистологическим исследованиям. Достоинством биопсии ногтя и гистопатологического исследования следует признать их использование в дифференциальной диагностике с ониходистрофиями [Machler B.C. и соавт., 1998]. К недостаткам гистологической диагностики относится ее неспособность устанавливать видовую или хотя бы групповую принадлежность возбудителей [Feuilhade de Chauvin M., 2005; Herbst R.A. и соавт., 2003; Reisberger Е.М. и соавт., 2003]. Кроме того, окраска PAS может давать отрицательный результат на ранних стадиях онихомикоза, до поражения ногтевого ложа, или при небольшом количестве материала [Suarez S.M. и соавт., 1991].

Микологическое (культуральное) исследование.

Микологическое исследование, включающее посев материала из ногтей на специальную среду с выделением и идентификацией выросшей культуры, входит в число регламентированных методик диагностики онихомикоза, указанных клиническими рекомендациями в разных странах [Клинические рекомендации (под ред. Кубановой A.A.), 2007; Katz H.I., 1998; Roberts D.T. и соавт., 2003; Seebacher С. и соавт., 2007].

Основания и задачи культурального исследования.

В качестве оснований для проведений культуральной диагностики приводятся «определение вида возбудителя с целью уточнения диагноза и выбора системного антимикотика» [Клинические рекомендации, 2007], т. е. оптимизации этиотропной терапии [Сергеев Ю.В., 1998]. Задачи микологического исследования могут включать определение возможности смешанной инфекции, подтверждение грибковой инфекции перед началом продолжительного лечения антимикотиками, чтобы исключить негрибковую патологию, а также с эпидемиологической целью для выявления контактов [Denning D.W. и соавт., 1995].

Классификация каждого случая онихомикоза согласно Международной классификации болезней 10 пересмотра предусматривает отнесение его к группе дерматофитии (В35.1), кандидоза (В37.2) или поверхностного микоза другой этиологии (В36.8), что уже предусматривает этиологический диагноз, средствами регламентированных методов достижимый только с помощью культивирования и идентификации возбудителя [Фармакотерапия микозов, 2003].

Представления о возможности замены микологического исследования при онихомикозе назначением тех или иных системных антимикотиков благодаря широте их спектра действия, высказанные в конце 1990;х гг., остаются дискуссионными в силу различия данных, как описывающих чувствительность разных этиологических групп грибов к разным антимикотикам, так и о значении этих грибов как возбудителей онихомикоза [Gupta А.К., Gregurek-Novak Т. и соавт., 2001; Gupta A.K. и соавт., 2003].

Важным основанием для выполнения культурального исследования является общий прирост чувствительности диагностики, то есть повышение выявляемое&tradeонихомикоза за счет посева на фоне отрицательных результатов микроскопии [Разнатовский К.И. и соавт., 2006; Капе и соавт., 1997; Lawry М.А. и соавт., 2000].

Современные средства микологической диагностики.

Традиционным способом микологической диагностики в дерматологии остается посев на среду Сабуро, содержащую глюкозу (40 г на 1 л в традиционном составе), пептон и агар [Лещенко В.М., 1982]. Другие классические среды и методики культивирования на практике используются редко.

На среде Сабуро растут не только дерматофиты, но также плесеневые и дрожжевые возбудители онихомикоза, и многие контаминанты, в том числе бактериальные. В практику микологических лабораторий в России и за рубежом чаще входит использование добавок антибактериальных средств и циклогексимида, подавляющего рост быстрорастущих плесневых контаминантов. Вместе с тем, циклогексимид может подавлять рост ряда истинных возбудителей онихомикоза, в связи с чем рекомендуется посев материала одновременно на 2 среды — с циклогексимидом и без него [Kane J. et Summerbell J., 1997; Сергеев А. Ю., 2000]. Это может существенно удорожать первичную диагностику онихомикоза.

Рост культуры дерматофитов может ожидаться через неделю от начала культивирования при комнатной температуре, плесневые и дрожжевые возбудители и контаминанты могут дать росту уже на 2−3 сутки. Тем не менее, существование медленно растущих видов и штаммов (например, на фоне терапии) грибов приводит к необходимости выдерживать культуры в термостате до 4 недель, и только после данного срока роста давать заключение об отсутствии роста. Это повышает нагрузку на персонал лаборатории, поскольку со 2 недели культуры надо проверять дважды в неделю [Сергеев А.Ю., 2000].

Диагностическая ценность традиционного культивирования.

В целом, по результатам анализа ранее проведенных за рубежом крупных исследований, процент положительных посевов при онихомикозе составляет 1760% [Lilly К.К. и соавт., 2006].

В американском исследовании Weiberg J. и соавторов, включавшем 105 больных, чувствительность посева была оценена в 59%, при положительной прогностической ценности в 90%, а отрицательной — в 43% [Weinberg J.M. и соавт., 2003].

В международном исследовании Lawry М. и Haneke Е. (п=63) чувствительность культивирования на среде Сабуро с антибиотиками составила 32%, а на среде Литтмана — 23% [Lawry М.А. и соавт., 2000]. Канадские исследователи оценили процент положительных посевов на Т. rubrum при онихомикозе в 22,6% [Gupta A.K. и соавт., 2007]. В Пакистане рост культур отмечался в 16% (8 из 50 образцов) случаев клинически подтвержденного онихомикоза [Malik N.A. и соавт., 2006]. В Ливане культуры были получены в 54,3%) при обследовании 772 больных [El Sayed F. и соавт., 2006].

Индийцы Veer Р. и соавторы отмечали рост культуры в 48,8% случаев (43 из 88 образцов ногтей при клинически диагностированном онихомикозе) [Veer Р. и соавт., 2007]. По данным других авторов из этого региона, рост культуры фиксировался только в 37,6% [Gupta М. и соавт., 2007]. Shenoy М. М. и соавторы оценили чувствительность посева и культивирования при заподозренном онихомикозе в 42% (рост 35 культур из 101 образца ногтей) [Shenoy М.М. и соавт., 2008].

В польском исследовании посевы от 579 пациентов дали положительный результат в 23,3% случаев, при этом 20,4% образцов не дали роста, несмотря на положительный результат микроскопии [Maleszka R. и соавт., 2005]. В исследовании турецких авторов по эпидемиологии онихомикозов в Стамбуле, от 1840 больных с заподозренным онихомикозом было выделено 759 культур (41,2%) [Kiraz М. и соавт., 1999].

Исследование, проведенное в Тунисе, показало высокий совокупный уровень выявляемости онихомикоза с помощью микроскопии и культивирования (67%>), однако при этом было отмечено, что достаточно высокая чувствительность посева может фиксироваться только для поражений кистей, обусловленных Candida spp. При дерматофитии ногтей на ногах, составляющей большинство современной картины онихомикоза, по чувствительности культивирование существенно уступало микроскопии [Anane S. и соавт., 2001].

В исследовании A.A. Кубанова и Н. В. Фриго (2007) г., сообщается о 78,8%) выделяемости культур из пораженных ногтей (п=330, 96,2% образцов ногтей стоп). Однако при этом указан достаточно большой перечень сред (включая пересевы) и методик культивирования (3 температурных режима), подготовки материала (гомогенизация бормашиной и алмазными фрезами), недоступный в стандартных условиях большинству лабораторий. Кроме того, обращают на себя внимание выделения множественных культур из одного образца материала (38% ассоциаций дерматофитов), чего не сообщалось в каких-либо иных исследованиях, посвященных диагностике онихомикозов [Кубанов A.A., Фриго Н. В., 2007].

В оценке диагностической ценности посевов при онихомикозе приходится принимать во внимание расхождение результатов, получаемых исследователями. Так, канадские исследователи установили, что в двух микологических лабораториях, куда направлялись образцы материала от одних и тех же пациентов (ir=85), одинаковые ответы лаборатории были получены только в 37,6% случаев. Вопросы воспроизводимости результатов посева ставят вопрос о целесообразности применения данного метода в диагностике онихомикозов и принятии терапевтического решения [Scherer W.P. и соавт., 2004].

Диагностическая ценность посева при онихомикозе во многом зависит от правильного сбора материала, техники культивирования и интерпретации полученного результата [Капе J., 1997; Сергеев А. Ю., 2000], [Foulet F., Cremer G., 2003]. Поэтому попытки усовершенствовать существующую систему диагностики онихомикозов регламентированными методами основываются на поиске способов улучшения данных алгоритмов.

Требования к сбору материала и возможности его модификации.

Чтобы улучшить выделение культур из образцов ногтей от больных онихомикозом, предлагаются разные методики сбора материала. Наиболее рациональным представляется клинический подход, предлагающий, исходя из стандартного и наиболее доступного набора оборудования (скальпель, ножницы-кусачки, кюретка), собирать материал из разных областей ногтя, в зависимости от клинической формы онихомикоза. Общий принцип — брать материал из тех.

25 частей ногтя, где наиболее вероятно существование активной (жизнеспособной и дающей рост в культуре) колонии грибов [Сергеев А.Ю., 2000]. Исследование, сопоставлявшее выделяемость культур при сборе материала дерматологами, врачами общей практики или подологами, выявило существенные различия результатов. Наиболее высокий процент положительных посевов, независимо от техники культивирования, был зарегистрирован при сборе материала подологами (43%), по сравнению с дерматологами (37%) и врачами общей практики (28%). Это показывает важность владения техникой сбора материала из ногтей [Jennings М.В., Rinaldi M.G., 2003].

Предложены различные варианты усовершенствования техники сбора материала из ногтей, связанные с использованием другого оборудования. Известно, что A.M. Ариевич использовал бормашину для сбора материала из ногтей [Ариевич A.M., Шецирули JI.T., 1972]. Американские авторы в 1972 г. использовали специальное перемалывающее устройство для гомогенизации фрагментов ногтевых пластин, собранных традиционным способом [Luedemann G.M., LeBreton Е., 1972]. Позднее немецкие авторы использовали подологические фрезы для сбора материала на микологическое исследование, повторяя его при необходимости [Blecher Р., Korting Н.С., 1993]. Было предложено также использовать менее травматичные стоматологические кюретки [Stiller M.J. и соавт., 1993].

Современные авторы пытались оценить выявляемость онихомикоза в культуре за счет модификаций техники сбора материала. Пакистанские авторы сравнили традиционный соскоб и сбор фрагмента ногтя кусачками с использованием микродрели (т.е. бормашины), и установили прирост выявляемости всего в 4% (2 из 46 случаев). При этом в образцах, собранных бормашиной, отмечался более обильный рост. Однако большинство культур выявило Candida spp., без положительного результата микроскопии [Qureshi H.S. и соавт., 2004].

Израильские авторы сравнили выделяемость культур от 194 больных онихомикозом (дистальная форма) при сборе материала соскобом из-под ногтевой пластины и с помощью бормашины, направленной также под ногтевую пластину. Чувствительность культивирования достоверно возрастала при любом методе сбора материала, если образец брали из наиболее проксимального участка ногтя. При этом использование бормашины достоверно повышало выделяемость [Shemer А. и соавт., 2008].

Японские исследователи применили бормашину для сбора материала из проксимальных участков ногтя у 33 больных с онихомикозом с проксимальной формой или дистальной рецидивирующей формой. Это дало рост культур в 81,6% случаев [Mochizuki Т. и соавт., 2005].

Несмотря на возможные преимущества в выделяемости материала из ногтей при использовании бормашин и вращающихся фрез, массовое оснащение ими микологических лабораторий, предназначенное, по сути, только для диагностики онихомикоза, представляется нецелесообразным — в силу как сложности установки оборудования, так и его обслуживания, утилизации ногтевой инфицированной пыли, защиты персонала и стерилизации.

Попытки совершенствования и стандартизации культивирования.

Совершенствование общих методов культивирования в медицинской микологии привело к серийному выпуску готовых сред, ориентированных на выделение конкретных групп возбудителей. В дерматомикологии для диагностики онихомикоза такими средами являются агары типа Mycosel и Mycobiotic, содержащие среду Сабуро с добавками антибиотиков и/или циклогексимида [Kane J., 1997]. Одной из последних попыток усовершенствовать и обеспечить массовую культуральную диагностику онихомикозов, является разработка так называемой тестовой среды для дерматофитов (DTM, dermatophyte test medium), содержащей агар Сабуро с антибиотиками, циклогексимидом и индикатором роста культуры дерматофитов. Внедрение среды DTM произвело на свет концепцию «офисного культивирования», при котором можно держать одноразовые чашки с посевами не в специальной лаборатории, а непосредственно в кабинете дерматолога, поскольку рост идет при комнатной температуре [Elewski В.Е. и соавт., 2002; Jennings M.B. и соавт., 2003; Pariser D., Opper С., 2002].

Анализ посевов от 100 больных с подозрением на онихомикоз, проведенный американскими исследователями в 2000 г. показал, что только 50% положительных результатов на системе DTM совпадает с результатами традиционного культивирования. Авторы поставили под вопрос использование данного теста как стандарта в диагностике онихомикоза, в частности — у пожилых больных [Scherer W.P. и соавт., 2000].

По данным другого исследования в США, посевы от 670 больных с клиническими проявлениями онихомикоза стоп дали 51% положительных посевов на среде DTM и 44% - в централизованной микологической лаборатории, используя регламентированные стандарты, при этом совпадение результатов отмечалось в 68% случаев [Elewski В.Е. и соавт., 2002]. Парное культивирование от 975 пациентов из многоцентрового американского исследования также установило достоверное 70% соответствие между посевами на DTM и традиционные среды. Авторы отметили дешевизну использования среды DTM и офисного культивирования, по сравнению с централизованной лабораторией (в экономических условиях американской системы здравоохранения) [Pariser D. и соавт., 2002].

Обследование 184 больных сахарным диабетом в США дало результаты посева на среде DTM в 55%, а в централизованной лаборатории — 42% [Rich Р. и соавт., 2003].

В крупном (п=204) многоцентровом исследовании Lilly К. и соавт. (2006) чувствительность культивирования на среде DTM составила 57,3%. Культивирование на специальном агаре (с хлорамфениколом и гентамицином или хлорамфенилом с циклогексимидом) показало чувствительность в 19,3%.

Использование среды DTM оказалось менее эффективным экономически [Lilly К.К. и соавт., 2006].

Этиология онихомикозов и интерпретация результатов микологической диагностики.

Сведения о современной этиологической структуре онихомикозов важны не только для выбора противогрибковых средств, но и для интерпретации результатов лабораторной диагностики.

Summerbell R. и соавторы установили, что при дерматофитии ногтей чувствительность микроскопии составляет 73,8%, а при недерматофитном онихомикозе — 67,2%. Культивирование материала из ногтей имеет чувствительность 74,6% для обеих групп возбудителей. Существующие схемы интерпретации результатов микологической диагностики онихомикоза основаны на установлении фактов повторного или множественного выделения недерматофитов из ногтей, для признания их возбудителями онихомикоза. По данным Summerbell R. и соавторов, двухкратное выделение культуры гриба-недерматофита на фоне хотя бы однократной положительной микроскопии имеет чувствительнось 59,5% и специфичность 100% в случае истинной недерматофитной инфекции. При этом, если использовать другой алгоритм интерпретации и считать диагностически значимым рост любого недерматофита в отсутствие роста дерматофитов и при положительном результате микроскопии, то чувствительность составит 53,6%, а специфичность — 70,3%. Если считать диагностическим вообще любое выделение любого гриба из ногтей, то чувствительность обнаружения недерматофитного онихомикоза составит 60,7%, но специфичность — лишь 42%. Обнаружение смешанных инфекций (рост недерматофитов на фоне дерматофитии ногтей), по мнению авторов, составляет не более 20,2% [Summerbell R.C. и соавт., 2005].

В ряде случаев нерешенные вопросы этиологии и патогенеза ставят преграду на пути оценки результатов микологической диагностики. Так, до конца не решен вопрос интерпретации выделения Malassezia spp. из измененных ногтей [Chowdhary А. и соавт., 2005]. Аналогичные вопросы встают перед исследователями, сталкивающимися с выделением из ногтей тех видов Candida (например, С. parapsilosis), которые часто входят в состав микробиоты кожи и области гипонихия [Figueiredo V.T. и соавт., 2007; Segal R. и соавт., 2000].

Исходные критерии, предложенные М. Walshe и М. English в 1966 г. [Walshe М.М., English М.Р., 1966] для оценки однократного микологического исследования при онихомикозе, предусматривали [Walshe М.М. и соавт., 1966] посев нескольких разных фрагментов ногтя (образцов) на одну или несколько емкостей со средой, с последующим подсчетом вырастающих колоний. При посеве 20 фрагментов на 1 пациента выделение не менее 5 культур одного и того же плесневого гриба считалось диагностическим для недерматофитной инфекции. Трудность реализации данной методики долгое время затрудняла ее оценку. Однако проведенное в 2001 г. канадское исследование (п=473) показало, что критерии Walshe и English справедливы только в 23,2% случаев [Gupta А.К., Cooper Е.А. и соавт., 2001].

Таким образом, до настоящего времени сохраняются разногласия в этиологической интерпретации данных микологического исследования. Отсутствие однозначных критериев для подтверждения недерматофитной инфекции при однократном сборе материала и микологическом исследовании осложняет диагностическое заключение лаборатории и рекомендации по выбору системных антимикотиков для лечащего врача. В этих случаях до настоящего времени приходилось опираться на специальные алгоритмы, в частности — на предложенную Сергеевым А. Ю. в 2000 г. схему MC [Сергеев А.Ю., 2000].

Вариации результатов культивирования и этиологии онихомикоза.

Соотношение как основных этиологических групп возбудителей онихомикоза — дерматофитов, дрожжевых и недерматофитных плесневых грибов, так и отдельных видов нередко оказывается разным в разных исследованиях. Прежде всего, обращает на себя внимание географическая вариация результатов.

В многоцентровом исследовании А. Ю. Сергеева и соавт. (1997;2001), включавшем 3075 выделенных культур от 12 617 пациентов, доля дерматофитов при онихомикозе составила для ногтей стоп — 79,9%, ногтей кистей — 38,4% и в среднем 73,3%. Для Candida spp. эти показатели составили 5,3%, 44,8% и 9,6%, а для плесневых грибов — 14,3%, 16,5% и 16,9% - соответственно. Доля Т. rubrum в этиологии дерматофитии ногтей составила 93,3%, Т. mentagrophytes — 6,0% [Сергеев А.Ю. и соавт., 2002].

В работе A.A. Кубанова и Н. В. Фриго (п=330) дерматофиты от больных из разных регионов России были выделены в 91,1% случаев, Candida spp. — 15,4%, а плесневые грибы — в 13,5%, при этом отмечалось значительное число смешанных инфекций/посевов. Доля Т. rubrum в структуре дерматофитии ногтей составляла 70,5%, Т. mentagrophytes var. interdigitale — 15,25% [Кубанов A.A., Фриго Н. В., 2007].

В работе польских исследователей частота выделения Т. rubrum при онихомикозе составила 46% [Maleszka R. и соавт., 2005]. В Болгарии обследование 390 больных с клиническим диагнозом онихомикоза дало рост культур дерматофитов в 41,2% случаев, при этом доля Т. rubrum составляла 73,6%, а Т. mentagrophytes — 24,5% [Meric М. и соавт., 2004]. В Нидерландах обследование 861 больного с подозрением на онихомикоз выявило 77,5% долю Candida spp. при поражениях ногтей кисти, по сравнению с 9,9% на стопах. Более 85% случаев онихомикоза на стопах было вызвано дерматофитами, доля Т. mentagrophytes в общей этиологии составляла 11,8% [Staats С.С., Korstanje M.J., 1994].

Испанские авторы отметили, что частота выделения недерматофитных плесневых грибов при онихомикозе (п=196) не превысила 15%, в основном выделялись Scopulariopsis и Aspergillus [Garcia-Martos Р. и соавт., 2000]. Ранее проведенное испанское исследование в Кордове у 93 больных выявило только 18,8% культур дерматофитов, что ненамного превышало частоту выделения плесневых грибов (17,2%) [Velez А. и соавт., 1997].

В южных районах Греции обследование больных онихомикозом с преимущественным поражением кистей выявило 52,4% встречаемость культур Candida spp., при 41% для дерматофитов и 6,51% - для плесневых грибов [Rigopoulos D. и соавт., 1998].

В Турции для обследования 1146 больных онихомикозом использовали повторное культивирование с целью уточнения этиологии. Дерматофиты были выделены в 48% случаев, Candida spp. — в 41%, плесневые грибы в 9% [Hilmioglu-Polat S. и соавт., 2005].

Ливанские авторы, в течение 5 лет изучая этиологию онихомикоза, обследовали 772 больных, выделив культуры дерматофитов в 77,1% случаев, Candida spp. — в 18,9% и плесневых грибов — в 0,9%. Распределение дерматофитов было следующим: Trichophyton mentagrophytes — 36%, Т. rubrum — 27.5%, — Т. tonsurans 26% [El Sayed F. и соавт., 2006].

В Объединенных Арабских Эмиратах обследовние 151 больного с онихомикозом кистей или стоп выделили 78 культур грибов, из них 63% составляли Candida spp., доля дерматофитов составила 28%, плесневых грибов -9% [Nsanze Н. и соавт., 1995]. В Марокко от 4940 больных с онихомикозом было выделено 61,46% культур дерматофитов, 25,5% культур Candida spp. и 1,53% культур плесневых грибов. Среди выделенных видов лидировал Т. rubrum (83,6%), затем Т. violaceum (9%) и Т. mentagrophytes (6,9%), а среди плесневых грибов — Fusarium spp. (47%) и Scopulariopsis brevicaulis [Boukachabine К., Agoumi А., 2005]. В Ливии обследование 648 больных с поражениями кистей выявило 96% долю Candida spp. в этиологической структуре онихомикоза преимущественно у женщин. У мужчин из этой же локализации выделялись дерматофиты в 80% [Ellabib M.S. и соавт., 2002]. В Пакистане обследование 100 больных с микологически верифицированным онихомикозом (поражение кистей у 50%) показало рост Candida spp. в 46% посевов, а дерматофитов — в 43% (доля Т. rubrum в общей этиологии 31%, Т. mentagrophytes 4%) [Bokhari М.А. и соавт., 1999].

В исследовании Veer Р. и соавторов (Индия) рост дерматофитов в 43 полученных посева отмечался в 26 случаях (29,5%), плесневых грибов — в 12 случаях (13,6%), а Candida spp. — в 5 (5,6%) [Veer Р. и соавт., 2007]. По сведениям Gupta М. и соавторов, в Индии дерматофиты и Candida spp. выделялись с равной частотой (40,8%), при 18,6% росте недерматофитных плесеней. При этом лидировали Trichophyton rubrum (32,6%) и Т. mentagrophytes (6,1%), Т. verrucosum — 2,1% а среди плесневых грибов — Aspergillus spp. (6,1%) [Gupta М. и соавт., 2007]. Другое индийское исследование с 302 больными с подозрением на онихомикоз показало долю выделенных дерматофитов в 49,5%, а Candida spp. -40,4%, плесневых грибов — 10,1%. Лидирующими видами были Т. rubrum среди дерматофитов и С. albicans среди дрожжей [Sarma S. и соавт., 2008].

В Индонезии, по данным 3 исследований, случаи онихомикоза на кистях характеризовались выделением Candida spp. в 50,1% культур, дерматофитов — в 26,2%, плесеней — в 3,1% [Bramono К., Budimulja U., 2005].

В Малайзии из 879 образцов ногтей от больных с онихомикозом было выделено 490 культур, среди них 36,1% культур дерматофитов (115 Т. rubrum и 59 Т. mentagrophytes), 35,5% - плесневых грибов, 26,5% - Candida spp [Ng K.P. и соавт., 1999].

На Тайване обследование 375 больных с онихомикозом выявило дерматофиты в 60,5% культур, Candida spp. в 31,5%, плесневые грибы в 8%. Соотношение вероятностей по недерматофитному онихомикозу для ногтей кистей составляло 5,04 по сравнению с ногтями стоп [Chi С.С. и соавт., 2005]. Обследование 182 больных онихомикозом в этом же регионе выявило культуры дерматофитов в 101 случае (55,5%), Candida spp. в 36,3%, а плесени в 8,2%.

Wang S.H., Chi C.C., 2005]. В Гонконге в 1997 г. (ныне Китай) изучение 2382 образцов ногтей от больных с подозрением на онихомикоз (48,2% образцов из кистей) выявило совокупную встречаемость дерматофитов и Candida spp. в 97%, при этом на фоне положительной микроскопии дерматофиты выделялись в 29,1%, а дрожжи — в 19,4% случаев [Каш K.M. и соавт., 1997].

Крупное (п=1199) многоцентровое канадское исследование в 2000 г. установило 90,5% долю дерматофитов в этиологии онихомикоза (94,8% составили поражения ногтей стоп), при 7,8% доле недерматофитных плесеней и 1,7% Candida spp. Для ногтей на кистях доля Candida spp. составляла уже 29,2% [Gupta A.K. и соавт., 2000]. До этого региональное исследование А.К. Gupta показало 92,9% выделение дерматофитов от 141 больного онихомикозом стоп, при этом Candida spp. выделялись в 2,8% случаев, а плесени — в 4,3% [Gupta A.K. и соавт., 1997].

В США многоцентровые исследования с использованием среды DTM и традиционного культивирования установили частоту выделения дерматофитов в 93% [Elewski В.Е. и соавт., 2002; Pariser D. и соавт., 2002].

В Бразилии частота выделения дерматофитов в от больных онихомикозом с преимущественным поражением ногтей кисти (п=512 из 976 обследованных) составила 12,99%, a Fusarium spp. — 8,19% [Brilhante R.S. и соавт., 2005]. Другое бразильское исследование определило выделяемость Candida spp. в 82%, дерматофитов в 13,4%, а плесеней — 1% [Pontes Z.B. и соавт., 2002].

Различия в оценке результатов иногда могут быть обусловлены включением особых популяций больных. Так, в подгруппе (п=450) больных старшего возраста американские исследователи не наблюдали роста культуры только в 23,1% случаев. При этом выделение одного вида гриба выявлено в 46,4% случаев, а смешанные инфекции — в 30,4% [Scherer W.P. и соавт., 2001].

В подгруппе больных сахарным диабетом (п=184) стандартные методики культивирования выявили 91% культур дерматофитов [Rieh Р. и соавт., 2003]. По данным Chi С. и соавт., соотношение шансов в пользу недерматофитного онихомикоза при сахарном диабете составляет 9,8 [Chi С.С. и соавт., 2005].

Таким образом, различные факторы могут влиять на результаты микологического исследования и структуру этиологии онихомикозов. К числу прогнозируемых факторов можно отнести локализацию поражения (на кистях или стопах), интерпретацию результатов культивирования, иногда наличие предрасполагающего состояния. Однако значительная часть различий в результатах этиологических исследований не поддается однозначному объяснению. Это с высокой вероятностью обусловливается несовершенством культуральной диагностики и значительными погрешностями в оценке ее результатов. В большинстве случаев это связано с нерешенностью принципов или технологической невозможностью дифференциальной диагностики между истинным недерматофитным онихомикозом и контаминацией [Сергеев А.Ю. и соавт., 2002].

Вместе с тем, анализ этиологической структуры дерматофитии показывает почти универсальное преобладание двух видов — Т. rubrum и Т. mentagrophytes var. interdigitale. Это открывает перспективы для видоспецифичной диагностики онихомикозов, ориентированной, прежде всего, на два данные вида.

Оценка точности диагностических методов при онихомикозе.

Оценке точности и диагностической ценности различных диагностических тестов при онихомикозе посвящено несколько крупных работ.

Среди зарубежных исследований и критических обзоров стоит отметить, прежде всего, работы Bigby М. (1998), критически оценившего принципы оценки диагностических тестов при онихомикозе [Bigby М., 1998], и Lilly К. и соавт.

2006), сравнивших точность и экономическую эффективность 7 тестов, включая различные варианты микроскопии и культивирования [Lilly К.К. и соавт., 2006].

По мнению Bigby М., среди 133 зарубежных работ, упоминающих те или иные методики лабораторной диагностики онихомикоза, только 4 публикации пригодны для расширенного анализа и в наибольшей мере удовлетворяют критериям отбора с позиций доказательной медицины [Bigby М., 1998].

Ключевым аспектом в оценке точности каждого отдельно взятого диагностического теста при онихомикозе является установление истинно положительных результатов, а также отношения вероятности (likelihood ratio) -соответствия положительных результатов диагностического теста и случаев истинного онихомикоза. В качестве критерия истинности может выступать катамнез: положительный эффект от лечения данного пациента противогрибковыми средствами — наиболее точный, но редко используемый способ оценки. Чаще в качестве критерия истинности используется положительный результат одного или нескольких других диагностических тестов, нередко в сочетании с клинической оценкой онихомикоза [Bigby М., 1998; Lawry М.А. и соавт., 2000; Lilly К.К. и соавт., 2006].

Помимо показателей отношения вероятностей, чувствительности и специфичности, в оценке диагностических тестов используются также показатели предтестовой и послетестовой вероятности, оценивающие применимость диагностической методики для оценки вероятности наличия заболевания (онихомикоза) в конкретной популяции. В случае повседневного клинического использования диагностических тестов этой популяцией являются пациенты, предъявляющие жалобы на изменения ногтей и/или имеющие те или иные клинические признаки патологии ногтей. В указанной популяции вероятность наличия онихомикоза оценивается примерно в 50% [Bigby М., 1998; Elewski В.Е., Charif М.А., 1997]. Желаемая послетестовая вероятность онихомикоза для методик лабораторной диагностики оценивается в 90−95% [Bigby М., 1998].

Вместе с тем, следует учитывать, что при анализе больших объемов данных показатели выявляемости онихомикоза рассчитываются не только относительно случаев клинически (или иным способом) подтвержденного онихомикоза. Образцы ногтей направляют в лабораторию также при заподозренном, но неясном клиническом диагнозе онихомикоза, а нередко — вообще во всех случаях измененных ногтей, для исключения онихомикоза при другой онихопатии, при других поводах для исследования ногтей. Поэтому общий процент выявляемое&tradeонихомикоза зачастую оказывается ниже 50%. В работе А. Ю. Сергеева он составил около 42% при использовании любого метода (п=14 444) [Сергеев А.Ю., 2002], у В. Е. Маликова — 48,7% (п=467) [Маликов В.Е., 2005], у R. Davies — 46% (n=3955) [Davies R.R., 1968], а по данным D. Ellis, приводимым в книге R. Suhonen и соавторов — 45% (п=32 000, анализ работы 83 австралийских лабораторий) [Suhonen R. и соавт., 1999].

Методологические особенности оценки любого нового диагностического теста при онихомикозе упираются в проблему отсутствия так называемого «золотого стандарта» — референтного метода, сравнение с результатами которого однозначно показывало бы пригодность нового теста. Указанные выше показатели чувствительности и специфичности регламентированных методик явно недостаточны для признания однократной КОН-микроскопии или культивирования «золотым стандартом» в диагностике онихомикоза. Для референтной оценки специфичности может быть использовано, пожалуй, только выделение дерматофитов в культуре, поскольку оно однозначно подтверждает факт инфекции — однако прогнозируемая частота этого события оказывается гораздо ниже желаемой.

Вместе с тем, для оценки новых высокочувствительных диагностических тестов в последнее время разработаны алгоритмы и методики, позволяющие рассчитывать точность и диагностическую ценность при отсутствии золотого стандарта, наличии так называемых «несовершенных золотых стандартов» и по сочетанию данных разных референтных исследований [Alonzo Т.А., Pepe M.S.,.

1999; Hui S.L., Zhou X.H., 1998]. К анализу лабораторной диагностики онихомикозов они до настоящего времени не применялись.

Новые методы диагностики онихомикозов.

Неудовлетворенность точностью регламентированных методик в диагностике онихомикоза, а также существующими подходами к определению этиологии была осознана достаточно давно, заставляя исследователей искать новые, альтернативные способы диагностики [Feuilhade de Chauvin М., 2005; Gupta A.K. и соавт., 2004]. Помимо молекулярно-генетических методов, предлагались иные технологии определения элементов возбудителя или его визуализации в материале из ногтей.

Поиск альтернативных способов диагностики онихомикоза.

Наиболее часто в качестве альтернативы традиционной КОН-микроскопии рассматривалось гистологическое исследование при биопсии ногтя, описанное выше.

В качестве другой альтернативы некоторое время рассматривались конфокальная микроскопия in vivo и иммуногистохимия [Feuilhade de Chauvin М., 2005; Gupta A.K. и соавт., 2004; Pierard G.E. и соавт., 1994].

Однако опыт использования данных методик ограничен. В частности, американские авторы, работа которых цитируется в обзорных статьях по диагностике, описали только 1 случай успешного применения конфокальной микроскопии в диагностике онихомикоза, никаких данных о сравнительной точности данного метода не предоставлено [Hongcharu W. и соавт., 2000]. Европейские исследователи также не дали анализа точности конфокальной микроскопии или гистохимии [Pierard G.E. и соавт., 1994]. Авторы, применившие иммуногистохимические методы (специальная окраска биоптатов) обратили внимание на трудность внедрения данного метода, потребовавшего бы специфичные реактивы на основе антител, которые в настоящее время не разработаны для ряда видов [Arrese J.E., Pierard G.E., 2003] и требуют одновременного выполнения культурального исследования [Pierard G.E. и соавт., 2006].

Одной из последних изученных за рубежом возможностей диагностики онихомикозов является использование масс-спектрометрии MALDI-TOF (матрикс-ассистируемая лазерная дезорбция-ионизация времени полета). В данной технологии получаемый спектр материала из ногтей сравнивается с уже имеющимися и зарегистрированными в специальной базе данных спектрами определенных (референтных) микроорганизмов. Уровень точности данной методики позволяет проводить видоспецифичную диагностику дерматофитов, что подтверждается сравнением с молекулярно-генетической идентификацией видов, вырастающих в культуре. Несмотря на то, что авторы отмечают сравнительную экономию при использовании расходных материалов в MALDI-TOF масс-спектрометрии по сравнению с ПЦР, представляется очевидным невозможность внедрения данной методики в широкую дерматологическую практику, что обусловлено исходной сложностью и дороговизной оборудования [Erhard М. и соавт., 2008].

Сообщения о возможности электродиагностики онихомикоза с помощью измерения электрического сопротивления ногтевых пластин, также представляют определенный интерес, однако достоверных данных по точности данной методики не существует [Суворов А.П., 2002].

Предпосылки для генодиагностики дерматофитии.

Активные поиски методов молекулярно-генетической диагностики дерматофитии начались в конце 1990;х гг. Им предшествовали работы в области генетики и геносистематики дерматофитов, позволившие во многом переоценить взгляды на таксономию семейства Arthrodermataceae, филогенез, номенклатуру и видовой состав родов Trichophyton и Microsporum [J. Guarro и соавт., 2003; Сергеев А. Ю., 2003]. Это связано с тем, что дерматофиты являются истинными.

39 патогенами и их уточненная идентификация имеет важнейшее значение в практическом здравоохранении [Сергеев Ю.В., 2003]. Главный возбудитель трихофитии, Т. rubrum, распространенный повсеместно и передающийся строго от человека к человеку, называемый «наиболее важным дерматофитом Запада» [Seyfarth F. и соавт., 2007], был включен в ближайшие планы по расшифровке грибных геномов [Дьяков Ю.Т. и соавт., 2005].

Пионерами в разработке молекулярных методов идентификации дерматофитов стали коллективы японских [Капо R. и соавт., 1997; Mochizuki Т. и соавт., 1997], австралийских [Liu D. и соавт., 1996] и европейских [Graser Y. и соавт., 1998] исследователей, а сами методы исходно базировались на тех же технологиях (RPLP, анализ ITS-последовательностей и др.), которые использовались в работах этих же и других авторов по молекулярной систематике, имевших не прикладной, а фундаментальный характер. При этом в публикациях по «диагностике дерматофитии» имелась в виду именно детекция конкретных видов в культуре, но не клиническом материале. В отдельных случаях за идентификацией следовали попытки определить жизнеспособность дерматофитов в клиническом материале, т. е. задачи, приближенные к целям клинической лабораторной диагностики [Kawai М., 2003].

В качестве молекулярных мишеней для идентификации дерматофитов предлагались гены хитин-синтазы и м-РНК актина [Kawai М., 2003; Okeke C.N. и соавт., 2001], NTS и ITS-регионы рибосомальной ДНК [Mochizuki Т. и соавт., 2003], случайные и произвольные праймеры [Liu D. и соавт., 1997].

Зарубежный опыт генодиагностики дерматофитии.

В 1994 г. немецкие исследователи сообщили о создании праймеров, основанных на фрагменте гена малой рибосомной субъединицы 18sPHK, специфичной для группы грибов. Амплификация этого фрагмента в ПЦР была положительной для ряда культур дерматофитов, и отрицательной для чешуек кожи здоровых людей. Авторы заключили о возможности использования таких систем в диагностике дерматофитии [Bock М. и соавт., 1994]. Позднее эти авторы исследовали 69 образцов материала от больных дерматомикозами, сравнивая результаты ПЦР с культурой. Детекция генетического материала дерматофитов была отмечена в 35 случаях инфекции, по сравнению с 28 случаями в культуре. Авторы сделали заключение о преимуществе ПЦР перед культивированием в диагностике дерматофитии [Bock М. и соавт., 1997].

Другая группа исследователей изучила созданные ими генетические зонды для детекции Т. rubrum на основе^{внутреннего} транскрибируемого спейсера (ITS-2) рибосомальной ДНК. Эксперименты по выделению ДНК дерматофитов непосредственно из клинических образцов с последующей амплификацией и гибридизацией оказались успешными в 30% случаев [El Fari M. и соавт., 1999].

На основе 18-S рДНК и ITS итальянские авторы в 2000 г. создали праймеры для детекции ряда возбудителей дерматофитии человека и животных и протестировали их с 40 образцами материала, с заявленной чувствительностью в 25 копий генома на 1 образец. Авторы сообщили о совпадениях результата ПЦР и культивирования [Turin L. и соавт., 2000].

Японские исследователи в 2003 г. провели попытку обнаружения дерматофитов в клинических образцах с помощью праймеров на основе гена хитин-синтазы 1 (CHS1) [Капо R. и соавт., 2003].

Германские исследователи R. Gutzmer и соавт. для идентификации видов дерматофитов использовали ПЦР-систему LightCycler с 7 наборами праймеров для 21 вида грибов, параллельно также применяли RFLP. Для определения вида дерматофитов и плесневых грибов требовалось не менее 2 реакций ПЦР в системе LightCycler. Использование системы для исследования образцов от 38 с дерматомикозами дало 23,7% прирост числа положительных результатов по сравнению с классическими методами диагностики. Несмотря на возможную перспективность метода, стоимость исследования на такой системе (в настоящее время системы LightCycler обеспечивают ПЦР в режиме реального времени и гибридизацию) исключает его применение в дерматомикологии [Gutzmer R. и соавт., 2004].

Китайские исследователи применили метод гнездной (nested) ПЦР для определения генетического материала дерматофитов в кожных чешуйках. Были использованы пары праймеров с ITS1/ITS5 и ITS2/ITS4. От 112 пациентов были получены 196 культур, при этом чувствительность посева составила 22%, а ПЦР -50% [Yang C.Y. и соавт., 2007].

В 2007 г. коллектив европейских исследователей изучил новый мультиплексный набор праймеров для определения ряда возбудителей дерматофитии в клиническом материале с помощью ПЦР в реальном времени. Были созданы комплексы праймеров для определения группы Т. mentagrophytes, Т. tonsurans и Т. violaceum, и группы Т. rubrum, Microsporum canis и М. audouinii. В течение 6 месяцев изучили 92 образца клинического материала из ногтей, волос и кожи. Сообщалось о высокой чувствительности и специфичности методики [Arabatzis М. и соавт., 2007].

Попытки внедрения систем генодиагностики онихомикозов за рубежом.

В 1998 г. корейские исследователи Baek S. и соавт. сообщили об использовании праймеров на основе 18-S РНК с последующим рестрикционным анализом амплифицированного продукта (для видовой идентификации), для определения разных возбудителей онихомикозов в клиническом материале [Baek S.C. и соавт., 1998].

В 2001 г. французы Machouart-Dubach М. и соавт. описали возможность быстрой дифференциации между видами дерматофитов и других грибов с использованием ПЦР-RFLP (методика, в ходе которой продукты ПЦР-амплификации обрабатываются специфичными ферментами-эндонуклеазами). Был использован ген, кодирующий гипервариабельный домен V4 малой субъединицы рибосомы 18S, последовательности были взяты для 9 видов дерматофитов, 2 видов Scytalidiiim и еще 6 плесневых и 2 дрожжевых грибов, и на этой основе изготовлены наборы праймеров и методика для их обработки в ходе RFLP. Всего было изучено 75 клинических образцов от больных дерматомикозами, и в 74 случаях результат исследования совпал с данными культивирования. Несмотря на то, что процесс ПЦР-RFLP у авторов занял 24 часа, сама технология RFLP доступна в немногих медицинских лабораториях мира (обычно в судебной медицине), требует особых организационных мероприятий и весьма трудоемка. Кроме того, авторы указывают на важность специальной подготовки материала [Machouart-Dubach M. и соавт., 2001].

В 2002 г. японские авторы использовали праймеры на основе мРНК актина дерматофитов с помощью системы LightCycler (двухэтапная ПЦР с флуоресцентной гибридизацией в реальном времени) для определения, в том числе количественного, дерматофитов и оценки их жизнеспособности в клиническом материале из ногтей. Авторы отметили, что количественный анализ генетического материала совпадает с данными микроскопии и культивирования, а метод отличается приемлемой чувствительностью и специфичностью [Tsuboi R. и соавт., 2002].

Относительная неудача постигла турецких исследователей, у 52 пациентов использовавших ПЦР без RFLP с похожими последовательностями и получивших 38% положительных результатов в ПЦР при 77% положительных результатов микроскопии [АгсаЕ. и соавт., 2004].

Более успешным достижением европейских научных коллективов в разработке клинически-значимых методов генодиагностики онихомикозов стал совместный проект немецких, греческих, болгарских и голландских ученых, результаты которого обещают диагноз онихомикоза в двухдневный срок [Kardjeva V. и соавт., 2006]. В его разработке приняли участие известные исследователи дерматофитов Y. Graser и R. Summerbell. Использовали видоспецифичные пары праймеров и микросателлитные маркеры Т1, основанные на GT-повторах, позволяющие диагностировать Т. rubrum. Для диагностики онихомикоза, вызванного другими видами, использовали ITS-область рибосомальной ДНК. Помимо диагностики онихомикоза, авторы ставили задачу типирования недавно открытых штаммов Т. rubrum, для чего применялась сепарация Т1-продуктов ПЦР на полиакриламидном геле. Всего изучили 195 образцов и 66 выделенных в культуре видов от 261 пациента из Болгарии и Греции. Чувствительность ПЦР составила 77% при 22% для посева, при этом чувствительность микроскопии оказалась выше, а специфичность ПЦР достигла 100%. Отказавшись от типирования и расширенных исследований этиологии, авторы предложили сократить время диагностики до 24 ч. [Kardjeva V. и соавт., 2006].

В 2006 г. японские авторы использовали праймеры на основе ITS в ПЦР и RFLP для исследования 100 образцов ногтей от больных онихомикозом. Чувствительность ПЦР-RFLP составила 73%, по сравнению с 20% в посевах. Чувствительность ПЦР-RFLP при этом не зависела от величины образца (количества анализируемого материала) [Yoshimura R. и соавт., 2006].

Исследование с ПЦР-RFLP французских авторов, использовавших праймеры на основе 18-S рибосомальной ДНК, было направлено на определение разных видов грибов в материале из ногтей, с последующей RFLP-идентификацией в течение 2 дней. Результаты показали выявление 10% смешанной этиологии (разные виды) [Monod М. и соавт., 2006].

В 2007 г. коллектив европейских исследователей опубликовал работу, обещающую диагноз дерматофитии ногтей в течение 5 часов. Был создан двухшаговый метод извлечения грибной ДНК и мультипраймерный набор, включающий 13 видов дерматофитов и отдельно — Т. rubrum. С помощью микроскопии, посева и 2 ПЦР методов (общий на дерматофиты и на Т. rubrum) изучено 118 образцов ногтей, при этом положительные результаты ПЦР и микроскопии были одинаковыми, а выявляемость онихомикоза увеличилась с 38,1 (регламентированные методы) до 42,4% (ПЦР). Выявляемость Т. rubrum по сравнению с культивированием увеличилась на 18% [Brillowska-Dabrowska А. и соавт., 2007].

Канадские авторы предложили для лабораторной диагностики онихомикоза двухэтапную модификацию (double-round) ПЦР, специфичную для Т. rubrum, на основе генов актина и регионов ITS-1. Было изучено 62 образца ногтей, из них 77,4% дали положительный результат при микроскопии и 22,6% при посеве. ПЦР на основе гена актина оказалась положительной в 59,7% а на основе ITS-1 — в 45,2% случаев, совокупная выявляемость онихомикоза в ПЦР составила 69,4% [Gupta A.K. и соавт., 2007].

В 2007 г. во Франции была протестирована первая серийная зарубежная система для ПЦР-диагностики онихомикоза на основе ПЦР и иммуноферментного анализа (Onychodiag). Было обследовано 438 пациентов и 108 здоровых лиц. У пациентов с выделенными из ногтей культурами дерматофитов частота положительных результатов ПЦР составила 83,6%. У здоровых лиц не было выявлено положительных результатов ПЦР [Savin С. и соавт., 2007].

Индийские авторы оценили использование пан-дерматофитной гнездной ПЦР на основе хитин-синтазы у 152 больных с подозрением на онихомикоз. Было сделано заключение о приравнивании данного метода к «золотому стандарту», как превосходящему эффективность регламентированных методов при дерматофитии [Garg J. и соавт., 2007].

Общий анализ предпринятых до настоящего времени попыток создания зарубежных систем генодиагностики онихомикозов позволяет заключать о том, что ни одна из них не явилась ни по-настоящему успешной, ни завершенной. Успех создания системы генодиагностики онихомикозов заключается, прежде всего, в том, чтобы новая методика как можно ближе подошла к характеристикам золотого стандарта", т. е. общей диагностической точности, превышающей 90%. Такие показатели не были достигнуты или подтверждены зарубежными авторами. В лучшем случае, сообщалось о приросте выявляемое&tradeпо сравнению с посевом.

Диагностическая ценность новой методики должна быть доказана на достаточно большом клиническом материале, с выборкой, приближенной к реальным клиническим условиям. В зарубежных моделях оценки ПЦР редко использовались группы пациентов более 100 человек, а сравнение методов велось не по регламентированным принципам оценки диагностических тестов, но произвольно. Единственная созданная за рубежом серийная система протестирована только относительно положительных посевов и здоровых лиц, а не в общей популяции пациентов с подозрением на онихомикоз и сочетанием разных результатов регламентированных методов.

Кроме того, почти все предложенные системы использовали не одношаговые, а комплексные методы (ПЦР с последующей обработкой амплифицированного материала, а не простым ответом типа «есть/нет» сразу после амплификации), или требовали наличия сложных диагностических и исследовательских систем, недоступных в массовой ПЦР-лаборатории. Обращает на себя внимание отсутствие клинического подхода в создании диагностических тестов, включающих либо один вид Т. rubrum, либо очень широкий спектр возбудителей, редко встречающихся при онихомикозе.

Использование генов топоизомеразы для изучения и идентификации дерматофитов.

Новое направление в изучении дерматофитов было создано японскими учеными, в 2003 г. предложившими использовать в идентификации видов Trichophyton, Microsporum и Epidermophyton ген ДНК-топоизомеразы И, как одну из наиболее удобных и быстрых технологий [Kanbe Т. и соавт., 2003]. Развитие этого метода другими исследователями (в Японии A. Kamiya и соавт., 2004, в Китае G. Не и соавт., 2005), позволило использовать ПЦР-RFLP уже в.

46 лабораторной диагностике дерматофитии в рамках культурального исследования, применяя различные наборы праймеров. Авторы отмечали совпадения результатов ПЦР-RFLP и культивирования с последующей идентификацией, что открывает потенциал для видоспецифичной генодиагностики [Не G. и соавт., 2005; Kamiya А. и соавт., 2004].

Об успешной видоспецифичной идентификации 7 видов дерматофитов на основе праймеров с генами топоизомеразы II в 2004 также сообщили китайские исследователи [Ding J. и соавт., 2004].

На основе этих данных в России в 2004 г. группой исследователей (Сергеев А.Ю., Щербо С. Н. и др.) было принято решение о разработке системы генодиагностики дерматофитии и онихомикоза на основе праймеров гена топоизомеразы II.

Создание системы генодиагностики онихомикозов в России.

В 2004 г. в России были разработаны первые генетические зонды для прямой диагностики дерматофитии кожи, волос и ногтей [Сергеев А.Ю. и соавт., 2004]. Данный проект был инициирован в 2003 г. Национальной академией микологии, с целью изучения возможности применения ПЦР в выявлении Trichophyton rubrum в клинических образцах. Затем был создан аналогичный метод для Trichophyton mentagrophytes. Было предложено проводить мультипраймерную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с двумя парами олигонуклеотидных праймеров: одна пара праймеров специфична для фрагмента генома Т. rubrum размером 925 пар нуклеотидов (п.н.), вторая пара праймеров специфична для фрагмента генома Т. mentagrophytes var. interdigitale, 392 п.н.

Выбор данных видов для создания пары видоспецифичных праймеров был обусловлен лидирующим положением Т. rubrum и Т. mentagrophytes в этиологии микозов стоп и дерматофитии ногтей. При этом создание только одного видоспецифичного маркера было сочтено недостаточным в силу существенной географической вариации доли и соотношения данных видов в этиологии дерматофитии и онихомикоза, показанной выше. Кроме того, соотношение Т. rubrum и Т. mentagrophytes как главных возбудителей дерматофитии в России было подвержено существенным колебаниям во времени [Рукавишникова В.М.,.

2005]. Вместе с тем, другие виды дерматофитов выделяются из ногтей крайне редко. Созданная мультипраймерная система «ТрифАм» охарактеризована ниже, в разделе Методы исследования.

Альтернативные попытки создания метода генодиагностики дерматофитии на основе других праймеров с топоизомеразой пока не увенчались успехом. Так, С. Г. Лыкова и соавторы в 2006 г. опробовали гнездный тип ПЦР в диагностике дерматофитии, используя другие праймеры с размером ампликона в 187 пар оснований. Взяв 99 проб от 40 больных, авторы обнаружили мицелий возбудителей в 55 из них, однако ПЦР оказалась положительной только в 22 (24%), по результатам чего было предположено о недостаточной чувствительности данного метода [Лыкова С.Г. и соавт., 2006].

Предварительные оценки системы генодиагностики.

В 2006 г. Сергеев А. Ю. и соавт. опубликовали первые результаты тестирования новой системы генодиагностики дерматофитии по данным 20 042 005 гг. Эффективность диагностики сопоставлялась с результатами микроскопии и культивирования. Использование разных алгоритмов оценки выявило разброс чувствительности ПЦР 79−96%, а специфичность 64−86% [Сергеев А.Ю. и соавт.,.

2006]. Предварительный характер оценки не позволил авторам дать развернутый анализ диагностической ценности метода.

Тем не менее, авторам удалось показать, что в отличие от микроскопии, результаты ПЦР практически не зависят от качества сбора материала (опыта врача, берущего материал).

Независимая оценка новой системы генодиагностики предпринималась другими авторами. В 2006 г. Сухова Л. П. и соавторы (Липецкий КВД) обследовали 159 больных с изменениями ногтей, при которых клинические признаки были характерны для онихомикоза, но микроскопия дала отрицательный результат. У 57 (36%) больных результат ПЦР оказался положительным, среди них у 32 (20%) выявлен Т. rubrum, а у 25 (16%) -Т. interdigitale. Авторы сделали заключение о высокой диагностической точности методики [Сухова Л.П., 2006].

В 2008 г. Цыкин A.A. (ММА имени И.М. Сеченова) обследовал 88 пациентов с клинической картиной онихомикоза. Микроскопия оказалась положительной в 76 случаях (86,36%), посев — в 43 (48,86%), из них 31 -дерматофиты (39,24%). ПЦР оказалась положительной у 77 больных (87,5%). У 41 пациента из контрольной группы ПЦР оказалась положительной в 2 случаях [Цыкин A.A. и соавт., 2008].

Данные работы позволили дополнительно охарактеризовать новую систему ПЦР при онихомикозе, дать предварительную оценку данной методике. Однако полученных данных явно недостаточно для достоверной оценки ее диагностической ценности. В работе Л. П. Суховой и соавторов оценены только случаи применения ПЦР с целью дифференциальной диагностики у больных с сопутствующей патологией и на фоне отрицательной микроскопии. Эти данные не могут быть экстраполированы на общую популяцию больных. В работе A.A. Цыкина показатели выявляемости автоматически приравнены к чувствительности, а специфичность рассчитана не для тех же пациентов, что и чувствительность, а для другой (контрольной) группы. Это не соответствует современным принципам оценки диагностических тестов. Показатели выявляемое&tradeонихомикоза в небольшой группе обследования при этом оказываются выше, чем в крупных отечественных и зарубежных исследованиях.

Предпринятый нами анализ литературы, посвященной существующим и перспективным методам диагностики онихомикозов, позволяет, по нашему мнению, сделать следующее заключение:

• Клинический диагноз онихомикоза нуждается в однозначной и достоверной лабораторной верификации, а для назначения этиотропной терапии нередко требуется и определение вида возбудителя;

• Регламентированные методы лабораторной диагностики имеют существенные ограничения в диагностической точности и поэтому зачастую неспособны выполнить поставленные задачи, в частности — при однократном исследовании;

• До настоящего времени за рубежом не создано эффективной и доступной системы генодиагностики онихомикозов, претендующей на роль массового «золотого стандарта»;

• Система с таким потенциалом создана в России и готова к внедрению в клиническую практику.

Однако перспективы ПЦР и любого другого перспективного метода как нового «золотого стандарта» в диагностике онихомикозов были бы далеки от реализации без достаточного количества исследований, подтвердивших бы эффективность использования данного метода в клинической практике.

Для этого нам представляется необходимым исследование, которое:

1. Включило бы достаточно большую группу обследованных;

2. Группа обследованных представляла бы выборку, аналогичную популяции пациентов, представляющих материал для лабораторной диагностики онихомикоза в повседневной практике врачей-дерматологов. Наилучшую возможность для этого предоставляет дополнительное обследование с помощью ПЦР тех же пациентов, которые сдают материал для регламентированных методов диагностики, т. е. обследование в существующих реальных клинических условиях;

3. Включило бы тщательный сравнительный анализ результатов регламентированных методов диагностики и ПЦР, в том числе перекрестное сопоставление всех положительных и отрицательных результатов;

4. По возможности, включило бы катамнестическую оценку, то есть использование данных длительного наблюдения и регистрации эффективности противогрибковой терапии как критерия истинности наличия инфекции;

5. По возможности, использовало бы данные повторных обследований (в том числе, контрольных) как дополнительного критерия истинно положительных результатов.

6. Позволило и осуществило развернутый, достоверный и окончательный анализ диагностической ценности методики, общепринятой для современных диагностических тестов в соответствии с критериями доказательной медицины;

7. Учло бы опыт предшествующих исследований точности и диагностической ценности методик лабораторной верификации диагноза онихомикоза.

8. Позволило бы использовать полученные результаты для формулирования нового диагностического алгоритма при онихомикозе.

Проведение данного исследования представляет цель настоящей работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ГЛАВА 1. Материалы и методы исследования.

Работа выполнена за период с 2006 по 2008 год на кафедре Кожных и венерических болезней лечебного факультета ММА имени И. М. Сеченова. Клинической базой служили Лечебно-реабилитационный центр «Медико-С» и ФГУ «Поликлиника № 1» УД Президента РФ. Микробиологические исследования проводились в Межклинической микробиологической лаборатории ЦКБ ГМУ УД Президента РФ. Молекулярно-генетические исследования проводились в лаборатории ООО «Диасан». Исходные работы по созданию праймеров для данного исследования выполнялись совместно с НПФ «Гентех» и Институтом молекулярной генетики РАН.

выводы.

1. Впервые проведены расширенные клинические испытания российской системы генодиагностики онихомикозов, позволяющей определять главных возбудителей (Т. rubrum, Т. mentagrophytes var. interdigitale) непосредственно в клиническом материале.

2. Проведена комплексная оценка соответствия результатов ПЦР и регламентированных методов лабораторной диагностики онихомикозов. Использование ПЦР существенно повышает выявляемость онихомикоза по сравнению с регламентированными методами (18% для микроскопии и более 50% для посева), что подтверждается данными катамнеза и повторного обследования. Доказана высокая специфичность и чувствительность ПЦР, установлено достоверное соответствие результатов ПЦР и регламентированных методов.

3. Показана возможность использования ПЦР в контрольной оценке эффективности лечения онихомикозов. В ходе системной терапии онихомикоза негативация результатов ПЦР наступает в достоверно более короткие сроки, по сравнению с КОН микроскопией. Результаты ПЦР могут быть использованы в оценке эффективности лечения онихомикозов, начиная с 4 месяца.

4. На основании результатов ПЦР дана новая оценка этиологической структуры онихомикозов. Установлена ведущая роль грибов-дерматофитов, при падении доли плесневых и дрожжевых возбудителей онихомикоза ниже 10%. На основании данных генодиагностики уточнена роль Trichophyton rubrum в структуре дерматофитии ногтей, составившая более 90,4%. Предложена концепция ПЦР-негативного онихомикоза, представляющая новый подход к этиологической диагностике.

5. Проведенные исследования послужили основой нового алгоритма лабораторной диагностики онихомикозов. Данный подход отличается высокой экономичностью, исключая необходимость микробиологических исследований более чем у 96% больных, и сокращая срок окончательного этиологического диагноза 80% случаев онихомикоза любой этиологии до одних суток.

Практические рекомендации.

• Российская система ПЦР диагностики дерматофитии рекомендуется к широкому использованию на практике, наряду с регламентированными методами верификации лабораторного диагноза онихомикоза.

• Целесообразна замена ПЦР культивирования как стандартного метода этиологической диагностики онихомикоза, что может быть осуществлено в большинстве лечебно-профилактических учреждений дерматовенерологического профиля, имеющих ПЦР лаборатории.

• Положительный результат ПЦР может быть использован как руководство к назначению системной терапии онихомикозов, специфичной для дерматофитии (тербинафин), а отрицательный результат ПЦР — к назначению системной терапии расширенного спектра действия (итраконазол).

• Рекомендуется внедрение ПЦР в систему контроля микологической излеченности онихомикозов.