Получение биоаналитических реагентов на основе полимерных дисперсий

Полимерные синтетические микросферы с узким распределением частиц по размерам применяют в различных областях науки и техники, например, в качестве калибровочных эталонов в электронной и оптической микроскопии, при подсчете аэрозольных частиц, при малоугловой рефракции рентгеновских лучей, для счета вирусных частиц, для стимулирования клеточного продуцирования антител и их очистки, в качестве модельных коллоидных систем для изучения их реологии, стабильности, седиментации и т. д. [1−4]. В последние годы частицы монодисперсных суспензий нашли широкое применение в качестве носителей биологических лигандов при создании реагентов для биоаналитических исследований, основанных на детекции специфических взаимодействий биообъектов. Основные требования, которым в этом случае должны удовлетворять полимерные частицы — это биологическая, химическая и коллоидная устойчивость в физиологических жидкостях, узкое распределение частиц по размерам, возможность образования прочной связи белков и других биолигандов с поверхностными функциональными группами частиц суспензий. Кроме того, необходимо уметь получать дисперсии с заданными размерами частиц, которые определяют их применение в различных видах анализа с визуальной или инструментальной детекцией результатов биоспецифических реакций [4].

Таким образом, цель данной работы состояла в синтезе полимерных микросфер, содержащих специальные метки (флуоресцентные, хромофорные, дигитонин) для детекции нуклеиновых кислот, гербицида (2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты) и холестерина при биоаналитических исследованиях.

Глава I. Литературный обзор.

1.1. Основые принципы биоаналитических исследований.

В настоящее время существует большое количество методов, позволяющих определять наличие или концентрацию биохимических лигандов в исследуемых биологических образцах. Определяемый лиганд, как правило, играет важную роль в биохимических процессах, или позволяет диагностировать заболевание, тип крови и многое другое. Значительное место среди данных методов занимают анализы, основанные на специфическом, высокоаффинном взаимодействии между детектируемым лигандом и реагентом, содержащим антилиганд. К этой паре лиганд-антилиганд могут быть отнесены биоспецифические взаимодействия «антиген-антитело», «биотин-стрептавидин», «углевод-лектин», «иммуноглобулин-белок А», «транспортный белок-рецепторный белок», «холестерин-дигитонин», «комплементарные олигои полинуклеотид» и другие, в образовании которых участвуют электростатические и межмолекулярные силы, действующие на близком расстоянии, а также стереоспецифическая комплементарность молекул [5]. Эти взаимодействия положены в основу иммунохимических методов, гибридизационного анализа нуклеиновых кислот, маркирования компонентов клеточных мембран и т. д.

Принцип работы иммунодиагностических тестов основан на иммунохимической реакции между антигеном (веществом, несущим признаки генетически чужеродной информации для данного вида организма) и антителами (белками, относящимися к классу иммуноглобулинов, продуцируемыми клетками иммунной системы организма в ответ на появление антигена) с образованием комплекса «антиген-антитело» [6]. Связывание с ацтигеном сопровождается изменениями конформационной структуры антител и приводит к реализации эффекторных функций, которые способствуют удалению антигена из организма. Антитела соединяются с антигеном И-концевым участком молекулы антителаБф-фрагментом, содержащим антигенсвязывающий центр. Реакция «антиген-антитело» основана на принципе взаимного узнавания, обусловленном комплементарностью активных центров антитела и детерминантных групп (эпитопов) антигена [7].

Реакция образования такого комплекса является высокоиммуноспецифичной, т. е. на появление в организме определенного антигена иммунная система вырабатывает антитела строго определенного строения, способные взаимодействовать только с этим антигеном. Константа аффинности антител к индивидуальным антигенам составляет 1 041 012 М" 1 [8]. Вследствие того, что и антиген, и антитело могут взаимодействовать одновременно с несколькими молекулами, образуются пространственные сетки, узлами которых служат молекулы антигена.

Образование сеток-агломератов, а, следовательно, и обнаружение того или иного вида антигенов, может быть зарегистрировано различными методами, например, спектрофотометрии, турбидиметрии, нефелометрии, лазерной автокорреляционной спектроскопии и т. д. Использование для обнаружения комплекса «антиген-антитело» специального дорогостоящего оборудования создает заметные трудности для широкого применения указанных методов при диагностике заболеваний. Связывание антигенов (антител) с полимерным носителем, который выполняет индикаторную функцию, позволяет даже невооруженным глазом обнаружить появление комплексов как скопление агломератов частиц носителя, что значительно упрощает проведение анализа, основанного на биоспецифическом взаимодействии «антиген-антитело» [4].

Иммунохимические методы анализа позволяют с уникальной специфичностью анализировать в биологических образцах содержание определенных антигенов, которые свидетельствуют о присутствии инфекционных объектов или аномальных продуктов жизнедеятельности клеток организма, например, характерных для клеток злокачественных новообразований. Значительная часть антигенов является белками, и различия в антигенных свойствах отражают изменения в первичных структурах этих белков в области антигенных детерминант. Наличие таких различий автоматически означает и различие в соответствующих участках генов, т. е. молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или информационных матричных рибонуклеиновых кислот (РНК), кодирующих образование этих белков. В этих случаях узнавание антигенов с помощью иммунохимических методов может быть заменено узнаванием соответствующих участков нуклеиновых кислот [9]. С этой целью может быть использовано уникальное свойство последних образовывать специфические комплексы с нуклеиновыми же кислотами, имеющими комплементарные к ним последовательности. Свойство комплементарности было впервые сформулировано Уотсоном и Криком в 1953 г., когда они предложили пространственную структуру ДНК в виде двойной спирали, т. е. двух полимерных полинуклеотидных цепей, образующих две спирали, навитые вокруг общей оси. Проведенный ими стереохимический анализ показал, что две цепи будут стабилизированы в единой структуре, если они устроены так, что против каждого остатка аденина и цитозина одной цепи находятся соответственно тимин и гуанин в другой. При этом создаются особо благоприятные условия для образования водородных связей между этими гетероциклическими фрагментами нуклеотидных остатков [10].

Имеющиеся оценки говорят о том, что некоторая последовательность нуклеотидов длиной порядка 20 звеньев может быть с помощью комплементарной последовательности дискриминирована от такой же последовательности, отличающейся всего на один нуклеотид. Такие последовательности получили название ДНК-зондов или РНК-зондов. Поиск определенных нуклеиновых кислот и определение их количества по связыванию с ДНК-зондами получил название гибридизационного анализа [11].

Ключевыми моментами метода гибридизационного анализа нуклеиновых кислот являются техника проведения эксперимента и способы детекции образовавшихся гибридов. Детекция осуществляется с помощью метки, вводимой в ДНК-зонд. Чаще всего.

32 125 35 в качестве меток используют радиоактивные изотопы Р, I, Б. Однако, такие зонды нестабильны, небезопасны в работе, дорогостоящи [12]. Эти недостатки ограничивают возможность применения данного способа визуализации реакции гибридизации, особенно в диагностических целях. В связи с этим более перспективными являются нерадиактивно меченые зонды [13]. Метка, с помощью которой происходит детекция после образования гибридов, может быть введена непосредственно в нуклеотидную последовательность, использующуюся в качестве зондов, но для большинства нерадиоактивных методов характерно использование непрямого мечения зондов. В этом случае в зонд вводят специфические лиганды (метки), а после гибридизации лиганды могут быть обнаружены с помощью лиганд-специфических белков. Наибольшее развитие получили методы, основанные на присоединении к зондам остатков биотина (рис. 1.1), т.к. он характеризуется сродством (аффинностью) к белку стрептавидину (1015 М-1) и образует устойчивый комплекс «биотин-стрепта-видин» [14]. Визуализация данного комплекса может быть осуществлена с помощью ферментов, частиц коллоидного золота, ионами европия (Еи+3) и т. д. [15, 16], а также при использовании наполненных флуоресцентным красителем полимерных микросфер с функциональными группами на поверхности, которые могут взаимодействовать с первичными аминогруппами белка (стрептавидина).

Одним из способов детекции биоспецифических реакций «антиген-антитело» и «биотин-стрептавидин» заключается в том, что антиген (антитело) или стрептавидин иммобилизуют на полимерные частицы, в результате чего реакцию между компонентами данных пар, которая в этом случае носит название реакции латексной агглютинации, можно наблюдать визуально [4]. Неудобство визуального наблюдения этой реакции состоит в том, что трудно определить конечную точку реакции, так как обычная полимерная суспензия высоким.

СН2)4-С-ОН.

Рис. 1.1. Биотин. имеет белый цвет, который плохо воспринимается глазом. Для устранения этого недостатка было предложено использовать окрашенные латексы [17], которые позволяют повысить чувствительность метода.

Одним из процессов, во многом определяющим развитие таких заболеваний, как атеросклероз, ишемическая болезнь сердца, является накопление холестерина в плазматических мембранах различных клеток организма. Холестерин (рис. 1.2.) относится к классу стероидов и является одним из важных компонентов биомембран, который играет определяющую роль в их функционировании [18]. Нарушение сбалансированности транспорта холестерина в клетку и из нее служит главной причиной развития атеросклероза [19, 20]. Однако, сведений о количестве и закономерностях распределения холестерина в плазмолемме клеток в норме и при заболевании недостаточно. Известные в настоящее время методы определения либо требуют большого количества биологического материала [21], либо характеризуются низкой специфичностью [22], либо для выявления холестерина необходимо его присутствие в клетке в значительных количествах, [23, 24]. Все это требует создания простого и доступного метода оценки содержания холестерина и изучения его топографии распределения в мембранах клеток.

В начале 20-го века Виндаус открыл, что холестерин образует со стероидным гликозидом — дигитонином (рис 1.3.) — нерастворимый в спиртовых растворах комплекс, содержащий эквимолярные количества обоих компонентов [25]. Реакция комплексообразования обладает высокой стереоспецифичностью [26].

Рис. 1.2. Холестерин.

Аддукт холестерина с дигитонином (холестерин-дигитонид) имеет незначительную растворимость. Благодаря этому дигитонин является наиболее подходящим сапонином для осаждения холестерина.

В некоторых работах предпочтительную роль при взаимодействии компонентов аддукта отдают гидрофобному взаимодействию циклопентапергидрофенантренового цикла [27], а в других рассматривают их как соединения включения [28]. Соединения включения.

Ксилоза Галактоза Глюкоза.

Рис. 1.3. Дигитонин это «комплекс», в котором один компонент «хозяин» образует кристаллическую решетку, имеющую полости в форме длинных туннелей или каналов, в которых располагаются другие молекулы, «гости». Между «гостем» и «хозяином» не образуется ковалентной связи. Если полость в решетке «хозяина» замкнута со всех сторон так, что молекулы «гости» захвачены как в клетке, такие соединения известны как «клатраты» или «клеточные соединения». Соединения включения занимают промежуточное положение между твердыми растворами внедрения и истинными химическими соединениями. Они образуются за счет стереоспецифической комплементарности, т. е.пространственной связи между молекулой или кристаллической решеткой молекулы «хозяина» и молекулой — «гостем». Включаемое вещество по своей пространственной конфигурации должно соответствовать полости «хозяина» [28]. Н Н.

Наиболее перспективным представляется создание маркера холестерина, в котором специфический лиганд будет связан с таким носителем, который можно будет непосредственно регистрировать методами электронной микроскопии. В настоящее время в качестве носителей используют макромолекулы (гемоцианин), биологические частицы (вирусы, бактерии), частицы коллоидного золота [29, 30]. В то же время имеются все данные для создания количественного метода определения холестерина в мембранах клеток на основе полимерных носителей, содержащих в своем составе дигитонин, способный специфически связываться с холестерином.