Изучение физиологической роли особого эстроген-связывающего белка печени крыс

Исследования последних лет позволяют рассматривать печень как, важнейший объект, модулятор и посредник многообразных программирующих и регуляторннх эффектов эстрогенов и андрогенов. Половые стероиды оказывают свое действие в этом органе в нескольких направлениях: во-первых, они регулируют проявление собственной активности, а также активности некоторых других гормонов, определяя интенсивность гормонального метаболизма, транспорта и рецепцииво-вторых, посредством комплекса секретируемых печенью факторов оказывают системное влияние на организм (артериальное давление, водносолевой обмен, гемостаз, и др.) (В.Б.Розен, А. Н. Смирнов, 1981; А. Г. Резников, 1981;, 198Ъ&ин^е^АЬегь.

1979).

Для реализации множественного влияния половых гормонов печень обладает гетерогенной системой специфически связывающих их белков, на уровне которой в определенной степени, видимо, осуществляется дискриминация гормональных эффектов. Для эстрогенов такая рецеп-торная система впервые была выявлена и охарактеризована в лаборатории эндокринологии МГУ (О.В.Смирнова с соавт., 1975; А. Н. Смирнов с соавт., 1975,1977; Г. Д. Матарадзе с соавт., 1979). Показано, что в печени крыс содержится три цитоплазматических белка, специфически связывающих эстрадиол. Два из них аналогичны классическим рецепторам матки и являются, видимо, изоформами. Третий, особый эстрогенсвязывающий белок (ОЭСБ), обнаруживаемый только у самцов крыс, существенно отличается от предыдущих целым рядом параметров (А.Н.Смирнов с соавт., 1977; Г. Д. Матарадзе с соавт., 1979). Этот растворимый мономерный белок связывает не только многие эстрогены, но и некоторые аццрогенысродство его к гормону на два порядка ниже, а концентрация связывающих мест — на три порядка выше, чем у классических эстрогенных рецепторовкомплексы, образуемые им с эстрадиолом, отличаются лабильностью и, наконец, ОЭСБ, в отличие от рецепторов, не транслоцируется из ци-тозоля в ядро в комплексе с гормоном в системе и^ ^¿-¿-ъо. в то же время функциональные характеристики этого белка практически не изучены. Можно было лишь предполагать, что поскольку печень является одновременно и объектом действия, и центральным органом метаболизма эстрогенов и андрогенов, то ОЭСБ как органоспецифический белок может иметь существенное значение для цроцессов рецепции и метаболизма половых стероидов. Актуальность вопроса о функциональной роли ОЭСБ определяется важностью понимания динамики половых гормонов в организме, что необходимо для объективной оценки ее роли в физиологическом контроле многих системных процессов.

Раскрытие физиологической роли любого фактора требует разностороннего подхода как в отношении аспектов рассмотрения, так и в отношении уровня исследования. Мы считали целесообразным подойти к вопросу о физиологической роли ОЭСБ с трех сторон.

1. Изучить стереоспецифичность этого белка к различным гормональным соединениям и их метаболитам, для того, чтобы представить себе круг связываемых им лигандов.

2. Исследовать влияние ОЭСБ на аккумуляцию эстроген-рецеп-торных комплексов в ядрах гепатоцитов для того, чтобы оценить роль ОЭСБ в процессе рецепции половых стероидов.

3. Изучить регулируемость ОЭСБ со стороны эстрогенов и андрогенов в опытах: и>ъ I'¿-их.

Необходимо отметить, что к началу нашей работы сведений по указанным вопросам в литературе практически не имелось.

ВЫВОДЫ.

I. Особый эстрогенсвязываклций белок (ОЭСБ) печени самцов крыс специфически связывает биологически активные эстрогены и андрогены, а также некоторые их метаболиты и аналоги.

2* Сродство ОЭСБ к активным эстрогенам на порядок выше, чем к андрогенам.

3. Участки связывания эстрогенов и аддрогенов молекулы ОЭСБ частично перекрываются, но не совпадают полностью:

4. ОЭСБ у самцов крыс участвует в регуляции рецепции эстрогенов, а также опосредует влияние одних стероидов на динамику рецепции других.

5. ОЭСБ в естественных условиях подвергается неонатальной детерминации андрогенами.

6. ОХБ является объектом реципрокной регуляции со стороны андрогенов и эстрогенов: эстрогены обратимо снижают уровень этого белка в генатоцитах, а андрогены повышают его содержание в случае пониженного его уровня и препятствуют проявлению эстроген-ного эффекта.

7. ОЭСБ, вероятно, выполняет буферно-резервирующую и модулирующую функции в общей динамике половых гормонов в клетках печени самцов крыс.

заключение

.

Б последние годы со всей определенностью показано, что половые гормоны способны оказывать многообразные программирующие и регуляторные влияния на функции печени. В связи с этим интенсивно изучается система циторецепции половых стероидов ге-патоцитами. Показано, что по крайней мере для эстрогенов в печени крыс она гетерогенна и цредставлена тремя формами специфических эстрогенсвязывающих белков. Форма I эст-радиолсвязывающих белков, видимо, идентична классическим эстро-генным рецепторам матки (Г.Д. Матарадзе с соавт., 1979). Форма П аналогична по свойствам высокосолевой субъединице формы I и отличается от нее в основном неспособностью образовывать в среде с низкой ионной силой олигомер 8? (Я.Ю. Кондратьев с соавт. 1980). Третья форма, особый эстрогенввязывающий белок, занимает в этой системе уникальное место. ОЭСБ имеется в значительных количествах только у самцов крыс и обладает рядом необычных для эстрогенных рецепторов свойств. Так, образование и распад комплексов эстрадиола с ОЭСБ происходит в течение нескольких минут при 0−4° Сза его связывающие участки с эстрогенами относительно хорошо конкурируют некоторые андрогеныКа для взаимодействия эстрадиола с ОЭСБ на 2 порядка ниже, а концентрация связывающих мест на 2−3 порядка выше, чем для других Ез-связывающих белков печени крыс (А.Н. Смирнов с соавт., 1977). ОЭСБ, в отличие от рецепторов, не транслоцируется в комплексе с эстрадиолом из цитозоля в ядро клетки (Г.Д. Матарадзе с соавт. 1981). Показано, что этот белок не только фактор, связывающий оба типа половых стероидов, но и объект их действия: в печени самок ОЭСБ может быть индуцирован введением им тестостеронцропионата. Для поддержания же уже имеющегося в печени уровня ОЭСБ андрогены не являются необходимыми: отмена введения андрогенов овднзстомирова-нным самкам или кастрация интактных самцов не приводит к исчезновению ОЭСБ даже через 50−60 дней (О.В. Смирновас соавт., 1980).

К началу наших исследований функциональная роль ОЭСБ была неясна. Однако перечисленные данные позволяли предполагать, что этот белок выполняет в клетке печени самостоятельную функцию, отличную от функции классических рецепторов стероидов. Факт высокой чувствительности содержания ОЭСБ в печени к действию половых стероидов указывал на то, что функция ОЭСБ имеет весьма существенное значение для поддержания зависимых от пола процессов жизнедеятельности крыс.

Целью наших исследований и послужило выяснение возможной физиологической роли ОЭСБ. Мы сочли целесообразным рассмотреть эту проблему в трех взаимосвязанных аспектах:

1. Определить круг гормонов, их метаболитов и аналогов, которые сопосбны взаимодействовать с ОЭСБ, а также оценить интенсивность этого взаимодействия.

2. Изучить роль этого белка в процессе аккумуляции гормон-рецепторннх комплексов в ядрах гепатоцитов.

3. Исследовать физиологический контроль содержания ОЭСБ эстрогенами и андрогенами.

Изучение стереоспецифичности сродства ОЭСБ к 57 различным гормональным соединениям в первом разделе нашего исследования позволило нам прийти к следующим заключениям:

1. В основе функционирования ОЭСБ лезщт способность специфически связывать и, очевидно, концентрировать оба типа биологически активных половых стероидов.

2. Наиболее конкурентоспособные в отношении связывания с ОЭСБ лиганды ряда эстрана на порядок активнее производных андро-стана.

3. Структурными детерминантами для взаимодействия с ОЭСБ производных эстрана являются ароматизированное кольцо А, 3и — гидроксилыдетерминанты производных андростана — 17/5 -гидроксил, транс-сочленение колец, А и В, некоторые особенности структуры кольца А.

4. Участки связывания эстрогенов и андрогенов перекрываются, но не совпадают полностью.

5. Во многих случаях степень биологической активности стероидов (оцениваемая по известным эффектам в:-классических органах-мишенях) прямо соотносится с их сродством к ОЭСБ.

Наличие конкурентных отношений мевду эстрогенами и андро-генами, с одной стороны, и между различными представителями внутри каждого из этих типов стероидов, с другой, в совокупности с лабильностью комплексов ОЭСБ с лигандами могут создать реальную основу для функционирования этого белка в качестве резервирующего фактора и посредника взаимного влияния половых стероидов и их метаболитов на внутриклеточную концентрацию и проявление эффектов этих гормональных соединений в ткани печени. Уступая эстрогенам в сродстве к ОЭСБ, андрогены значительно преобладают в количественном отношении фьЬ-Оуь, AZuttktj 1975). Это в первом приближении выравнивает возможности двух групп гормонов в образовании комплексов с ОЭСБ. Изменение концентрации в крови и, соответственно, в гепатоцитах стероидов одного ряда за счет конкуренции за связывающие центры ОЭСБ и благодаря лабильности стероид-белковых комплексов может привести к временному изменению с противоположным знаком количества комплексов с ОЭСБ стероидов другого ряда. В результате соотношение гормонов в клетке восстанавливается. Аналогично может поддерживаться количественное соотношение уровней разных стероидов внутри одного ряда.

Таким образом, оценивая роль ОЭСБ в общей динамике половых стероидов, можно, видимо, говорить о нем как о буферном белке, сглаживающем в клетках печени перепады концентраций гормонов в с крови. Высокая емкость ОЭСБ в печеночной ткани, 10 м (А.Н. Смирнов с соавт., 1977), также свидетельствует в пользу" этого предположения. Очевидно, что стабилизирующая функция ОЭСБ проявляется лишь в условиях отклонения от состояния динамического равновесия между продукцией и деградацией гормонов, что практически постоянно имеет место в естественных условиях.

ОЭСБ, видимо, может функционировать и как модулятор интенсивности метаболических превращений, причем, как в пределах одного ряда стероидов, так и при трансформации андрогенной активности в эстрогенную. Последняя возможность основана, как известно, на ароматизации андрогенов (А.Г. Резников, 1982).

В обоих случаях ОЭСБ может усиливать метаболизм того или иного стероида по типу положительной обратной связи, при уеловии, что конечный или промежуточный продукт метаболических превращений конкурирует с субстратом этой реакции за связывание белком.

С другой стороны, возможно, что по отношению к эстрогенам, сродство к которым у ОЭСБ на порядок выше, чем к андрогенам, он может выполнять цротивоположную по физиологическому смыслу функцию, предохраняя их от воздействия ферментов стероидного метаболизма и способствуя их рецепции. Это предположение кажется реальным, поскольку ОЭСБ в большом количестве содержится в печени самцов крыс и практически отсутствует у самок, в то же время концентрация эстрогенов у самцов на порядок ниже, чем у самок (Ъбккг, 1А/иЛке., 1975). Может быть, выступая в роли «ловушки» для эстрогенных гормонов у самцов, ОЭСБ сохраняет их дяя реце-пторного аппарата гепатоцитов и, тем самым для их биологического действия. Таким образом, буферирующая функция ОЭСБ может проявляться и при взаимодействии гормонов с рецепторами.

Проверкой этого цредположения послужили эксперименты второго раздела нашей работы. Результаты их позволяют сформулировать следующее заключение:

1. ОЭСБ у самцов участвует в регуляции рецепции эстрогенов.

2. ОЭСБ способен опосредовать влияние одних половых стероидов на динамику рецепции других.

3. Буферирующим эффектом ОЭСБ объясняется половой диморфизм в характере аккумуляции эстроген-рецепторных комплексов в ядрах гепатоцитов крыс при введении животным эстрадиола.

Иными словами, при увеличении концентрации в крови секрети-рующего эстрогена или андрогена ОЭСБ тормозит накопление соответствувдих гормон-рецепторяых комплексов, в то время как для других гормонов, способных взаимодействовать с ОЭСБ, возможности образования комплексов с рецепторами увеличится. При постоянной концентрации половых гормонов в крови влияние ОЭСБ на их рецепцию, видимо, не должно цроявляться.

Следует подчеркнуть, что буферизующий эффект ОЭСБ в отношении рецепции стероидов не является единственным. ОЭСБ способен проявлять свойства истинного регулятора, модулируя ядерную аккумуляцию комплексов рецепторов со стероидами.

Показанная нами важная роль ОЭСБ в обп$ динамике и рецепции половых стероидов делает закономерным вопрос о физиологических механизмах регуляции содержания ОЭСБ в гепатоцитах со стороны эстрогенов и андрогенов.

С этой целью в третьем разделе нашей работы был проведен ряд экспериментов сиvivo, результаты которых позволили заключить:

1. Андрогены являются как первичными детерминаторами, так и последующими регуляторами и стабилизаторами уже индуцированного •уровня этого белка.

2. Сущность обратимого регуляторного влияния эстрогенов сводится к снижению уровня ОЭСБ, при этом они не препятствуют индукции ОЭСБ андрогенами.

Физиологический смысл такого рода влияний эстрогенов, возможно, состоит в следующем. Стабильно и длительно повышенная концентрация эстрогенов в клетках печени самцов может привести к феминизации ряда функций. ОЭСБ прочно связывает эстрогенные гормоны и, вероятно, цредохраняет их от действия ферментов стероидного метаболизма, поэтому поддержание его количества на фоновом физиологическом уровне в такой ситуации биологически нецелесообразно. В регуляцию эндокринного равновесия в таком случае, видимо, включаются механизмы, контролирующие содержание ОЭСБ (уменьшающие его уровень в клетке цри повышенной концентрации эстрогенов). Это предположение подтверждается поставленным нами модельным экспериментом: при достаточно длительном введении самцам крыс Е2 (рис. II) содержание ОЭСБ уменьшалось.

Андрогены в свою очередь оказывают на уровень ОЭСБ два типа регуляторных эффектов. С одной стороны, эти гормоны обладают стимулирующим действием, но только в тех ситуациях, когда исходная концентрация ОЭСБ понижена. Причины возникновения низкого уровня ОЭСБ могут быть различны: дефицит эндогенных андрогенов в связи с неполовозрелостью или кастрацией, ингибиторное действие эстрадиола. Во всех етих случаях регуляторное действие андрогенов нацравлено на восстановление и поддержание оптимального уровня ОЭСБ, характерного для половозрелых самцов. С другой стороны, введение андрогенов, не влияя црямо на уровень ОЭСБ в печени половозрелых самцов, способно стабилизировать нормальную концентрацию ОЭСБ у них, снижая степень реализации тормозного эффекта эстрадиола.

Наличие у крыс обоего пола сопоставимых количеств половых стероидов (В.Б. Розен, 1983, /1/ог^бЛ, 1981), делает возможным в естественных условиях комплексную регуляцию содержания ОЭСБ, отражающую изменение как концентрации половых стероидов, так и их соотношение.

Как уже неоднократно отмечалось, содержание ОЭСБ в гепатоци-тах самцов крыс резко преобладает над концентрацией этого белка у самок. Наши исследования показали, что такая шмовая дифференцировка является результатом андрогенизации сшад в. неона-тальном периоде их о тогенеза в естественных условиях.

Возможно, что 0Э0Б необходим самцам I) Для предотвращения феминизации в условиях повышения по какой-либо причине уровня эстрогенов (буферная роль белка);

2) для сохранения эффективного уровня этих гормонов, содержащихся у них обычно в низкой концентрации, но необходимых для различных эффектов в печени (резервирующая роль).

С другой стороны, буферно-резервирующий белок, подобный ОЭСБ, может быть весьма полезен в условиях высокого и постоянно меняющегося уровня авдрогенов как стабилизирующий фактор в печени.

В отличие от самцов крыс, у самой отсутствует столь резкая разница в содержании эстрогенов и авдрогенов, а их колебания в физиологических условиях, вероятно, имеют хорошо отрегулированный на уровне гипоталамо-гипофизарно-гонадальной системы, ритмичный характер. Возможно, что поэтому сажа не нуждается в специальных механизмах поддержания баланса двух типов половых стероидов на уровне печени. Более того, белок, обладающий большой емкостью и высоким сродством к эстрогенам, мог бы оказать нежелательное сглаживание эффекта кратковременного повышения концентрации эстрогенов в проэструсе у самок крыс.

Все полученные в нашей работе результаты обобщены на схеме, изображенной на рис. 13. В клетках печени самцов крыс половые стероиды, во-первых, связываются соответствующими рецепторами половых гормонов, во-вторых, взаимодействуют с ферментами стероидного метаболизма, в-третьих, комплексируются с ОЭСБ. При стабильном эндокринном статусе организма эта система находится в состоянии.

ЭФФЕКТЫ^.

ОЭСБ Э = ОЭСБ А.

ОЭСБ М, а ОЭСБ Мд.

Рис- 13, Схема распределения половых стероидов в гепатоцитах самцов крыс.

Условные обозначения: Э — эстрогеныА — андрогены;

Ф — ферменты стероидного метаболизмаРэрецепторы эстрогеновРарецепторы андрогеновМэ и Ма — соответствующие метаболиты. динамического равновесия: часть гормонов в комплексе с цитоплаз-матическими рецепторами транслоцируется в ядро, осуществляя специфические гормональные эффекты, часть — подвергается метаболизму. Стероиды, связанные с ОЭСБ, выключены из сферы биологического действия и метаболических превращений. В этом состоит резервирующая функция белка. При изменении концентрации эстрогенов или андрогенов (суточные, сезонные ритмы, стресс и др.) реализуется буферная функция ОЭСБ.

ОЭСБ, вероятно, может выступать в роли модулятора внутриклеточной концентрации обоих типов свободных половых стероидов, поскольку изменение по какой-либо причине количества гормонов одного ряда цриведет к изменению количества свободных гормонов другого ряда за счет конкуренции эстрогенов и андрогенов за связывающие участки белка и лабильности образуемых ими комплексов с ОЭСБ.

Кроме того, как уже отмечалось, ОЭСБ подвержен реципрокной регуляции со стороны связываемых им половых стероидов, что создает возможность изменения степени участия ОЭСБ в динамике половых гормонов в клетках печени.