Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Разработка молекулярных методов выявления в воде и клинических образцах вирусов — этиологических агентов заболеваний с фекально-оральным механизмом передачи

Диссертация: Разработка молекулярных методов выявления в воде и клинических образцах вирусов — этиологических агентов заболеваний с фекально-оральным механизмом передачи
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Значимость кишечных вирусов в инфекционной патологии человека определяет необходимость их своевременного выявления. До настоящего времени «золотым стандартом» лабораторной диагностики энтеровирусной и аденовирусной инфекции и выявления энтеровирусов в окружающей среде остается реакция нейтрализации (РН) с типоспецифическими сыворотками в культуре, чувствительных клеток. В 8 научных исследованиях… Читать ещё >

Разработка молекулярных методов выявления в воде и клинических образцах вирусов — этиологических агентов заболеваний с фекально-оральным механизмом передачи (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
  • Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 1. 1. Краткая характеристика клинически значимых кишечных вирусов
      • 1. 1. 1. Общая характеристика семейства Picornaviridae
      • 1. 1. 2. Эпидемиология и клиника заболеваний, вызываемых кишечными вирусами семейства Picornaviridae
        • 1. 1. 2. 1. Полиовирусы
        • 1. 1. 2. 2. Вирусы Коксаки, ECHO и Энтеровирусы
        • 1. 1. 2. 3. Парэховирусы
        • 1. 1. 2. 4. Вирус гепатита А
      • 1. 1. 3. Устойчивость энтеровирусов к воздействию физических и химических факторов
      • 1. 1. 4. Общая характеристика семейства Adenoviridae
      • 1. 1. 5. Ротавирусы, астровирусы, коронавирусы и калицивирусы
    • 1. 2. Методы выявления кишечных вирусов в воде
      • 1. 2. 1. Методы концентрирования вирусов из воды
      • 1. 2. 2. Диоксид кремния. Принципы адсорбции белков и вирусов на силикагелях
      • 1. 2. 3. Методы выявления кишечных вирусов
      • 1. 2. 4. Молекулярные методы исследования
  • Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
    • 2. 1. Материалы
      • 2. 1. 1. Культуральные штаммы вирусов
      • 2. 1. 2. Клинические образцы и образцы сточных вод
      • 2. 1. 3. Клеточные линии
      • 2. 1. 4. Реактивы
    • 2. 2. Методы
      • 2. 2. 1. Молекулярно-биологические методы
      • 2. 2. 2. Синтез сорбента для концентрирования безоболочечных вирусов из воды
      • 2. 2. 3. Концентрирование кишечных вирусов из воды
      • 2. 2. 4. Пробоподготовка
        • 2. 2. 4. 1. Приготовление фекальных суспензий
        • 2. 2. 4. 2. Выделение вирусных нуклеиновых кислот из биологического материала
      • 2. 2. 5. Реакция обратной транскрипции (ОТ)
      • 2. 2. 6. Полимеразная цепная реакция с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени О^-Мап)
      • 2. 2. 7. Количественная ПЦР-РВ
        • 2. 2. 7. 1. Приготовление калибраторов
        • 2. 2. 7. 2. Построение калибровочных прямых
      • 2. 2. 8. Электрофорез ДНК в агарозном геле
      • 2. 2. 9. Метод трансмиссивной электронной микроскопии
      • 2. 2. 10. Методы выявления и идентификации кишечных вирусов
      • 2. 2. 11. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей
      • 2. 2. 12. Статистическая обработка результатов исследований
  • Глава 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ВИРУСОВ ИЗ ВОДЫ
    • 3. 1. Синтез сорбента для концентрирования безобол очечных вирусов из воды
    • 3. 2. Определение емкости сорбента ММ при концентрировании белков и выделении нуклеиновых кислот
    • 3. 3. Концентрирование кишечных вирусов из воды на сорбентах
  • ММ и ММ+
  • Глава 4. РАЗРАБОТКА МЕТОДА МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПЦР-РВ
  • С ВПК ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК И РНК
  • КИШЕЧНЫХ ВИРУСОВ
    • 4. 1. Подбор праймеров и зондов
    • 4. 2. Оценка специфичности праймеров и зондов с использованием лабораторных штаммов вирусов
    • 4. 3. Оптимизация условий ОТ и ПЦР
    • 4. 4. Оценка чувствительности мультиплексной ПЦР-РВ
    • 4. 5. Разработка методов количественной оценки ДНК и РНК кишечных вирусов
  • Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ И
  • ОБРАЗЦОВ СТОЧНЫХ ВОД МЕТОДОМ ПЦР-РВ
    • 5. 1. Анализ клинических образцов методом ПЦР-РВ
    • 5. 2. Анализ сточных вод методом ИКМ-ПЦР-РВ
    • 5. 3. Анализ образцов сточных вод методом ПЦР-РВ
  • ВЫВОДЫ
  • БЛАГОДАРНОСТИ

Актуальность проблемы.

В начале 70-х годов была доказана вирусная этиология небактериальных гастроэнтеритов. С тех пор стало известно, что возбудителями кишечных заболеваний человека могут быть энтеровирусы (ЭВ), ротавирусы, аденовирусы (АВ), калицивирусы, астровирусы, коронавирусы и другие. Все эти вирусы, за исключением коронавирусов, являются безоболочечными, что обусловливает их высокую устойчивость к факторам внешней среды и способность сохранять инфекционность вне организма (например, в воде или на пищевых продуктах) до нескольких месяцев, тс есть дольше, чем колибактерии [55]. Кишечные вирусы имеют фекально-оральный механизм передачи. Порядка 35% от всех острых кишечных инфекций (ОКИ) в РФ имеют водный путь передачи [16]. Вирусы выделяются в очень больших количествах с фекалиями инфицированного человека — больной гастроэнтеритом или гепатитом может экскретировать от 105 до 10'12 вирионов с каждым граммом фекалий [18, 34]. Энтеровирусы выделяются из водопроводной воды даже после дезинфекции-[56, 78]. При оптимальных условиях вирусы способны проникать через почву на глубину более 100 метров [55].

Энтеровирусы оказывают самое различное воздействие на организм. Известно.

66 серотипов энтеровирусов способных вызывать более 20 различных синдромов: полиомиелит, миокардит, перикардит, плевралгия, респираторные заболевания, конъюнктивит, гепатит, асептический менингит, энцефалит, ящур, диабет и др.

111]. Около 90−95% случаев полиовирусной инфекции и примерно 50% случаев.

ECHO и коксакивирусной инфекции протекают бессимптомно [55]. Ротавирусы высококонтагиозны и являются главной причиной детских заболеваний, которые заканчиваются госпитализацией, в очень редких случаях летальным исходом. Более чем у 90% детей антитела к ротавирусам появляются до трехлетнего возраста. Вирус Норволк и другие калицивирусы являются частой причиной вспышек гастроэнтеритов в школах, семьях, больницах, лагерях отдыха [11, 110, 115]. Большинство подростков имеют антитела к энтеральным калицивирусам. Аденовирусы и астровирусы чаще вызывают гастроэнтериты у детей и ограниченно патогенны для взрослых.

Внастоящее время известно более 100 патогенных для человека вирусов, циркулирующих в водных объектах, 37 из них обнаруживаютсянепосредственно е питьевой воде [57].

В этих условиях необходимость постоянного контроляза степенью контаминации кишечными вирусами вод поверхностных водоемов, грунтовых вод, сточной и питьевой воды не вызывает сомнений. Данные мероприятиянеобходимо проводить также в связис тем, что во многих регионах России-качество питьевой водьь не соответствует показателям, регламентируемым санитарными^ правилами и нормами № 2.1.4.1074−01 «Питьеваявода: Гигиенические требования к качеству водыцентрализованных систем питьевого*' водоснабжения: Контроль качества» [14]. Зачастую причиной? возникновения вспышек ОКИ является? загрязнение водопроводной воды сточными водами:

В последниегоды на территории России, имели место многочисленные вспышки инфекционных заболеваний с водным путемпередачи,! в частностигепатита А, ротавирусного гастроэнтерита, энтеровирусного менингита й др. В то же время: часто регистрировались/ вспышки: инфекционныхкишечных-заболеваний с неясной этиологией. Затруднения при определении возбудителей этих заболеваний отчасти связаньь с: несовершенством используемых методов выявления кишечных вирусов.

Наиболее, сложным и несовершенным этапом вирусологического контроля" воды является процесс концентрирования вирусовВ настоящее времяв: распоряжении санитарных вирусологов, имеется ряд методов концентрирования вирусов из воды |1, 6], которые нуждаются в оптимизации, в. основном за счет применения новых, доступных и высокоэффективных адсорбирующих материалов. В этой связи — поиск и изучение новых сорбентов на сегодняшний? день является весьма актуальной задачей.

Значимость кишечных вирусов в инфекционной патологии человека определяет необходимость их своевременного выявления. До настоящего времени «золотым стандартом» лабораторной диагностики энтеровирусной и аденовирусной инфекции и выявления энтеровирусов в окружающей среде остается реакция нейтрализации (РН) с типоспецифическими сыворотками в культуре, чувствительных клеток. В 8 научных исследованиях эффективно применяют реакции прямой и непрямой иммунофлуоресценции (ИФ), характеризующиеся меньшими затратами времени по сравнению с РН. Сложность, длительность и трудоемкость РН обусловлена различной чувствительностью клеточных культур к отдельным представителям рода Enterovirus и множеством их антигенных вариантов. По этой причине затруднена и разработка унифицированных диагностикумов, позволяющих быстро и эффективно проводить выявление и дифференциацию энтеровирусов. Кроме того, ряд кишечных вирусов (например, калицивирусы и вирус гепатита А) с трудом поддаются культивированию. Решение данной проблемы в последние годы связывают с развитием молекулярно-биологических лабораторных методов, таких как ПЦР с гибридизационной идентификацией^ продуктов амплификации, 1 мультиплексная ПЦР, а также ПЦР в режиме реального времени [3, 48, 53, 97].

Цели.и задачи исследования.

Целью настоящего исследования была разработка методов концентрирования энтеровирусов (ЭВ), аденовирусов (АВ) и вируса гепатита, А (ВГА) из воды, а также их выявления в сточных водах и фекальных суспензиях методом мультиплексной* ПЦР в режиме реального времени.

Для реализации поставленной цели необходимо было решитьследующие задачи:

1. Синтезировать несколько вариантов сорбентов для концентрирования вирусов из воды.

2. Отработать методы количественного учета ДНК и РНК вирусов для оценки эффективности концентрирования вирусов из воды.

3. В модельных экспериментах оценить эффективность концентрирования вирусов из воды с применением синтезированных сорбентов.

4. Подобрать праймеры и зонды для ПЦР с флуоресцентнойдетекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для выявления аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита, А в мультиплексном формате и тестировать их на лабораторных штаммах вирусов.

5. Провести сравнительный анализ клинических образцов от пациентов с ОКИ методами мультиплексной ПЦР-РВ и культуры клеток. 9.

6. Проанализировать образцы элюатов, полученных в результате концентрированйя. вирусов из образцов сточных водна. наличие АВ, ЭВ и ВРА методами мультиплексной ПЦР-РВ и ПЦР интегрированной с культуральным методом.

Научная новизна работы.

Г. Впервые показана возможность с высокойэффективностью концентрировать кишечные вирусы из воды с использованием магнитных микрочастиц, покрытых модифицированным аминогруппами полимером диоксида кремния.

2. Впервые вРоссииразработан метод для одновременного выявления аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита, А с использованием внутреннего положительного контроля, основанный < на мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

3. Для-оценки-эффективности концентрирования кишечных вирусов из воды был предложен оригинальный метод, основанный' на' количественном определении вирусных нуклеиновых кислот с помощью ПЦЕ-РВ-,.

Практическая значимость.

1. Сорбент на основе магнитных микрочастицпокрытых модифицированным? аминогруппамиполимером диоксида кремнияможет быть использован для высокоэффективного концентрирования кишечных вирусов из воды. Магнитные свойства сорбента позволяют собирать его проточным методом" с помощью сильных магнитов, описанным в настоящей работе, не прибегая к центрифугированию больших объемов воды. Метод может быть использован для контроля за санитарным состоянием источников водоснабжения.

2. Мультиплексная ПЦР с флуоресцентной детекциейв режиме реального времени для одновременного выявления аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита, А может использоваться в качестве тест-системы как для контроля, за вирусной контаминацией воды (после стадии концентрирования вирусов), так и для анализа лизатов клеточных культур, зараженных вирусным материалом, а также в диагностике ОКИ.

3. Разработанные методы количественного определения вирусных ДНК и РНК могут быть использованы для контроля за активностью вирусной репродукции и эффективностью противовирусной терапии у пациентов, а также в научных исследованиях при испытании противовирусных препаратов в культурах клеток и на лабораторных животных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Магнитные микрочастицы, покрытые модифицированным аминогруппами полимером диоксида кремния, позволяют с достаточно высокой степенью эффективности концентрировать кишечные вирусы из воды.

2. Разработанная мультиплексная ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени позволяет выявлять аденовирусы, энтеровирусы и вирус гепатита, А в клинических образцах, лизатах зараженных клеточных культур, и элюатах, полученных в результате концентрирования вирусов из воды.

3. Применение метода выделения нуклеиновых кислот из образцов фекальных суспензий и элюатов, полученных в результате концентрирования вирусов из воды, с использованием в качестве сорбента магнитных микрочастиц, покрытых полимером диоксида кремния, обеспечивает получение препаратов нуклеиновых кислот (НК), свободных от ингибиторов ОТ и ПЦР.

4. Количественная ПЦР-РВ может быть использована как метод оценки эффективности концентрирования кишечных вирусов из воды.

выводы.

1. Впервые показана возможность с высокой эффективностью концентрировать кишечные вирусы из воды с использованием магнитных микрочастиц, покрытых модифицированным аминогруппами полимером диоксида кремния.

2. Разработан метод мультиплексной ПЦР с флуоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для одновременного выявления в клинических образцах и образцах сточных вод аденовирусов, энтеровирусов и вируса гепатита, А с использованием внутреннего положительного контроля.

3. Установлено, что выделение нуклеиновых кислот из образцов фекальных суспензий и элюатов, полученных в результате концентрирования вирусов из воды, с использованием в качестве сорбента магнитных микрочастиц, покрытых полимером диоксида кремния, обеспечивает получение препаратов НК свободных от ингибиторов ОТ и ПЦР.

4. Разработаны оригинальные методы оценки эффективности концентрирования кишечных вирусов из воды с использованием количественной ПЦР-РВ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает глубокую благодарность научным руководителям работы: академику РАМН, профессору, доктору биологических наук Звереву Виталию Васильевичу и кандидату биологических наук Файзулоеву Евгению Бахтиёровичу за построение логики работы и помощь в интерпретации результатов.

Автор выражает особую благодарность кандидату биологических наук Кривцову Георгию Георгиевичу за помощь в подборе и синтезе сорбентов для концентрирования вирусов из воды.

Кроме того, автор выражает благодарность руководителю лаборатории вирусологии полиомиелита и других энтеровирусных инфекций Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова РАМН, кандидату медицинских наук Ивановой Ольге Евгеньевне за предоставление лабораторных штаммов энтеровирусов и клинических образцов для исследований, а также за содействие в проведении работы.

Показать весь текст

Список литературы

  1. Т.В., Дьяконова О. В., Гудков В. Г. и др. Активный оксид алюминия новый адсорбент для концентрирования кишечных вирусов из воды. Вопр. вирусол., 1999, 2: 92−95.
  2. Вирусология. Методы: Пер. с англ./Под ред. Б. Мэйхи. М.: Мир, 1988. -344 е., ил.
  3. Л.Н., Новикова H.A., Домбровская Л. К. и др. Оценка разработанного «nestec^-варианта полимеразной цепной реакции при выявлении энтеровирусов у больных. Вопр. вирусол. 2002, 5: 41−43.
  4. Иммуноферментный анализ: Пер. с англ./Под ред. Т. Нго и Г. Ленхоффа -М.: Мир, 1988. 446 е., ил.
  5. Ю. В., Ангелов И. И. Чистые химические реактивы: М., Госхимиздат, 1955, 141−142.
  6. В.Б., Иванова O.E., Еремеева Т. П., Ширман Г.А., Казанцева
  7. B.А. Метод концентрирования вирусов в водных объектам окружающей среды. Вопр. вирусол., 1996, 1: 40−42.
  8. И.В., Сабанин Ю. В., Кузин С. Н. Вирусные гепатиты: характеристика возбудителей, исходы заболеваний и перспективы исследований. Эпидемиология и вакцинопрофилакгика. 2006, 5″: 31−34.
  9. Г. Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов 4-е изд., перераб. и доп. — М.: Высш. шк., 1990. — 352 е.: ил.
  10. Методические указания № 4.2.2029−05 „Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Санитарно-вирусологический контроль водных объектов“.
  11. Молекулярная клиническая диагностика. Методы: Пер. с англ./Под ред.
  12. C. Херрингтона, Д. Макги. М.: Мир, 1999, 558 е., ил.
  13. Мухина А. А, Шипулин Г. А., Боковой А. Г., Яцышина С. Б. Первый опыт изучения калицивирусной инфекции у детей в Москве. Вопр. вирусол., 2002,6: 33−37.
  14. JI.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981,288 с.
  15. А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология. Пер. с англ., М.: Мир, 2000, 592 е., ил.
  16. СанПиН № 2.1.4.1074−01 „Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества“.
  17. Е.Б., Никонова А. А., Оксанич А. С. и др. Разработка ПЦР тест-системы для выявления аденовирусной инфекции у человека. Вопр. вирусол. 2005, 6: 44−47.
  18. Т.И., Марков В. Ю. Водные вспышки кишечных инфекций. Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней в России и странах ближнего зарубежья. Самара 2006. Сб. тезисов в 1 т, 316−318.
  19. Abbaszadegan М., Stewart P., Le Chevallier М. A strategy for detection of viruses in groundwater by PCR. Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65(2): 444 449.
  20. Abd el-Galil K., Sokkary M. A., Kheira S. M. Real-time nucleic acid sequence-based amplification assay for detection of hepatitis A virus. Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71(11): 7113−7116.
  21. Adam E., Nasz I., Medveczky P. Comparative studies on the soluble proteins of adenovirus type 1. Acta. Microbiol. Acad. Sci. Hung. 1977, 24(3):181−187.
  22. Adenoviruses: Basic Biology to Gene Therapy ./edited by Prem Seth. 1999.
  23. Agrez M.V., Shafren D.R., Gu X., et al. Integrin alpha V beta 6 enhances coxackievirus B1 lytic infection of human colon cancer cells. Virology, 1997, 239: 71−77.
  24. Alexander L., Lu H.H., Wimmer E. Polioviruses containing picornavirus type 1 and/or type 2 internal ribosomal entry site elements: Genetic hybrids and the expression of a foreign gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91: 14 061 410.
  25. Allard A., Albinsson B., Wadell G. Detection of adenoviruses in stools from healthy persons and patients with diarrhea by two-step polymerase chain reaction. J. Med. Virol., 1992, 37: 149−157.
  26. A-Z of quantitative PGR./edited by Bustin S.A., 2004-
  27. Baltimore D., Girard M., Darnell J.E. Aspects of the synthesis of poliovirus RNA and the formation of virus particles, Virology, 1966, 29: 179−189.
  28. Bass D.M., Upadhyayula U. Characterization of human serotype 1 astrovirus-neutralizing epitopes. J. Virol., 1997, 71: 8666−8671.
  29. Benko M., Harrach B., Russell W. C. Family Adenoviridae. In: Virus Taxonomy. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of
  30. Viruses- Van Regenmortel M.H.V., Bishop C.M.F., Carstens E. B^.Estes M.K.,.:' Lemon S.M., Maniloff J., Mayo M.A., McGeoch D.J., Pringle C.R., Wickner R. B: Eds. Academic Press Inc.: New York, 1999, 227−238.
  31. Bock H.G., Skene P., Fleischer S., Cassidy P., Harshman S. Protein purification: adsorption chromatography on controlled pore glass with the use of chaotropic buffers. Scince, 1976, 191: 380−383.
  32. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M. et al. Rapid» and- simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 1990,' 28: 495−503.
  33. Borodina T.A., Lehrach H., Soldatov A.V. DNA purification on homemade silica spin-columns. Anal. Biochem., 2003, 321(1): 135−137.
  34. Bosch A. Human enteric viruses in the water environment: a minireview. Internatl. Microbiol. 1998 1:191−196.
  35. Brown M., Grydsuk J.D., Fortsas E., Petric M: Structural features unique to enteric adenoviruses. Arch-.Virol- Suppl., 1996, 12: 301−307.
  36. Brundage S.C., Fitzpatrick A.N. Hepatitis A. Am. Fam. Physician., 2006, 73(12): 2162−2170.
  37. Bustin S.A., Mueller R. Real-time revers transcription PGR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin. Sci., 2005, 109: 365−379.
  38. Carter: M.J., Willcocks M.M. The molecular biology of asrtoviruses. Arch. Virol. Suppli, 1996, 12: 277−285.
  39. Chow M., Newman J.F., Filman D., et al. Myristylation of picornavirus capsid protein VP4 and its structural significance. Nature, 1987, 327:482486.
  40. Cuthbcrt J.A. Hepatitis A: old and new. Clin. Microbiol. Rev., 2001, 14(1): 3858. f
  41. Desselberger U. Genome rearrangements of rotaviruses. Arch. Virol. Suppl-.1996- 12: 37−51.
  42. Donaldson- K.A., Griffin D-W., Paul J.II. Detection, quantitation and- identification of
  43. Dorsey S.G., Rogers, S.D. Review: chromatographic silanol- activity test procedures: the quest for a universal test. J- Chrom. A., 2000- 892: 57−65.
  44. Duke G.M., Osorio J.E., Palmenberg A.G. Attenuation of Mengo virus through genetic engineering ofthe 5: noncoding poly© tract. Nature, 1990, 343: 474 476.
  45. Edwards K., Logan J., Saunders N. Real-time PGR. An essential^ guide. London, 2004-
  46. Edy V.G., Braude I.A., De Clercq E., Billiau A., De Somer P: Purification of interferon by adsorption chromatography on controlled pore glass. J. Gen. Virol. 1976, 33: 517−521.48
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!