Инактивационные механизмы высокопороговых потенциал-управляемых кальциевых каналов и взаимодействие с Ca2+-антагонистами

Актуальность исследования Саантагонисты, принадлежащие к химическому классу фенилалкиламинов (ФАА), широко применяются в клинической практике для лечения аритмии, ишемии, некоторых видов стенокардии и других заболеваний сердечно-сосудистой системы. Лечебный эффект Са2±антагонистов основан на уменьшении потока ионов Са2+ через потенциал-управляемые.

Са2+ каналы. Однако механизм взаимодействия ФАА с Са2+ каналами до сих пор не определен.

Еще в 1980 году McDonald et al. показали, что характерной чертой ФАА, также как и.

2+ некоторых других Саантагонистов является так называемое «частото-зависимое» действие: усиление блокирования Са2+ каналов с увеличением частоты деполяризации мембраны. Это явление к тому времени уже было хорошо известно исследователям: точно такое же действие оказывали «местные анестетики» на потенциал-управляемые Na+ каналы (Ходоров & Тимин 1975). Неудивительно, что принятая для описания эффектов &bdquo-местных анестетиков" парадигма &bdquo-модулированного рецептора" (НШе 1977, Hodengheim & Katzung 1977) была использована и для объяснения взаимодействия Са антагонистов с Са2+ каналами. Основное предположение этой парадигмы состоит в том, что сродство вещества к рецептору зависит от конформационного состояния канала. В этом котексте предполагается, что при потенциале покоя, когда практически все каналы закрыты, сродство рецептора к Са2±антагонисту очень низка. В результате, лишь малая часть каналов оказывается блокирована веществом. При деполяризации мембраны, большая часть каналов переходит в открытое, а затем и в инактивированное состояние, где сродство рецептора к веществу гораздо выше, и блокирование идет с большой эффективностью. Казалось, что механизм действия Са антагонистов в принципе ясен и оставалось лишь выяснить два вопроса: какое из конформационных состояний канала &bdquo-предпочитает" тот или иной антагонист и какие молекулярные структуры образуют их рецепторы?

Появление метода точечных мутаций дало возможность методом проб и ошибок определять аминокислотные последовательности и отдельные остатки, необходимые для взаимодействия канала с Са2±антагонистами. Уже самые первые пробы дали положительные результаты. Так, Hockerman et al. (1995, 1997) и Doring et al. (1996) обнаружили, что мутации аминокислотных остатков в сегментах IVS6, IIIS6 и Р-петле, предположительно составляющих пору канала, оказывют сильное влияние на ФАА-чувствительность мутантных каналов. Более того, Hering et al. (1996) показали, что перенос всего лишь трех L-тип-специфичных (Cav1.2) аминокислот в сегменте IVS6 в малочувствительный канал класса A (Cav2.1) резко увеличивает частото-зависимый блок в присутствии Са2+ -антагонистов ФАА и бензотиазепинов. Казалось, что рецептор ФАА найден.

Однако, дальнейшие исследования показали, что ситуация не так проста. Выяснилось, что мутации, ослабляющие/ускоряющие инактивацию, как правило ослабляют/ усиливают и частото-зависимый блок в присутствии Са2±антагонистов. Таким образом, по крайней мере некоторые из выявленных точечными мутациями аминокислот -&bdquo-детерминант ФАА-чувствительности" вполне могут не являться частью рецептора, а оказывать лишь косвенное действие на ФАА-чувствительность, модифицируя инактивацию канала.

Стало очевидным существование взаимосвязи между инактивационными свойствами канала и его чувствительностью к веществам-блокаторам. Возникла необходимость более полного понимания, что же такое инактивация и какую роль она играет во взаимодействии каналов с Са2±антагонистами.

Цель и задачи исследования

Целью представленного исследования было изучение инактивационных механизмов высокопороговых Са2+ каналов, их взаимодействия и роли в блокировании каналов Са2±антагонистами фенилалкиламинами.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Создать методику изучения Медленной инактивации высокопорговых Са каналов.

2. Определить, вызывает ли взаимодействие канала с ФАА дополнительное накопление каналов в Медленной инактивации.

3. Исследовать взаимозависимость детерминант ФАА-чувствительности и Быстрой потенциал-зависимой инактивации.

4. Определить роль Са2±зависимой инактивации каналов Cav1.2 в их взаимодействии с ФАА.

2+.

5. Определить, описывается ли воздействие ФАА на Са каналы моделями «блокирование открытых каналов» и/или «высокоспецифичное связывание с инактивацией».

Научная новизна, теоретическое и практическое значение.

1. Разработан метод исследования Медленной инактивации потенциал-управляемых ионных каналов. При помощи этого метода впервые показано, что присутствие ФАА не оказывает влияния на медленную инактивацию.

2. Обоснована кинетическая модель всзаимодействия инактивационных состояний в каналах Cav2.1 и Cav1.2.

3. Определены новые элементы структуры ai-субъединицы Са2+ канала, определяющие его инактивационные свойства. Предложена кинетическая модель, описывающая взаимодействие ai с р-субъединицей.

4. Показана тесная взаимосвязь инактивационных свойств Са2+ каналов с их чувствительностью к фенилфалкиламинам (ФАА).

5. Выдвинута гипотеза взаимодействия ФАА с Са2+ каналами, принципиально отличающаяся от общепринятых в настоящее время моделей.

Апробация работы.

Результаты представленной работы были доложены на семинаре Института.

Биохимической Фармакологии (г. Иннсбрук, 2001). Отдельные результаты докладывались на ежегодном симпозиуме Физиологического Общества.

Великобритании (Харлоу, 1998), 44-ом собрании Американского Биофизического.

Общества (Новый Орлеан, 2000), 6-ом заседании Австрийского Фармакологического.

Общества (Вена 2000), 45-ом собрании Американского Биофизического Общества (Бостон 2001). По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 5 тезисов.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы.