Актуальность работы. В ближайшие годы в мире ожидается рост производства продуктов биотехнологии. По оценке известной международной консалтинговой компании McKinsey & Company [1, 2] мировой объем продаж химических продуктов, полученных с использованием биотехнологических процессов, в 2000 г. составлял 53 млрд евро (5% всех химических продуктов), в 2005 г. — 77 млрд евро (7%), в 2007 г. — 99 млрд евро (6%), прогноз на 2010 г. — 125 млрд евро, на 2012 г. — 153 млрд евро (9−10%).
Примерами наиболее массовых производств, в которых биокаталитические процессы заменяют или заменили химические, является получение следующих веществ [3]:
— глюкоза, изоглюкоза, изомальтоза — моносахариды;
— акриламид — мономер для полиакриламидных полимеров;
— L-аспарагиновая кислота — аминокислота;
— аспартам — подслащивающее вещество;
— никотинамид — витамин РР;
— пантотеновая кислота — витамин В6;
— эфедрин — алкалоид;
— 6-аминопенициллановая кислота (6-АПК) — исходный полупродукт для синтеза полусинтетических пенициллинов;
— 7-аминоцефалоспорановая кислота (7-АЦК) — исходный полупродукт для синтеза полусинтетических цефалоспоринов.
Изучение технологии получения 7-АЦК является предметом данного диссертационного исследования. Мировое производство 7-АЦК в 2003 г. оценивалось в 4000 тонн в год [3], в 2006 г. в 5000 тонн в год [4].
Цефалоспориновые антибиотики, исходным сырьем для которых является 7-АЦК, широко применяются при лечении тяжелых инфекционных заболеваний, имеют широкий спектр действия, малотоксичны, хорошо переносятся. В 32 Фармакопее США (2009 г.) [5] описано 27 цефалоспоринов. В Реестре зарегистрированных лекарственных средств Российской Федерации в январе 2009 г. присутствовало 29 цефалоспоринов, из них разрешена продажа 14, а для 15 истек срок действия регистрации [6]. Общее число цефалоспоринов в мире, разрешенных к применению или дошедших до последних стадий клинических испытаний, превышает 50 [7].
Объем продаж цефалоспоринов в 2005 г. оценивался в 9,7 млрд. долларов США (около 32%) из около 30 млрд. долларов США мирового объема продаж антибиотиков [8], это первое место среди всех групп антибиотиков.
В России 7-АЦК не производят и поэтому закупают субстанции и готовые лекарственные формы цефалоспориновых антибиотиков за рубежом, что обуславливает их высокую стоимость и снижает лекарственную безопасность государства. В настоящее время производство цефалоспориновых антибиотиков в нашей стране признано приоритетным направлением. В связи с этим актуальным является проведение исследований по разработке оптимальной технологии получения 7-АЦК из цефалоспорина С с учетом новых, появившихся в последние годы знаний и достижений.
В специализированных научных учреждениях — Всесоюзном научно-исследовательском институте антибиотиков (ВНИИА), позже Государственном научном центре по антибиотикам (ГНЦА), и его Пензенском филиале (ПФ ВНИИА, ПФ ГНЦА), позже Пензенском научно-исследовательском и технологическом институте антибиотиков (ПНИТИА), начиная с 1981 г. по госзаказам № 103, 42−0263−02 и 140−187-БМ проводились исследования и разработка вначале химической, а затем энзиматической технологии промышленного получения 7-АЦК. После ликвидации ПНИТИА научно-исследовательская работа продолжена в Пензенской государственной технологической академии при поддержке РФФИ, гранты № 07−08−557, 09−08−7 049.
Актуальность указанной проблемы определила выбор направления исследования и основное содержание работы.
Цели и задачи исследований. Целью диссертационной работы являлась разработка биокаталитической технологии производства 7-АЦК для промышленного освоения на российских предприятиях.
Для реализации поставленной цели автором сформулированы и решены следующие задачи:
— проведен сравнительный анализ существующих за рубежом технологий синтеза 7-АЦК и выбраны наиболее перспективные;
— на основе выбранных вариантов разработаны опытно-промышленные технологии получения 7-АЦК с учетом особенностей отечественного производства;
— проведен сравнительный анализ воздействия этих опытно-промышленных технологий на окружающую среду;
— предложена безопасная ресурсосберегающая биокаталитическая технология производства 7-АЦК для отечественных предприятий.
Научная новизна.
— в соответствии с характеристиками ферментов для обеих энзиматиче-ских стадий синтеза 7-АЦК выбраны и обоснованы оптимальные условия проведения процессов: температура, рН и оптимальная начальная концентрация цефалоспорина С.
— установлена зависимость протекания всех стадий процесса энзимати-ческого синтеза 7-АЦК от давления кислорода на первой стадии окислительного дезаминирования. Показано, что чем меньше давление кислорода, тем больше продолжительность процесса окисления, что приводит к уменьшению выхода глутарил-7-АЦК на этой стадии из-за гидролиза продуктов реакции. Установлено, что уменьшение выхода глутарил-7-АЦК на первой стадии приводит к уменьшению выходов на последующих стадиях дезацилиро-вания и осаждения.
— предложены и подтверждены кинетические модели для обеих энзима-тических стадий синтеза 7-АЦК. Для стадии окисления это модель линейной зависимости скорости реакции от давления кислорода, причем константа скорости Кр зависит от условий массопередачи для данной системы. Для стадии дезацилирования — модель, использующая уравнение Михаэлиса-Ментен, в котором константы Fmax и Кт также зависят от условий массопередачи для данной системы.
— установлено, что обе энзиматические стадии протекают в диффузионном режиме, поэтому при масштабировании этих процессов на стадии окисления необходимо достичь по возможности большего значения константы скорости Кр как характеристики массопередачи, а также определить предельное значение давления Рпр, при котором скорость реакции перестает зависеть от давления. На стадии дезацилирования необходимо достичь по возможности большего значения константы Vmax как характеристики массопередачи.
Практическая значимость работы.
— разработана опытно-промышленная биокаталитическая технология получения 7-АЦК из цефалоспорина С двухстадийным энзиматическим дезаци-лированием с использованием иммобилизованных ферментов, которую можно использовать как основу при организации промышленного производства 7-АЦК в Российской Федерации. Для данной технологии разработана нормативно-техническая документация для промышленного освоения 7-АЦК: опытно-промышленный регламент на получение 7-АЦК методом двухста-дийного энзиматического дезацилирования (ОПР 64−0263−55−2000) — технические условия на 7-АЦК (ТУ 0263−15−2000) и решены вопросы регенерации органических растворителей и утилизации образующихся отходов. Предложенная технология апробирована на ОАО «Биосинтез» (г. Пенза) на пилотной установке.
— проведен сравнительный анализ энзиматической технологии получения 7-АЦК и химической. Показано, что на 1 кг 7-АЦК при энзиматической технологии: суммарный расход реагентов в 7 раз меньшерасход питьевой воды в 11 раз меньшевыбросы в атмосферу в 24 раза меньшеколичество сточных вод и отходов в 16 раз меньше, чем при химической технологии. При этом выход готового продукта при энзиматической технологии (79%) больше, чем при химической (76%).
— даны рекомендации для масштабирования разработанных процессов в промышленном оборудовании.
На защиту выносятся.
— технологические решения по условиям проведения процесса двухста-дийного энзиматического дезацилирования цефалоспорина С и осаждения целевого продукта;
— установленные зависимости протекания всех стадий энзиматического синтеза 7-АЦК от давления кислорода на первой стадии окислительного де-заминированиякинетические модели для стадии окисления и стадии дезацилирования процесса синтеза 7-АЦКпредложения по масштабированию разработанных процессов в промышленном оборудованиирезультаты сравнительного анализа воздействия на окружающую среду энзиматической и химической технологии получения 7-АЦК;
— опытно-промышленная биокаталитическая технология получения 7-АЦК двухстадийным энзиматическим дезацилированием с использованием иммобилизованных ферментов.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на: Всесоюзной конференции «Биосинтез вторичных метаболитов» (Пу-щино, 1987) — Всесоюзной конференции «Наука и производство в решении комплексной проблемы «Антибиотики» (Москва, 1989) — IX Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию лекарственных веществ (Юрмала, 1991) — V Международной научно-практической конференции «Медицинская экология» (Пенза, 2006) — III Всероссийской научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье» (Пенза, 2006) — IX Международной научно-практической конференции «Экология и жизнь» (Пенза, 2006) — I Международном конгрессе «Экология и безопасность жизнедеятельности про-мышленно-транспортных комплексов» (Тольятти, 2007) — IV Всероссийской научно-практической конференции «Окружающая среда и здоровье» (Пенза, 2007) — XXIII Международном симпозиуме «Новые технологии в образовании, науке и экономике» (Москва — Сидней, 2008) — XXIV Международном симпозиуме «Новые технологии в образовании, науке и экономике» (Москва.
— Сингапур, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 научных работ, в том числе 7 статей в журналах, рекомендуемых ВАК, и две монографии.
Автор выражает признательность всем сотрудниками ПНИТИА и ОАО «Биосинтез» (г. Пенза), которые работали вместе с ним при воспроизведении технологий на опытной и пилотной установках.
1. Анализ существующих технологий получения 7-АЦК.
История цефалоспоринов началась с того, что итальянский ученый Дж. Бротцу обнаружил, что несовершенный гриб вида Cephalosporium acremo-nium (в настоящее время именуемого Acremonium chrysogenum), выделенный им из проб, взятых в море около места сброса сточных вод г. Кальяри на о. Сардиния в 1945 г., выделяет вещество или вещества, которые подавляют рост ряда грамположительных и грамотрицательных бактерий [9]. В своей работе он использовал фильтрат культуральной жидкости и концентрат, полученный из него после осаждения неактивных продуктов этанолом, выделить активные вещества ему не удалось из-за отсутствия возможностей и финансирования.
В связи с этим Дж. Бротцу в 1948 г. передал свой штамм С. acremonium британским ученым, которые начали его изучение. Основные исследования велись в Оксфордском университете под руководством известного ученого Э. П. Абрахама, который в годы II мировой войны принимал активное участие в работах по пенициллину [10]1.
В результате из фильтрата культуральной жидкости этого микроорганизма вначале, в 1952 г., был выделен цефалоспорин N (I) [11−13]. Было установлено, что он является пенициллином [14], почему позже его стали называть пенициллином N. Также было найдено, что цефалоспорин N идентичен синнематину В, антибиотику, выделенному ранее из культуральной жидкости грибка Cephalosporium salmosynnematum [15−17] (позже названного Emericellopsis salmosynnematum). А затем, в 1955 г., был выделен цефалоспорин С (И) [18−20]. Его структура [21, 22] оказалась близкой к структуре пени-циллинов.
Хотя цефалоспорин N и является пенициллином, грибки вида Penicil-lium chrysogenum и других видов Penicillium, которые продуцируют природ.
1 В обзоре [10], соавтором которого является Э. П. Абрахам, в частности, описана история открытия цефа-лоспорина С. ные (биосинтетические) пенициллины, не образуют это вещество. Кроме С. acremonium и Е. salmosynnematum его продуцируют некоторые другие виды Cephalosporium и Emericellopsis, а также некоторые виды Streptomyces и Рае-cilomyces persicinus. Цефалоспорин С кроме С. acremonium продуцируют некоторые штаммы Emericellopsis terricola [10].
Когда были выяснены механизмы биосинтеза природных пеницилли-нов и цефалоспорина С [23], было установлено, что на начальных стадиях они одинаковы. При этом из L-a-аминоадипиновой кислоты (III), L-цистеина (IV) и L-валина (V) образуется трипептид а-аминоадипил-цистеинил-валин.
VI), который циклизируется с образованием общего предшественника всех биосинтетических пенициллинов и цефалоспорина С — изопенициллина N.
VII) (рис. I)2. Изопенициллин N и пенициллин N являются оптическими изомерами, 5 атом углерода в боковой цепи в изопенициллине N имеет исходную L-конфигурацию, а в пенициллине N — обращенную D-конфигура-цию.
При биосинтезе природных пенициллинов (кроме пенициллина N) далее идет замена ацильного радикала у аминогруппы в 6 положении изопенициллина N (VII)3 (реакция переацилирования) с образованием различных биосинтетических пенициллинов (например, бензилпенициллина (VIII).
При биосинтезе цефалоспорина С следующая стадия — изомеризация изопенициллина N (VII) в пенициллин N (I) (который, следовательно, является предшественником цефалоспорина С). Далее последовательно идут процессы расширения цикла (I) с образованием З'-дезацетоксицефалоспорина С (IX), окисления (IX) с образованием З'-дезацетилцефалоспорина С (X), и аце-тилирования (X) с образованием цефалоспорина С (II).
2 Все процессы идут под действием соответствующих ферментов.
3 Общепринятая нумерация атомов в ядре пенициллинов (пенам) [24] и ядре цефалоспоринов (цефам, при наличии двойной связи между 3 и 4 атомами — 3-цефем) [25]. Для цефалоспоринов атом 3' - атом углерода боковой группы, соседний с 3 атомом ядра. Nпенам.
Цефам ноос. nh2.
III ноос nh2.
S. CH, ноос.
0 / о' VIII.
— СНз -<соон nh, ноос nh, он h2n l sh.
СНз сн. л. су^он h2n" 'соон IV V sh fC сн3.
СНз а.
COOH.
VI.
S СНз У.
VII.
I.
СНз.
СООН.
0 У.
СНзСНз л<
СООН.
НООС nh2.
НООС nh2 У.
IX t н.
N".
СНз.
СООН 0.
НООС nh2.
СООН X о.
СНз.
СООН.
II.
Рис. 1. Схема биосинтеза пенициллинов и цефалоспорина С.
При этом в цефалоспорине С 5 атом углерода в боковой цепи имеет D-конфигурацию, как и в пенициллине N. Считают, что именно с этим связана невозможность переацилирования пенициллина N и цефалоспорина С, в отличие от изопенициллина N, и невозможность получения других био синтетических цефалоспоринов [23, с. 190].
Поскольку в молекулах цефалоспорина С и его полусинтетических производных, как и в молекулах всех пенициллинов, присутствует Р-лактам-ное ядро, цефалоспорины и пенициллины по современной классификации входят в группу |3-лактамных антибиотиков.
Следует отметить, что биосинтетические пенициллины изначально имели высокую антибиотическую активность, но достаточно узкий спектр действия, в основном против грамположительных бактерий.
Цефалоспорин С, напротив, при широком спектре действия, в том числе против грамотрицательных бактерий, обладал относительно невысокой активностью. И, в отличие от пенициллинов, не удалось получить другие биосинтетические цефалоспорины. Поэтому сразу встал вопрос о получении полусинтетических цефалоспоринов с более высокой активностью. Подход при этом был такой же, как при получении полусинтетических пенициллинов.
Было найдено, что из природных пенициллинов отщеплением ацильно-го радикала у аминогруппы в 6 положении (реакция дезацилирования) можно получить 6-аминопенициллановую кислоту (6-АПК) (XI). Фермент, осуществляющий эту реакцию, пенициллинацилаза (пенициллинамидаза), впервые был обнаружен у P. chrysogenum [26].
6-АПК вначале была получена при биосинтезе в отсутствии предшественников боковой цепи [27, 28], но вскоре было обнаружено, что ее удобнее получать дезацилированием бензилпенициллина с использованием пеницил-линацилаз различного происхождения [29−32] (почти одновременные сообщения четырех исследовательских групп).
Н2М" з СИ, У.
СНз чсоон.
XI.
Ацилированием аминогруппы 6-АПК были получены многочисленные полусинтетические пенициллины.
Подобным образом из цефалоспорина С отщеплением ацильного радикала у аминогруппы в 7 положении можно получить 7-аминоцефалоспорано-вую кислоту (7-АЦК) (XII). Это вещество вначале было получено кислотным гидролизом цефалоспорина С [33, 34]. соон о.
XII.
7-АЦК стала исходным продуктом для синтеза большой группы полусинтетических цефалоспоринов. При этом у него больше возможностей для модификации, чем у 6-АПК, поскольку, помимо ацилирования аминогруппы в 7 положении, возможны также различные реакции замещения в 3 положении.
Как было отмечено выше, достаточно быстро был найден удобный эн-зиматический способ получения 6-АПК из пенициллинов. В связи с этим химические способы, специально предложенные для получения 6-АГЖ [35−37], практического применения не нашли.
Напротив, для 7-АЦК долго не удавалось найти энзиматический способ получения этого вещества из цефалоспорина С. В связи с этим вначале были разработаны химические методы, причем некоторые из них также можно использовать для получения 6-АПК из пенициллинов.
Обзор работ, посвященных химическим методам получения 7-АЦК из цефалоспорина С, приведен в [38]4. Известные химические методы можно подразделить на следующие группы:
— гидролиз и подобные процессы;
— реакция с нитрозилхлоридом;
— реакция с тетрафторборатом триэтилоксония;
— реакция с пятихлористым фосфором;
— через 7-тиоацилпроизводные цефалоспорина С.
Энзиматические методы получения 7-АЦК из цефалоспорина С можно подразделить на две группы:
— одностадийное энзиматическое дезацилирование;
— двухстадийное энзиматическое дезацилирование, включающее предварительное окислительное дезаминирование и последующее энзиматическое дезацилирование.
Обзор этих методов приведен ниже.
4 Этот обзор также охватывает и способы получения 6-АПК из пенициллинов.
Основные результаты и выводы.
1. Проведен сравнительный анализ существующих за рубежом технологий синтеза 7-АЦК из цефалоспорина С и выбран наиболее перспективный вариант — двухстадийное энзиматическое дезацилирование, включающее окислительное дезаминирование цефалоспорина С до глутарил-7-АЦК и дезацилирование последней до 7-АЦК.
2. Произведен поиск и выбор иммобилизованных ферментов, осуществляющих обе основные стадии двухстадийного энзиматического дезацилирования цефалоспорина С — оксидазы D-аминокислот Т. variabilis и глутарилацилазы Acinetobacter sp., рекомбинантной в Е. coli.
3. В соответствии с характеристиками ферментов для обеих энзиматических стадий выбраны и обоснованы оптимальные условия проведения процессов: для стадии окислительного дезаминирования: температура (20±-1)°С, рН 7,2±0,1- для стадии дезацилирования: температура (20±-1)°С, рН 8,1±0,1. Оптимальная начальная концентрация цефалоспорина С-кислоты — 30−33 г/л (72−79 ммоль/л).
4. Установлена зависимость протекания всех стадий процесса энзиматического синтеза 7-АЦК от давления кислорода на первой стадии окислительного дезаминирования. Показано, что чем меньше давление кислорода, тем больше продолжительность процесса окисления, что приводит к уменьшению выхода глутарил-7-АЦК на этой стадии из-за гидролиза продуктов реакции. Установлено, что уменьшение выхода глутарил-7-АЦК на первой стадии приводит к уменьшению выходов на последующих стадиях дезацилирования и осаждения.
5. Предложены и подтверждены кинетические модели для обеих энзима-тических стадий синтеза 7-АЦК. Для стадии окисления это модель линейной зависимости скорости реакции от давления кислорода, причем константа скорости КР зависит от условий массопередачи для данной системы. Для стадии дезацилирования — модель, использующая уравнение Михаэлиса-Ментен, в котором константы Ктах и Кт также зависят от условий массопередачи для данной системы.
6. Установлено, что обе энзиматические стадии протекают в диффузионном режиме, поэтому при масштабировании этих процессов на стадии окисления необходимо достичь по возможности большего значения константы скорости КР как характеристики массопередачи, а также определить предельное значение давления Рпр, при котором скорость реакции перестает зависеть от давления. На стадии дезацилирования необходимо достичь по возможности большего значения константы Fmax как характеристики массопередачи.
7. Проведен сравнительный анализ энзиматической технологии получения 7-АЦК и химической. Показано, что на 1 кг 7-АЦК при энзиматической технологии: суммарный расход реагентов в 7 раз меньшерасход питьевой воды в 11 раз меньшевыбросы в атмосферу в 24 раза меньшеколичество сточных вод и отходов в 16 раз меньше, чем при химической технологии. При этом выход готового продукта при энзиматической технологии (79%) больше, чем при химической (76%).
8. Разработана опытно-промышленная биокаталитическая технология получения 7-АЦК из цефалоспорина С двухстадийным энзиматическим дезацилированием с использованием иммобилизованных ферментов, которую можно использовать как основу при организации промышленного производства 7-АЦК в Российской Федерации. Для данной технологии разработана нормативно-техническая документация для промышленного освоения 7-АЦК: опытно-промышленный регламент на получение 7-АЦК методом двухстадийного энзиматического дезацилирования (ОПР 64−0263−55−2000) — технические условия на 7-АЦК (ТУ 0263−15−2000) и решены вопросы регенерации органических растворителей и утилизации образующихся отходов. Предложенная технология апробирована на ОАО «Биосинтез» (г. Пенза) на пилотной установке.
