Цитотоксическое и апоптогенное действие индукторов дифференцировки клеток линии К562

Проблемы регуляции важнейших клеточных функций, таких как пролиферация, дифференцировка, апоптоз, имеют значение не только для понимания фундаментальных основ жизнедеятельности организма на разных уровнях его организации, но и для поиска оптимальных способов воздействия на указанные клеточные функции при нормально протекающих физиологических процессах, либо при возникновении патологических состояний, в частности, злокачественных опухолей. В настоящее время вопрос о существе регуляторных механизмов внутриклеточных процессов остается открытым. Клетки иммортализованных опухолевых линий являются подходящей экспериментальной моделью для всестороннего изучения биохимических процессов, протекающих в клетках при действии химических реагентов, обладающих различным механизмом действия и способных в зависимости от условий обработки, т. е. типа клеточной линии, времени инкубации, дозы реагента, индуцировать/ингибировать ту или иную клеточную функцию, в том числе, дифференцировку.

Дифференцировка — процесс появления различий между клеткамивнешнее выражение детерминации, проявляющееся в формировании морфологических и функциональных признаков специализации (Епифанова, 1997). Многие цитостатики, используемые в химиотерапии опухолей человека (цис-диаминодихлорплатина, этопозид (VP-16), адриамицин и другие) также способны индуцировать дифференцировку клеток опухолей in vivo или опухолевых линий in vitro, в частности, клеток человеческой эритромиелолейкозной линии К562 (Parodi et al., 1988; Jeannesson et al., 1997). Так, обработка клеток К562 1-fi-D-арабинофуранозилцитозином, адриамицином, бутиратом натрия, некоторыми другими соединениями приводит к индукции эритроидной дифференцировки, что может быть зарегистрировано по усилению синтеза гемоглобина и гликофо-ринов, А и С (Gahmberg et al., 1979; Okabe-Kado et al., 1986). Напротив, форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) и дексаметазон способны ингибировать проявление эритроидной дифференцировки клеток К562 и индуцировать мегакариоцитарную и/или моноцито-макрофагальную дифференцировку клеток указанной линии (Watanabe et al., 1985; Butler et al., 1990). Индукция как эритроидного, так и миелоидного путей дифференцировки клеток К562 тесно связана с подавлением пролиферации, а во многих экспериментальных моделях с гибелью клеток, которая может протекать по механизму апоптоза (Benito et al., 1996) или некроза (Leist et al., 1997), а в случае обратимости дифференцировочных изменений с сохранением части клеток с последующим их ростом и появлением резистентного к индуктору клона.

Апоптоз, или программированная клеточная гибель, — процесс, в результате которого элиминируются утратившие свою функцию, дефектные клетки или патологические элементы (Малашичева и др., 1998). Процесс апоптоза, характеризующийся разборкой клеточных компонентов и олигонуклеосомной фрагментацией ядерной ДНК, может быть индуцирован как in vivo, так и in vitro целым рядом химических реагентов (Тронов, 1999), а также возникать в клетках-мишенях при взаимодействии с естественными киллерными клетками (ЕКК) и цитотоксическими Т-лимфоцитами (Podack, Kupfer, 1991). Поскольку главную функцию противоопухолевого надзора в организме несут естественные киллер-ные клетки (Barao, Ascensao, 1998), то они будут взаимодействовать как с «нативными», так и с «дифференцированными» опухолевыми клетками, и диф-ференцировочный статус последних может влиять на чувствительность опухолевых клеток к неспецифическому цитотоксическому лизису (НЦТ-лизису) ЕКК. Литическая активность последних не рестриктирована по антигенам главного комплекса гистосовместимости (МНС) и проявляется по отношению к широкому спектру клеточных линий, прежде всего опухолевых (Робинсон, Труфакин, 1991). Однако, запуск литического действия ЕКК определяется непосредственным взаимодействием клеток-эффекторов и клеток-мишеней, что в свою очередь тесно связано с особенностями мембранного фенотипа взаимодействующих клеток и с наличием в клетках-мишенях целого рада ядерных и цитоплазматиче-ских белковых факторов, контролирующих индукцию и протекание апоптоза.

Таким образом, обозначенная проблема заключается в том, что обработка клеток (in vivo или in vitro) антиопухолевыми агентами или иными химическими соединениями может сопровождаться запуском процессов дифференцировки и/или апоптоза, что должно оказывать непосредственное влияние на чувствительность клеток опухолей или опухолевых линий к литическому действию ЕКК.

В связи с этим, цель настоящей работы состояла в изучении биологического действия ряда структурно различных ксенобиотиков с точки зрения их способности индуцировать дифференцировку и/или апоптоз опухолевых клеток К562 и модулировать их чувствительность к НЦТ-лизису ЕКК. В задачи исследования входило:

1. Изучить цитотоксическое и антипролиферативное действие на клетки К562 химических реагентов с известным механизмом действия, а также новосин-тезированных соединений ряда хинолина и пиридинапостроить дозовые и временные зависимости для каждого из изучаемых ксенобиотиковдля производных ряда хинолина и пиридина определить ЕС50;

2. На основе данных по токсичности определить дифференцирующую активность нетоксичных доз каждого из исследуемых индукторов и их комбинаций с точки зрения способности индуцировать или подавлять эритроидную дифференцировку клеток К562;

3. Установить временные и дозовые зависимости запуска апоптотических процессов (фрагментации ДНК) в опухолевых клетках при единичной и со-четанной обработке клеток индукторами эритроидной и миелоидной диф-ференцировки;

4. На основе данных по индукции повреждений (фрагментации ДНК) провести сравнительный анализ алоптогенной и дифференцирующей активностей исследуемых ксенобиотиков;

5. Определить модулирующее действие индукторов эритроидной и миелоидной дифференцировки и их комбинаций на чувствительность клеток К562 к НЦТ-лизису нативными лейкоцитами человека и крыс.

Научная новизна: Впервые экспериментально определено влияние соче-танного действия индукторов эритроидной и миелоидной дифференцировки клеток линии К562 на чувствительность опухолевых клеток к НЦТ-лизису спленоцитами крыс и лейкоцитами периферической крови (ЛПК) человекаустановлено, что и дифференцировка, и апоптоз вносят вклад в модуляцию НЦТ-лизиса клеток-мишеней клетками-эффекторамина основе полученных данных предположено, что ингибирование тимидин-индуцированной эритроидной дифференцировки клеток К562 в условиях инкубации с ФМА сопровождается снижением их чувствительности к литическому действию ЕКК за счет подавления апоптоза (фрагментации ДНК). Изучено дифференцирующее и апоптогенное действие ряда известных (Q, 2-MeQ, QO, 2-MeQO, 4-NQO, 2-Me-4-NQO) и ново-синтезированных (DQO, DPyO) производных хинолина и пиридина, обладающих высокой способностью связываться с ароматическими гетероцик-лами, включая азотистые основания нуклеиновых кислот, нуклеозидами, нук-леотидами и ДНКустановлено, что наиболее сильный апоптогенный эффект в опухолевых клетках имеет место при обработке реагентами, способными к наибольшему связыванию с ДНК (по данным определения УФ-спектров), при этом дифференцирующая активность исследуемых ксенобиотиков может отсутствовать.

Теоретическая и практическая значимость работы заключается в изучении с использованием модельной системы сочетанного действия индукторов различных путей дифференцировки опухолевых клеток на ряд важнейших клеточных функций, в том числе чувствительность к НЦТ-лизису эндогенными ЕКК. Значительное количество антиопухолевых соединений обладают дифференцирующей активностью по отношению к клеткам опухолей in vivo и опухолевых линий in vitro, проявляющуюся в зависимости от дозы используемого реагента и условий обработки. В связи с этим, нами показано, что при сочетанной обработке опухолевых клеток, в частности, клеток линии К562, индукторами эритроидной и миелоидной дифференцировки может наблюдаться как снижение, так и увеличение чувствительности клеток к НЦТ-лизису ЕКК. Таким образом, при клиническом использовании комбинаций антиопухолевых агентов необходимо учитывать эффекты модуляции клеточных функций, в частности, чувствительности к литическому действию ЕКК, возникающие под действием (или на фоне) каждого составляющего комбинации.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. Индукция дифференцировки клеток опухолевых линий в условиях обработки химическими реагентами.

При обработке клеток опухолевых линий in vitro некоторыми агентами возникает сложная цепь событий, приводящая к фенотипическому созреванию или дифференцировке клеток. С нормально протекающим процессом дифференцировки в клетках и тканях организма человека и животных in vivo диффе-ренцировочные процессы, индуцированные или протекающие спонтанно в культуре опухолевых клеток, роднят два обстоятельства: снижение или подавление пролиферации клеток и появление морфологических и биохимических признаков дифференцированных клеток той или иной гистогенетической линии. Примерами могут служить экспрессия иммуноглобулинов класса М в клетках линий человеческих B-XJIJI при обработке активатором протенкиназы С (ПКС) форбол-12-миристат-13-ацетатом (ФМА) (Totterman et al., 1982), экспрессия гемоглобина в клетках человеческой эритромиелолейкозной линии К562 и в индуцированных вирусом лейкоза Френд мышиных эритролейкеми-ческих клетках MEL в условиях инкубации с гемином, диметилсульфоксидом (ДМСО), бутиратом натрия и другими соединениями (Levy et al., 1975; Eisbruch et al., 1988; Baliga et al., 1993). Вместе с тем, инкубация клеток К562 с ФМА приводит к подавлению базального уровня синтеза гемоглобина и гликофорина, А и появлению маркеров мегакариоцитарных и/или моноцито-макрофагальных клеток (Sutherland et al., 1986; Butler et al., 1990). С другой стороны, ФМА, а также синтетический глюкокортикоид дексаметазон ингибируют проявление эритроидной дифференцировки клеток К562 и MEL, соответственно индуцированной упомянутыми выше агентами, а также 1-p-D-арабинофуранозилцитозином (Watanabe et al., 1985) и гексаметиленбисацета-мидом (Chang et al., 1993).

Линии, имеющие другое гистогенетическое происхождение, при индукции дифференцировки in vitro также демонстрируют свойства того клеточного типа, из которого они произошли. Например, ФМА способен опосредовать плазмацитомную дифференцировку B-клеточных лимфомных линий, несущих 8:14-транслокацию (Benjamin et al., 1984), а клетки промиелоцитарной линии HL-60, обработанные индукторами дифференцировки, показывают, помимо остановки клеточного деления, пониженную грануляцию, потерю ядрышек, повышенную плавучую плотность, усиление активности ?-нафтилбутиратэ-стеразы и продукцию супероксидных радикалов Ог (Chaplinski et al., 1986). В данном случае дифференцировка HL-60 запускалась целым рядом индукторов: ДМСО, Мб, 02-дибутирил-цАМФ, 1,25-дигидроксивитамином D3, ФМА, а также простагландином Ег и теофиллином. Обработка клеток HL-60 ретиноевой кислотой (RA) приводит к высвобождению в инкубационную среду низкомолекулярного фактора, способного вызывать дифференцировку исходных клеток в гранулоциты (Нуриева, 1997). Этот фактор (L-глутаминовая кислота) резко снижает аффинитет связывания интерлейкина-1 и способствует увеличению числа связывающих сайтов для опухоленекротизирующего фактора? (TNF?). Интересно, что клетки HL-60 не имеют специфических глутамат-связывающих сайтов (Нуриева, 1997), следовательно действие указанного фактора дифференцировки опосредуется через гормональную регуляцию роста клеток линии HL-60.

Соединения, запускающие указанные процессы в опухолевых клетках, индукторы дифференцировки, могут быть как биологического происхождения (трансформирующий ростовой фактор? (Benito et al., 1996)), ингибиторы репликации ДНК (афидиколин (Murate et al., 1990)) и транскрипции (актиномицин D (цит. по: Okabe-Kado et al., 1986)), продукты распада гемоглобина (гемин (Baliga et al., 1993)), алкалоиды (например, фагаронин (Benoist et al., 1989)), так и низкомолекулярными органическими соединениями, такими как ДМСО, бу-тират натрия, гексаметиленбисацетамид и другие (Ahmed et al., 1991; Yabushita, Sartorelli, 1993).

Различия в структуре индукторов обусловливают и различия в механизме действия на клетки. Например, бутират натрия является ингибитором гистоно-вых деацетилаз (Lea, Randolph, 1998), этопозид подавляет активность топоизомеразы II (Burden et al., 1996; Meyer et al., 1997), гербимицин A ингибирует активность тирозинпротеинкиназ (Ношпа et al., 1989), ДМСО может осуществлять свое действие на клетки через изменение величины мембранного потенциала плазматической мембраны (Arcangeli et al., 1987). При этом наблюдается модуляция состава и распределения цитоплазматических а-РНП-частиц, содержащих антисмысловую а-РНК (Константинова и др., 1996). Теофиллин, Ыб, 02-дибутирил-цАМФ, простагландин Ег увеличивают внутриклеточную концентрацию цАМФ, что, очевидно, приводит к активации цАМФ-зависимых протеинкиназ (Северин, Кочеткова, 1985). В свою очередь ФМА активирует ПКС (Ivanov et al., 1994), в том числе ядерные изоферменты ПКС (Leach, Raben, 1993). ПКС и цАМФ-зависимые протеинкиназы способны фосфорилиро-вагь (по остаткам серина и треонина) как белки ядерного матрикса (лимин), так и ДНК-связывающие белки, например, топоизомеразу I и гистоны (Edashige et al., 1992; Pommier et al., 1990). Указанная посттрансляционная модификация белков принимает непосредственное участие в регуляции структурно-функционального состояния хроматина (Кучеренко и др., 1983), лежащего в основе протекания всех важнейших внутриклеточных процессов, в том числе и выбора направления дифференцировки клетки.

Известны работы, посвященные исследованию возможной роли АДФ-рибозилирования белков в дифференцировке эритролейкемических клеток селезенки мышей (клетки Френд), растущих в культуре. Растл и Светли (Rastl, Swetly, 1978), используя линию клеток F4H, которые чувствительны к индуцируемой бутиратом дифференцировке и относительно нечувствительны к гекса-метилен-бис-ацетамиду, показали, что использование подобных веществ для дифференцировки вызывает двухкратное повышение активности поли (АДФ-рибозо)-полимеразы (ПАРП) и снижение концентрации внутриклеточного NAD+. Мориока с сотрудниками (Morioka et al., 1980), используя линию клеток 745, показали, что после обработки гексаметилен-бис-ацетамидом или ДМСО в ранне-экспоненциальной фазе роста (14−24 ч) наблюдается понижение синтеза поли (АДФ-рибозо)-полимеразы. При использовании бутирата натрия происходит кратковременное повышение активности фермента, а через 48−72 ч она становится такой же, как при использовании гексаметилен-бис-ацетамида и ДМСО. Обработка клеток канцерогенными или мутагенными соединениями, индуцирующими образование разрывов молекулы ДНК, также может приводить к истощению запасов внутриклеточного NAD+ через стимуляцию активности ПАРП (Jacobson, Jacobson, 1978).

Хорошо известно, что хинолин и многие его производные обладают канцерогенной и/или мутагенной активностями (Kawazoe et al. 1978; Ushijima et al. 1995; Davis et al. 1996; Nagao et al. 1997). В частности, хинолин является гепа-токанцерогеном у крыс и мышей (Suzuki et al. 1998). Некоторые потенциально канцерогенные производные хинолина образуются при жарке в процессе приготовления пищи (Stone et al. 1998). Указанные биологические активности этих, как и многих других ксенобиотиков, часто обусловлены не ими самими, а их метаболитами, образовавшимися в клетках ферментативным путем (Stone et al. 1998), в частности, под действием цитохрома Р-450 (Josephy et al., 1999). Очевидно, что возможность и характер метаболической активации существенно зависят от структуры молекулы, в том числе наличия заместителей в определенных положениях хинолинового ядра (Saeki et al. 1997). Исходные соединения, а также их образованные метаболиты, обладают способностью к взаимодействию с ДНК клеток, поэтому представляет интерес всестороннее изучение биологической активности соединений ряда хинолина и пиридина, а также их N-оксидных производных.

Поскольку одним из аспектов настоящего исследования является изучение биологических эффектов действия на клетки К562 производных хинолина и пиридина, следует остановиться на механизме взаимодействия с ДНК одного из изучаемых соединений, 4-нитрохинолин-1-оксида. Последний является мощным канцерогеном при введении животным (Сейц, Князев, 1986) — его канцерогенная активность напрямую зависит от метаболической активации (с участием ферментов DT-диафоразы и серил-тРНК-синтетазы) до монои диаце-тильных производных 4-гидроксиаминохинолин-1-оксида (Galiegue-Zouitina et al., 1985). Указанные метаболиты связываются ковалентно с ДНК, давая ад-дукты с гуанином и аденином. Образование указанных аддуктов приводит к целому ряду последствий, от разрывов ДНК до подавления активности ДНК-ассоциированных ферментов, например, 3'-5'-экзонуклеазной активности Т4 ДНК-полимеразы (Panigrahi, Walker, 1986). Помимо этого, 4-нитрохинолин-1-оксид и другие подобные соединения способны связываться с ДНК некова-лентно (Winkle, Tinoco, 1979), что должно приводить к иным биологическим эффектам, в частности, к запуску или подавлению той или иной дифференци-ровочной программы, например, эритроидной, в случае клеток линии К562. В основе этого лежит активация/ингибирование экспрессии ряда эритроид-специфических транскрипционных факторов, в частности, GATA-1, GATA-2, SCL, NF-E2 (Aplan et al., 1992; Zhang et al., 1995), отвечающих за индукцию экспрессии нескольких групп генов, в данном случае глобиновых, гликофори-нов, А и С (Wiener et al., 1998), и других.

Итак, многие цитостатики способны, в зависимости от условий обработки, индуцировать дифференцировку клеток опухолей in vivo и опухолевых линий in vitro. Используемые индукторы дифференцировки (например, АраЦ, ак-тиномицин D) могут прямо взаимодействовать с ДНК клеток, либо (например, ДМСО, бутират натрия, гемин и другие) модулировать активность различных внутриклеточных белков, связанных с ДНК, либо иных внутриклеточных структур. Поскольку в результате действия дифференцирующих агентов на клетки опухолей и опухолевых линий могут возникать разрывы ДНК (Lindahl et al., 1995), то не исключено, что помимо подавления пролиферации, в ряде экспериментальных систем будет наблюдаться активация процессов репарации и/или запуск программированной клеточной гибели (апоптоза) (Solary et al., 1994; Garcia-Bermejo et al., 1997; Тронов, 1999). Оба процесса являются энергозависимыми, то есть протекают с потреблением АТФ (а также никотинамид-ных коферментов), и в ряде случаев конкурируют за использование указанных соединений (Тронов, 1999), внутриклеточный уровень которых в свою очередь может контролировать как протекание апоптоза, так и репарации (Richter et al., 1996). Кроме того, тип дефектов ДНК может в какой то степени определять тип клеточной гибели. Так, трудно репарируемые двухнитевые разрывы ДНК могут стать устойчивым сигналом к апоптозув отличие от них однонитевые разрывы репарируют, истощают внутриклеточные запасы АТФ и NAD+, делая, таким образом, некроз более вероятной формой клеточной гибели (Тронов, 1999).

II. Влияние дифференцирующих агентов на экспрессию некоторых белковых факторов, вовлеченных в индукцию или подавление апоптоза.

Апоптоз, или программированная клеточная гибель (ПКГ) является генетически детерминированным процессом, который может протекать в нормальных клетках и тканях организма на определенных стадиях онтогенетического развития, либо может быть индуцирован в тех же самых клетках и тканях организма in vivo и полученных из них клеток и клеточных линий in vitro (Chao, Korsmeyer, 1998). Равновесие между пролиферацией и гибелью клеток является определяющим фактором нормального развития организма. Нарушение контроля клеточной гибели в процессе роста и развития тканей и органов может привести к возникновению различных патологических состояний, таких как злокачественные новообразования, нарушения иммунного ответа, аномалии развития (Куцый и др., 1999).

Апоптотическая гибель может быть запущена самыми разнообразными физическими, химическими и биологическими факторами, но финальные фазы процесса протекают сходным образом независимо от индуктора гибели и типа клеток (Малашичева и др., 1998). Клетки претерпевают определенные морфологические изменения, отражающие происходящие в них биохимические процессы, которые сопровождаются энзиматической олигонуклеосомной фрагментацией ядерной ДНК (образуются фрагменты, кратные 200 парам нуклеотидов) с последующей разборкой всех клеточных компонентов и образованием, так называемых апоптотических телец (Hale et al., 1996).

Разборку цитоплазматических и ядерных компонентов клетки осуществляют специфические протеазы, в частности, каспазы (ICE-подобные протеазыот interleukin-1-p-converting ешуте), кальпаины и эндонуклеазы. Ферменты активируются в протеолитическом каскаде и лизируют специфические суб.

Л i страты (Куцый и др., 1999). Например, кальпаины, илиактивируемые нейтральные протеиназы (ЕС 3.4.22.17) относятся к числу цистеиновых протеиназ, повсеместно распространены и обнаруживаются фактически во всех изученных клетках эукариот (Suzuki, Murachi, 1978; Немова, Сидоров, 1985; Немова, 1996; Мухин и др., 2000), локализуются в цитозоле клеток и могут гидролизовать большое количество белковых субстратов (транскрипционные факторы N-myc, c-Fos, c-Junмембранные белки — спектрин, а-адренорецептор и др.- белки ци-тоскелета и сократительные белки (фодрин, виментин, тубулин, тяжелую и легкую цепи миозина и др.), а также фосфолипазу Су I, фосфодиэстеразы циклических нуклеозидмонофосфатов, гистоновые белки хроматина), в том числе подвергаться аутопротеолизу (Johnson, 1990). Вместе с тем, несмотря на широкое разнообразие субстратов, доступных действию кальпаинов, предполагается, что они могут выполнять в клетках узкоспециализированные регуляторные функции, например, модулировать активацию клеток за счет протеолитическо-го ращепления протеинкиназы С (Melloni et al., 1986) или влиять на индукцию апоптоза, в частности, за счет протеолиза белка р53 (Kubbutat, Vousden, 1997).

Апоптотический путь (в частности, активация каскада ICE-протеаз и освобождение из митихондрий цитохрома с, индуцирующего апоптоз) контролируется семейством белков Вс1−2, которые могут функционировать как агони-сты (Вах, Bak) или как антагонисты (Bcl-2, Вс1-Х) апоптоза. Белки этого семейства представляют собой новый тип онкогенов, которые не стимулируют пролиферацию, но модулируют апоптоз клеток (Chao, Korsmeyer, 1998). При индуцированной дифференцировке клеток опухолевых линий также наблюдается значительная модуляция экспрессии белков Вс1−2-семейства. Экспрессия белков Вс1−2-семейства существенно различается в зависимости от клеточной линии (Campos et al., 1999). Например, белок Bcl-xL, родственный Bcl-2, сильно экспрессирован в клеточных линиях с эритроидными и мегакариоцитарны-ми свойствами (К562, HEL, СМК, Мо7Е) и умеренно выражен в незрелых мие-лоидных клеточных линиях (KG-1 и KCL-22). Продукт гена bcl-2 слабо экспрессирован в клетках перечисленных линий. В клетках более зрелых миело-идных клеточных линий HL-60 и PL-21 экспрессия Bcl-xL не определяется, тогда как Вс1−2 был сильно экспрессирован в них и в клеточных линиях с моно-цитарными свойствами U937, ТНР-1, JOSK-1 (Benito et al., 1995, 1996; Terui et al., 1998).

Обработка клеток опухолевых линий дифференцирующими агентами, как правило, сопровождается модуляцией экспрессии генов? с/-2-семейства. Так, например, при обработке клеток человеческих эритролейкемических линий К562 и HEL гемином (а также ретиноевой кислотой, либо ФНОа) наблюдается эритроидная дифференцировка клеток указанных линий, которая сопровождается подавлением экспрессии Bcl-xL-мРНК и соответствующего белка. Экспрессия проапоптотического белка Вах в этих условиях обработки клеток не изменялась (Benito et al., 1996).

Понижение количества Bcl-2- и Вах-белков в клетках HL-60 наблюдается в условиях обработки клеток индукторами моноцито/макрофагального (ФМА), либо гранулоцитарного (ДМСО, ретиноевая кислота) направлений дифференцировки этих клеток, что сопровождается индукцией в них апоптоза (Benito et al., 1995; Mengubas et al., 1996). Сублиния клеток HL-60, несущая трансфицированный ген bcl-2 и экспрессирующая повышенные уровни продукта этого гена, демонстрировала сниженный апоптотический ответ в указанных условиях обработки (Benito et al., 1995). Понижение экспрессии белка Bcl-2 в клетках линий HL-60 и U-937 с сопутствующей моноцитарной дифференцировкой и апоптозом может быть достигнуто в условиях обработки клеток моносахаридным эфиром масляной кислоты (Calabresse et al., 1994). Масляная кислота и ее натриевая соль являются мощными ингибиторами пролиферации клеток и индукторами дифференцировки (Newmark, Young, 1995) Дифференцирующая и апоптогенная активности этих соединений могут быть подавлены в условиях повышенной экспрессии в клетках трансфицированного гена Ъс1−2 (Mandai, Kumar, 1996).

Обработка чувствительных к дифференцировке клеток линии человеческого промиелоцитарного лейкоза NB4 ретиноевой кислотой приводит к резкому снижению экспрессии гена bcl-2, что сопровождается терминальной дифференцировкой этих клеток (Bruel et al., 1995). Обработка ретиноевой кислотой резистентных к дифференцировке клеток сублинии NB4-R1 не влияет на экспрессию гена bcl-2. Во втором случае наблюдается более сильная индукция апоптоза клеток (Bruel et al., 1995).

Высокие уровни экспрессии белка Bcl-2 в клетках больных OMJI коррелируют с низкими темпами полной ремиссии и плохим прогнозом (Campos et al., 1999). Чувствительность бластных клеток OMJI к цитотоксическому действию АраЦ может быть повышена при условии подавления экспрессии белка Bcl-2 с помощью антисмысловых олигонуклеотидов. Понижение экспрессии белка Bcl-2 в клетках OMJI-линий и сопутствующее повышение их чувствительности к АраЦ может быть достигнуто при 24−72-часовой обработке этих клеток ретиноевой кислотой (Bradbury et al., 1996). Эффект наблюдается и в случае клеток К562.

Обработка клеток линии человеческой аденокарциномы MCF-7 бутира-том натрия приводит к понижению экспрессии мРНК Вс1−2 и самого белка. При этом наблюдается подавление пролиферации и индукция апоптоза клеток (Mandai, Kumar, 1996).

Высокая экспрессия гена bcl-2 наблюдается в опухолевых клетках из неходжкинских лимфом и пациентов с XJIJI (Filip, Rozynkova, 1994). Повышенный уровень экспрессии гена bcl-2 наблюдается, кроме того, в гемои лимфопоэтических предшественниках, а также в лимфоцитах периферической крови, активированных сочетанием ФМА и фитогемагглютинина (Filip, Rozynkova, 1994). Показано, что мРНК Вс1−2 экспрессирована во всех изученных авторами цитируемой работы CD5+ клонах B-XJIJI, в то время как в нормальных свежеизолированных CD5+ B-клетках мРНК Вс1−2 не обнаруживается (Schena et al., 1992). Активация клеток В-ХЛЛ-клонов ФМА сопровождается дифференцировкой клеток в IgM-продуцирующие клетки (без индукции синтеза ДНК) и транзиторным снижением экспрессии гена bcl-2 (Schena et al., 1992).

К числу химических индукторов дифференцировки клеток опухолевых линий относятся кортикостероиды (Uzunoglu et al., 1999). Один из них, метил-преднизолон, способен подавлять рост ксенотрансплантатов клеток линии Raji в бестимусных (nude) мышах, что сопровождается понижением уровней экспрессии белков Вс1−2 (а также с-Мус) в опухолевых клетках (Morris et al., 1997).

Обсуждаемые выше индукторы дифференцировки являются органическими молекулами с самой разной структурой. Существуют также неорганические вещества с похожей биологической активностью. Например, триоксид мышьяка способен индуцировать полную ремиссию ОПЛ (Soignet et al., 1998). В зависимости от концентрации это соединение может запускать или диффе-ренцировку или апоптоз клеток линий ОПЛ, а также клеток ряда лимфоидных и миелоидных линий. Обработка клеток миеломы NOP-1, а также клеток про-миелоцитарного лейкоза NB4 и NKM-1 триоксидом мышьяка в дозе, индуцирующей апоптоз, сопровождается снижением экспрессии гена bcl-2 (Zhang et al., 1998).

Таким образом, исходя из выше изложенных фактов, очевидно понижение экспрессии белков Вс1−2 и Bcl-xL в клетках различных опухолевых линий в условиях обработки дифференцирующими агентами. Вместе с тем, есть примеры повышения экспрессии белков этого типа в клетках указанных линий в условиях индуцированной дифференцировки. Так, например, обработка клеток К562 ФМА сопровождается значительным повышением экспрессии белка Bcl-xL на фоне мегакариоцитарной дифференцировки клетокнаоборот, инкубация клеток К562 с эритроидным индуктором АраЦ сопровождается постепенным снижением экспрессии указанного белка, что согласуется с вышеприведенными данными. Апоптоз в этой системе наблюдается только в условиях эритро-идной (в ответ на АраЦ), но не мегакариоцитарной (в ответ на форболовый эфир) дифференцировки клеток К562, что коррелирует с направлением модуляции экспрессии Bcl-xL в клетках указанной линии (Terui et al., 1998). Повышение количества белка Bcl-xL в обработанных ФМА клетках, вероятно, каким-то образом способствует протеканию мегакариоцитарной дифференцировки, поскольку, например, повышенная экспрессия продукта трансфицирован-ного гена Bcl-xL в клетках К562 усиливала мегакариоцитарную дифференци-ровку, индуцированную ФМА (Terui et al., 1998).

Рассмотрим далее на примере сублиний, несущих трансфицированные копии генов семейства bcl-2, возможные функции продуктов этих генов в условиях обработки клеток дифференцирующими агентами. Результаты некоторых таких экспериментов были уже цитированы нами выше. Кроме того, стабильная высокая экспрессия гена Bcl-xL в клетках линий-трансфектантов К562/Bcl-xL и HEL/bcl-xL сопровождается подавлением апоптоза указанных клеток, запускаемого индукторами эритроидной дифференцировки. При этом, трансфекция гена bcl-2 не затронула экспрессию маркеров эритроидной дифференцировки (в частности, е-глобина) клеток в ответ на указанные индукторы (Benito et al., 1996).

Клетки человеческой гистиоцитарной лимфомы U-937 за 4 сут. инкубации в присутствии блеомицина останавливают пролиферацию в фазе Go/Gj, приобретают признаки миелоидной дифференцировки (повышенная гранулярность и экспрессия CD1 lb) и подвергаются апоптозу. Инкубация клеток транс-фектантов U-937/6c/-2 в присутствии блеомицина в течение двух недель сопровождается замедленной экспрессией маркеров миелоидной дифференцировки при отсутствии признаков апоптоза и блока пролиферации (Guedez, Zucali, 1996).

Повышенная экспрессия продуктов генов bel-2 и bcl-xL в клетках линии трансфектантов К562fbcl-2 и YJSbllbcl-xL подавляет апоптоз, индуцированный ингибитором фосфопротеинфосфатаз РР1 и РР2А окадаевой кислотой (Benito et al., 1997). По отношению к клеткам К562 (Uzunoglu et al., 1999), а также HL-60 (Sato et al., 1995) и меланомы В16 (Rieber, Rieber, 1997) окадаевая кислота выступает также и как индуктор дифференцировки.

В клетках-трансфектантах HL-60/?c/-2 повышенная экспрессия транс-фицированного гена подавляет апоптоз, возникающий при обработке этих клеток ретиноевой кислотой (Ueno et al., 1998), но не влияет на индукцию грану-лоцитарной дифференцировки в ответ на это соединение (Park et al., 1994). Таким образом, апоптоз и дифференцировка клеток опухолевых линий могут быть избирательно модулированы продуктом гена bcl-2 (Benito et al., 1995).

Наряду с ретиноевой кислотой высокой биологической активностью на индукцию дифференцировки и апоптоза клеток опухолевых линий обладают некоторые синтетические ретиноиды. В частности, обработка N-(4-гидроксифенил)-ретинамидом (HPR) клеток линий трансфектантов HL-60/bcl-2, JmkaX/bcl-2 и других сопровождается сильным замедлением апоптоза, по сравнению с клетками родительских линий (Delia et al., 1995). Аналогичный эффект наблюдается в случае синтетического ретиноида AHPN и клеток ли-нии-трансфектанта Molt-4/?c/-2 (Adachi et al., 1998).

В работе Рэя и сотрудников (Ray et al., 1996) модуляция экспрессии Bcl-xLбелка в клетках К562 достигалась путем трансфекции клеток родительской линии геном bcl-xS. Известно, что белок Bcl-xL в цитоплазме клеток может формировать комплекс с белком Bcl-xS, что приводит к снижению свободного белка Bcl-xL (Kharbanda et al., 1997). Показано, что повышенная экспрессия белка Bcl-xS в клетках трансфектантов сопровождается усилением спонтанной и индуцированной (АраЦ и гексаметиленбисацетамид) эритроидной дифференцировки этих клеток и повышенной способностью к апоптозу в ответ на АраЦ (Ray et al., 1996). Усиление индуцированного апоптоза (в ответ на этопо-зид или таксол) наблюдается и в линии клеток-трансфектантов МСY-1/bcl-xS (Sumantran et al., 1995).

Таким образом, почти во всех рассмотренных примерах обработка клеток опухолевых линий дифференцирующими агентами приводит к понижению экспрессии белков Вс1−2 и Bcl-xL, что, очевидно, сказывается на модуляции апоптоза. Последний часто сопряжен с терминальной дифференцировкой клеток под действием указанных агентов. Стабильная повышенная экспрессия трансфицированного гена bcl-2 (bcl-xL) в рассмотренных случаях подавляет (или замедляет) запуск апоптоза и может оказать модулирующее влияние на индукцию дифференцировки клеток при обработке дифференцировочными индукторами. В целом, сравнительный анализ данных этого раздела и данных раздела III не обнаруживает корреляции между изменением чувствительности клеток опухолевых линий к НЦТ-лизису ЕКК (усиление / понижение) и модуляцией экспрессии антиапоптотических белков Вс1−2 и Bcl-xL.

Важная роль в регуляции процессов пролиферации, индуцированной дифференцировки и апоптоза клеток опухолевых линий принадлежит белкам с-Мус и Мах, способных к образованию функционально-активных гетеродиме-ров с-Мус/Мах (Amati et al., 1993) и транскрипционно-неактивных Мах/Мах-гомодимеров (Marcu et al., 1992). с-Мус является геном раннего ответаего роли в регуляции Gl-фазы клеточного цикла посвящено большое количество работ (Heikkila et al., 1987; Eilers et al., 1989; Karn et al., 1989; Amati, Land, 1994 и другие). Экспрессия с-тус тесно связана с пролиферацией клеток. Митогенная стимуляция покоящихся клеток сопровождается ростом экспрессии с-Мус (Marcu et al., 1992). Индуцибельная экспрессия гена с-тус сопряжена, при определенных условиях, с высоким риском апоптоза (Evan, Littlewood, 1993), который в истощенной по сыворотке культуре фибробластов может быть подавлен в условиях коэкспрессии Вс1−2, либо при инкубации клеток с инсулино-подобным ростовым фактором (IGF-1) (Harrington et al., 1994). Рассмотрим несколько примеров модуляции экспрессии с-Мус и Мах в клетках опухолевых линий в условиях обработки дифференцирующими агентами.

При обработке клеток К562 АраЦ, индуцирующим эритроидную диффе-ренцировку, либо ФМА, запускающим миеломоноцитарный путь созревания, наблюдается значительное снижение экспрессии гена с-тус в обоих вариантах обработки клеток. Наоборот, экспрессия белка Мах, с которым с-Мус образует функционально-активный гетеродимер, значительно снижается только в уеловиях эритроидной дифференцировки клеток К562 в ответ на АраЦ (Delgado et al., 1995).

Обработка клеток человеческой гистиоцитарной лимфомы U-937 ФМА приводила к значительному снижению экспрессии с-тус. Эффект не отмечался в случае клеток TUR, более туморогенной сублинии U-937. Обработка клеток обоих типов ФМА приводила к подавлению экспрессии эндогенного белка мах (Hass, Lopez-Guerrero, 1997).

Клетки человеческой гистиоцитарной опухолевой линии DEL отвечают на обработку ФМА дифференцировкой в сторону приобретения макрофагаль-ного фенотипа. При этом наблюдается подавление экспрессии мРНК с-Мус (а также c-Myb и c-Fms), но повышение внутриклеточного содержания мРНК с-Fos (Gogusev et al., 1993). Последнее указывает на то, что снижение синтеза, в частности мРНК с-Мус, является относительно специфическим для данных условий событием, а не следствием возможного общего подавления транскрипции в клетках при обработке ФМА. Сходным образом на обработку ФМА отвечают и клетки человеческого OMJ1HL-60. В этих условиях наблюдается значительное подавление внутриклеточного содержания белка с-Мус (Mohamed et al., 1988), что сопровождается дифференцировкой клеток в сторону макрофа-гального фенотипа.

У клеток линий лимфом Беркитта в условиях обработки ФМА обнаружено как снижение, так и повышение экспрессии гена с-тус. Например, обработка клеток линий BL36, P3HR1, Jijoye и LY91 приводит к активации экспрессии с-тус. Этот эффект не наблюдался в клетках линий BL41, BL67, LY47 и КК124 (Eick, Bornkamm, 1989). Различные клоны клеток Raj i демонстрируют противоположные ответы на обработку ФМА по экспрессии с-тус, в то время как экспрессия c-fos при обработке клеток ФМА во всех клонах Raj i, как и в вышеприведенном примере, оказывалась существенно повышенной (Eick, Bornkamm, 1989).

По данным Ханании и сотрудников (Hanania et al., 1985) обработка ФМА клеток лимфомных линий Raji и Namalwa приводила к снижению количества мРНК с-Мус.

Обработка ФМА (либо <�х, Р-интерфероном) клеток лимфомы Беркитта Daudi приводила к понижению экспрессии с-тус (Clemens et al., 1988; Schiibach et al., 1990). При этом наблюдается подавление пролиферации клеток и индукция дифференцировки в сторону зрелых плазматических клеток. Не исключено, что индуцированная дифференцировка клеток Daudi ФМА (или интерфероном) тесно связана с индукцией повреждений ДНК, поскольку подавление 3-метоксибензамидом активности одного из ферментов репарации, поли (АДФ-рибозо)полимеразы (ПАРП), отменяет индуцированную ФМА (или интерфероном) дифференцировку, повышает уровни мРНК с-Мус и стимулирует пролиферацию клеток (Clemens et al., 1988).

Согласно данным других авторов (Mohamed et al., 1988), обработка клеток Daudi ФМА не изменяла уровней с-Мус и не блокировала пролиферацию клеток в фазе Go/Gi. Не исключено, что указанные различия могут объясняться частными особенностями используемых клонов клеток Daudi.

Обработка ФМА клеток человеческой В-лимфобластоидной линии IM-9-РЗ не изменяла относительное количество мРНК с-Мус (Gellersen et al., 1989).

Известно, что клетки линии Daudi, в отличие от Raji, продуцируют вирус Эпштейна-Барр при обработке дифференцирующими агентами (бутиратом натрия (Newmark, Young, 1995)). Однако экспрессия вирусных антигенов, по-видимому, не влияет на модуляцию экспрессии с-Мус в клетках Daudi под действием индуктора дифференцировки, поскольку обработка ФМА ВЭБ-иммортализованных нормальных лимфоцитов (или эмбриональных фибробла-стов) приводит к возрастанию количества мРНК с-Мус (Hanania et al., 1985).

Модуляция внутриклеточного содержания продукта гена с-тус под влиянием обработки клеток ФМА может иметь, по-видимому, сложный характер. Так, например, с использованием линии мышиной В-лимфомы WEHI231 было показано, что обработка указанных клеток ФМА (либо антителами к поверхностным иммуноглобулинам клеток) приводит к понижению внутриклеточного содержания мРНК с-Мус и соответствующего белка к 24-ому часу инкубации, в то время как в ранний период такой обработки (1−2 ч) наблюдается повышение экспрессии мРНК и белка с-Мус (Maheswaran et al., 1991). Не исключено, что этот результат может быть следствием специфического характера действия ФМА на клетки. Указанный агент в ранний период обработки активирует чувствительные к нему изоферменты ПКС (Castagna et al., 1982), после чего наблюдается подавление общей активности фермента за счет истощения внутриклеточного пула ПКС (Ziegler et al., 1991).

Следует отметить, что принципиально сходные, но противоположные по знаку изменения внутриклеточного содержания мРНК с-Мус наблюдаются при обработке клеток К562 АраЦ. В этом случае наблюдается понижение экспрессии гена с-тус в первые 24 ч (Baker et al., 1994), после чего количество транс-криптов этого гена постепенно возвращалось к исходному уровню (Tonini et al., 1987).

Приведем еще несколько примеров модуляции экспрессии с-тус под действием других индукторов дифференцировки. Обработка лимфомных клеток Raji, а также Akata и Molt-4 ДМСО индуцирует блок пролиферации в фазе Gi (Sawai et al., 1990). При этом показано, что обработка ДМСО клеток Raji приводит к понижению количества мРНК и белка с-Мус (но не c-Fos). После удаления ДМСО из среды культивирования уровни мРНК и белков (продуктов генов c-fos и с-тус), возрастали (Teraoka et al., 1991).

Обработка ДМСО миелоидных клеток HL-60, К562 и лимфомных клеток Raji, Daudi, СЕМ, L1210 индуцирует понижение количества мРНК с-Мус. Этого не наблюдается в клетках COLO 320 и HeLa (Darling et al., 1989), a также при эритроидной дифференцировке клеток К562, индуцированной 5-фторурацилом в ходе 96-часовой инкубации клеток с указанным агентом (Yang, Chang, 1995). Кроме того, обработка клеток HL-60 ретиноевой кислотой, мезереином, либо телеоцидином вызывала дозо-зависимое понижение уровней мРНК с-Мус (Hanania et al., 1985). Следует отметить, что клетки линий HL-60 и Daudi относятся к числу клеточных линий с высокой экспрессией с-Мус (Mohamed et al., 1988). Действие окадаевой кислоты или калликулина, А на клетки К562 в течение суток также сопровождается подавлением экспрессии с-тус и max (Lerga et al., 1995).

Обработка клеток нейробластомы ретиноевой кислотой индуцирует подавление экспрессии N-myc (одного из генов семейства туе) (Schilbach et al., 1990).

Обработка клеток нескольких человеческих лейкозных линий одним из ретиноидов, HPR, приводит к снижению количества мРНК с-Мус (а также Bcl-2 и р53) (Delia et al., 1995). HPR, кроме того, демонстрирует антипролифера-тивный и апоптогенный эффекты на клетки этих линий, кроме относительно нечувствительной к HPR линии К422 (Delia et al., 1995). Снижение экспрессии гена с-тус наблюдается также при инкубации клеток колоректальной карциномы SW837 в присутствии бутирата натрия (Heruth et al., 1993), а также при обработке клеток линии HL-60 5-бромдезоксиуридином (Yen, Forbes, 1990), либо ФНОа (Kumakura et al., 1996). В последнем случае подавление экспрессии с-тус наблюдалось как в терминально дифференцированных, так и в апоптоти-ческих клетках.

Таким образом, в большинстве упомянутых выше экспериментальных систем наблюдается подавление экспрессии продукта гена с-тус при обработке клеток дифференцирующими агентами, за исключением некоторых линий лимфом Беркитта при инкубации с ФМА (Eick, Bornkamm, 1989). Рассмотрим очень кратко некоторые функции белка с-Мус, в том числе, на примере клеток, несущих трансфицированную копию гена и экспрессирующих повышенные уровни с-Мус-транскрипта.

Известно, что экспрессия гена с-тус часто повышена в неопластических клетках (Vamvakas et al., 1993; Debiec-Rychter, Liberski, 1994; Demoly et al., 1994). Комплекс c-Myc/Max трансактивирует экспрессию нескольких генов, в частности, орнитиндекарбоксилазы, р53, протимозин-альфа и других, за счет связывания с ДНК-последовательностью CACGTG (Packham et al., 1994). Известно, что повышение экспрессии гена с-тус (трансфекция, ретровирусный перенос) может индуцировать прохождение клеточного цикла клетками в культурах, лишенных ростового фактора, что сопровождается запуском алоптоза клеток (Packham, Cleveland, 1994). В работах Паккама и сотрудников (Packham, Cleveland, 1994; Packham et al., 1996) было показано, что в миелоидных клетках (в частности, 32D.3) с-тус-зависимая индукция апоптоза и пролиферации клеток осуществляется с участием разных механизмов. Запуск апоптоза клеток 32D.3 в культурах, истощенных по интерлейкину-3, требует с-тус-зависимой индукции экспрессии гена орнитиндекарбоксилазы, тогда как для с-тус-зависимого контроля клеточного цикла этого не требуется (Packham et al., 1996). Таким образом, повышение экспрессии гена с-тус в определенных условиях может индуцировать апоптоз клеток через активацию указанного гена. С другой стороны, с-Мусзависимая трансактивация гена р53 также повышает «риск» апоптоза для клеток (Christensen et al., 1999).

Дифференцировка клеток опухолевых линий, в ответ на действие диффе-ренцировочных индукторов может быть чувствительна к повышенной экспрессии продукта гена с-тус. Например, в условиях повышенной экспрессии цинк-индуцибельного гена с-тус эритроидная, но не миелоидная, дифференцировка трансфецированных клеток К562 (при обработке АраЦ) резко подавляется, несмотря на снижение экспрессии эндогенного белка Max (Delgado et al., 1995). Сходные результаты получены и в работе Бейкера и соавторов (Baker et al., 1994). По-видимому, цитостатическое действие АраЦ необходимо для индукции эритроидной (но не миелоидной) дифференцировки клеток К562, как это показано, например, для афидиколина и клеток этой же линии (Murate et al., 1993). Индукция эритроидной дифференцировки подавляется в условиях преодоления блока пролиферации (в фазе Gi для ДМСО (Takase et al., 1992)) в клетках с дерегулированной экспрессией гена с-тус. С другой стороны, как было выше указано, обработка ДМСО клеток К562 сопровождается подавлением экспрессии гена с-тус (Darling et al., 1989). Клетки К562 с пониженным количеством функциональных с-Мус/Мах-гетеродимеров демонстрируют повышенную экспрессию эритроидных, но не миелоидных маркеров (Canelles et al., 1997).

Апоптоз может быть итогом терминальной дифференцировки клеток, в том числе индуцированной дифференцировки клеток опухолевых линий (Liebermann, Hoffman, 1994), при которой в большинстве случаев наблюдается снижение экспрессии с-тус. В связи с этим, очевидно, что наличие или отсутствие в клетках продукта гена с-тус в разных условиях обработки может обусловить различные типы индукции апоптоза. Однако, даже при одном и том же условии подавления экспрессии с-тус или понижения функциональных гете-родимеров с-Мус/Мах в клетках может наблюдаться как индукция (либо усиление), так и подавление индуцированного апоптоза. Так, например, подавление экспрессии гена с-тус в клетках HL-60 с помощью антисмысловых олиго-нуклеотидов индуцирует апоптоз указанных клеток (Kumakura et al., 1996). С другой стороны, экспрессия ингибиторных C-A/FC-мутантов в клонах клеток К562 (помимо собственного эндогенного с-тус), где количество функциональных с-Мус/Мах-гетеродимеров резко снижено, подавляет апоптоз, индуцированный обработкой клеток окадаевой кислотой (Canelles et al., 1997). Таким образом, не исключено, что для поддержания клеток опухолевых линий (в частности, К562) в недифференцированном состоянии и для индукции химическиопосредованного апоптоза требуется достижение определенных пороговых уровней функциональных с-Мус/Мах-гетеродимеров.

Следует отметить, что действие белка с-Мус на рост, дифференцировку и апоптоз клеток напоминает действие HLH-белковых факторов Id-семейства. Id-белки выполняют функцию ингибиторов клеточной дифференцировки и промоторов прогрессии клеток через Gl-фазу клеточного цикла (Iavarone et al., 1994; Desprez et al., 1995; Lister et al., 1995; Atherton et al., 1996). Было показано, что повышенная экспрессия трансфицированного гена id3 в эмбриональные фибробласты крыс индуцировала пролиферацию и апоптоз клеток-трансфектантов. Последний может быть подавлен при условии котрансфекции гена id3 с генами be 1−2, bcl-xL, либо гена Е2А, кодирующего белок Е47 (основной HLH-белковый фактор), способный формировать с Id3 стабильные гетеро-димеры (Norton, Atherton, 1998). Указанное сходство может быть обусловлено наличием структуры, подобной основному HLH-белку, в С-концевом районе с-Мус, а также Махи Mad-белков (Luscher, Larsson, 1999).

Таким образом, анализ представленных фактов с учетом данных раздела III позволяет сделать вывод об отсутствии корреляции между модуляцией экспрессии белка с-Мус в клетках опухолевых линий и чувствительности их к НЦТ ЕКК в условиях обработки дифференцирующими агентами. Однако поскольку белки Вс1−2-семейства и с-Мус (а также N-Myc и L-Myc) тесно связаны с индукцией и реализацией апоптоза клеток (одного из механизмов НЦТ), и экспрессия их изменяется под влиянием индукторов дифференцировки, то можно предположить наличие непрямого влияния указанных белков на чувствительность опухолевых клеток к НЦТ-лизису ЕКК. Следует упомянуть также еще несколько белков, оказывающих влияние на индукцию дифференцировки и/или апоптоза клеток опухолевых линий при обработке их дифференцирующими агентами.

Одной из характерных черт клеток линии К562 является экспрессия ими значительных количеств аберрантного белка р210Ьсг" аЫ, способного супрессиро-вать, подобно белку Вс1−2, химически-индуцированный апоптоз (McGahon et al., 1994; Ray et al., 1996) и, по-видимому, критичного для патогенеза хронического миелоидного лейкоза (XMJI). Часто используемые дифференцирующие агенты, гемин и цитозинарабинозид, вызывают в клетках К562, как указывалось выше, снижение экспрессии генов с-тус, а также с-туЪ, но гемин, в отличие от цитозинарабинозида, еще подавляет экспрессию bcr-аЫ-киназы на трансляционном уровне (Eisbruch et al., 1988). При этом гемин вызывает состояние частичной обратимой эритроидной дифференцировки клеток К562. Не исключено, что модуляция экспрессии и/или активности bcr-аЫ-киназы тесно связана с гемин-индуцированной эритроидной дифференцировкой, поскольку, например, в клетках XMJl-линии КВМ-5, которая не подвергалась дифферен-цировке в ответ на гемин, не было зарегистрировано изменений в количестве или активности р210Ьсг" аЫ-белка (Eisbruch et al., 1988). Эритроидная дифферен-цировка клеток К562 в ответ на 5-фторурацил также сопровождается модуляцией экспрессии р210Ьсг" аЫбелка (Yang, Chang, 1995).

Одним из важных следствий действия дифференцирующих агентов на клетки опухолевых линий в большинстве экспериментальных систем часто является индукция повреждений ДНК и запуск апоптоза клеток. Хорошо известно, что повреждения ДНК, а также другие формы генотоксического стресса способны активировать продукт гена р53 (ядерный фосфобелок, играющий ключевую роль в регуляции клеточной пролиферации) (Agarwal et al., 1998), либо его недавно открытого гомолога р73 (Kaghad et al., 1997), что в итоге приводит к остановке клеточного цикла и/или индукции апоптоза. Из этого следует, что индуцированная дифференцировка опухолевых клеток in vitro в этих условиях может приводить к активации белка р53 в клетках, несущих соответствующий ген дикого типа. Например, обработка нормальных фибробластов человека ингибитором топоизомеразы II (и индуктором дифференцировки) ад-риамицином индуцирует повреждения ДНК и сильную экспрессию р53, что приводит к апоптозу указанных клеток (Magnelli et al., 1995). Инкубация клеток клона К562, несущих трансфицированный ген температурочувствительного мутанта р53 (ts-p53/K562) при 32 °C приводит к активации мутантного белка р53 и индукции апоптоза (Кременецкая и др., 1996). Форболовый эфир способен понизить экспрессию р53 как в фибробластах, инкубированных с адриами-цином, так и в клетках ts-p53/K562 (при инкубации последних при пермиссив-ной температуре 32 °С), что сопровождается и подавлением апоптоза указанных клеток (Magnelli et al., 1995).

Вместе с тем, действие белка р53 на клеточные функции далеко не однозначно. Так, например, экспрессия р53 дикого типа в клетках опухолевых линий, наряду с апоптозом, может, в зависимости от условий, привести к усилению индуцированной дифференцировки, либо индукции дифференцировки клеток. Это известно, в частности, для клеток ts-p53/K562, которые при низкой плотности культуры (<105 клеток/мл) и инкубации при 32 °C подвергаются апоптозу, тогда как при высокой плотности рассева (>4×105 клеток/мл) и той же температуре инкубации наблюдается стимуляция эритроидной дифференцировки указанных клеток (Кременецкая и др., 1996; Kremenetskaya et al., 1997).

Возникновение повреждений ДНК может быть следствием обработки клеток дифференцирующими агентами, т. е. индуцированной дифференцировки. Имеются факты, указывающие и на обратное влияние повреждений ДНК на дифференцировку клеток. Так, например, высокие дозы ДМСО индуцируют эритроидную дифференцировку MEL-клеток (синтез гемоглобина), что сопровождается постепенной деградацией клеточной ДНК, обнаруживаемой при седиментации в щелочном градиенте сахарозы. Низкие дозы ДМСО не индуцировали дифференцировку MEL-клеток и не приводили к определяемым повреждениям ДНК, однако, индукция повреждений ДНК в MEL-клетках ультрафиолетом придавала им способность дифференцироваться в эритроидном направлении под действием тех же самых низких концентраций ДМСО (Pulito et al., 1983). Не исключено, что в этом случае в действие включаются дополнительные пути регуляции (связанные, например, с активностью белка р53), оказывающие влияние на индукцию апоптоза и/или чувствительности к НЦТ.

Многие из известных индукторов дифференцировки входят в состав антиопухолевых препаратов. Например, дексаметазон, метотрексат, цитозинара-бинозид, этопозид (YP-16), винкристин, цисплатина используются для лечения неходжкинских лимфом (Miyashita, Reed, 1993). Поскольку в ряде экспериментальных систем действие индукторов дифференцировки может быть обратимым, то представляет интерес следующее. При действии антиопухолевых препаратов in vivo, обладающих дифференцирующей активностью, наряду с индуцированной дифференцировкой и блоком пролиферации может наблюдаться гибель опухолевых клеток. Если необратимость дифференцировки должна очевидно сопровождаться гибелью клеток (в частности, апоптозом), то обратимость дифференцировочных изменений (либо появление резистентного к индуктору клона) может привести к сохранению части популяции клеток с последующим их ростом. Поскольку главную функцию противоопухолевого надзора в организме in vivo несут естественные киллерные клетки (Barao, As-censao, 1998), то они будут взаимодействовать как с «нативными», так и с «дифференцированными» опухолевыми клетками. Итогом такого взаимодействия может стать лизис клетки-мишени, однако дифференцировочный статус последних должен оказывать самое непосредственное влияние на величину лизиса опухолевых клеток ЕКК.

III. Влияние дифференцирующих агентов на чувствительность клеток опухолевых линий к НЦТ-лизису ЕКК.

К клеткам, которые выполняют функцию эффекторов, прежде всего от-носяться естественные киллерные клетки (ЕКК), обладающие исходной (до активации, например, интерлейкином-2) НЦТ-активностью in vivo и in vitro (Mason et al., 1990), а также целый ряд субпопуляций Т-лимфоцитов и ЕКК, активированных интерлейкином-2 (ИЛ-2), интерферонами, а и у (Ellis et al., 1989), лектинами (Анисимов, Болотников, 1996) и антителами (Galladrini et al., 1993). ЕКК способны лизировать клетки-мишени (КМ) независимо от антигенов главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), экспрессированных как на самих ЕКК, так и на КМ (Семененя, 1994). Однако, опубликовано большое количество работ, доказывающих, что взаимодействие антигенов ГКГС на КМ и соответствующих рецепторов на ЕКК происходит, причем оно в значительной степени может предрешить исход взаимодействия ЕКК и KM (Daniels et al.,.

1994). Рецепторы к антигенам ГКГС клеток-мишеней на ЕКК человека, мышей и крыс различны не только по структуре, но и по функции (Gumperz, Parham,.

1995), однако общим для них является отсутствие клональной специфичности к антигенам ГКГС, аналогичной таковой рецепторам зрелых Т-лимфоцитов. На этом основании ЕКК относят к филогенетически более древней группе клеток, чем Т-лимфоциты (Janeway, 1989), но сохранившей свою главную функцию противоопухолевой защиты. Механизмы распознавания ЕКК возникающих в организме de novo опухолевых клеток в точности неизвестны, однако, наиболее изученными являются механизмы лизиса таких клеток. Известно, что ЕКК, а также антиген-специфические цитогоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ) и активированные ИЛ-2 ЕКК и Т-лимфоциты (JIAK) лизируют КМ посредством как перфорин-зависимого цитолоза, так и по пути индукции апоптоза в КМ (Робинсон, Труфакин, 1991).

В работах ряда авторов показано, что обработка клеток опухолевых линий дифференцирующими агентами приводит к изменению чувствительности обработанных клеток к НЦТ-лизису гомологичными клетками-эффекторами, причем, в зависимости от клеточной линии и условий обработки, как в сторону усиления эффекта, так и его подавления. Например, обработка клеток человеческой эритромиелолейкозной линии К562 бутиратом натрия (Garson et al., 1983; Werkmeister et al., 1983; Laskay, Kiessling, 1986), адриамицином (Benoist et al., 1985; Benoist et al., 1989), аклациномицином A (Benoist et al., 1989) приводит к понижению чувствительности указанных клеток к НЦТ ЕКК. Причем, при обработке клеток К562 бутиратом натрия наблюдается понижение частоты образования коньюгатов клеток-эффекторов с клетками-мишенями (Garson et al., 1983). Как уже отмечалось, по механизму действия бутират является ингибитором деацетилаз гистонов, что приводит к гиперацетилированию белков хроматина, а адриамицин и аклациномицин, А ингибируют топоизомеразу II (аклациномицин, А ингибирует также топоизомеразу I) (Nitiss et al., 1997; Clary et al., 1998). Как бутират натрия (Garcia-Bermejo et al., 1997), так и указанные ингибиторы клеточных топоизомераз (Mayer et al., 1994; McGahon et al., 1998) способны индуцировать апоптоз клеток опухолевых линий. Вместе с тем, модулирующее действие бутирата натрия на чувствительность клеток к НЦТ ЕКК специфично по отношению к клеточной линии. Например, обработка бутиратом клеток крысиной лимфомы RAW117 (как родительской линии RAW117-Р, так и полученной из нее сублинии с высоким метастатическим потенциалом, RAW117-H10) приводит к усилению их чувствительности к литическому действию ЕКК (Joshi et al., 1988). Таким же действием на клетки указанной линии обладает ДМСО. Целый ряд лимфомных клеточных линий (линии клеток, полученные от больных B-XJIJI, линии лимфомных клеток Raji и Daudi, лимфоб-ластоидная человеческая клеточная линия NAD-7, Т-лимфобластоидная человеческая линия Molt-4) в условиях обработки дифференцирующими агентами, в частности, ФМА, бутиратом натрия, ретиноевой кислотой, также демонстрируют повышенную чувствительность к НЦТ ЕКК после такой инкубации (Blazar et al., 1980; Patarroyo M. et al., 1980; Clark et al., 1981; Totterman et al.,.

1982; Storkus, Dawson, 1986; Zanyk et al., 1988). Такое же действие ФМА оказывает и на нормальные человеческие лимфоциты (Kabelitz, Kunkel, 1983).

Клетки миелоидных линий (К562, HL-60, HHMS) и колоректальной карциномы CRC при дифференцировке снижают чувствительность к НЦТ ЕКК (Bagli et al., 1989; Prado et al., 1995). В случае клеток K562 это наблюдается при действии индукторов и эритроидной дифференцировки (бутират натрия, ад-риамицин, аклациномицин А, гемин, блеомицин, АраЦ (Garson et al., 1983; Werkmeister et al., 1983; Hagner, 1984; Benoist et al., 1985; Laskay, Kiessling, 1986; Benoist et al., 1989)), и мегакариоцитарной (индуцированной ФМА) (Golden et al., 1983). Интересно, что клон клеток К562, чувствительный к лити-ческому действию ЕКК, после обработки ФМА становился резистентным к НЦТ ЕКК, тогда как клетки клона, резистентного к литическому действию ЕКК, приобретали повышенную чувствительность к НЦТ ЕКК (Kimber et al., 1984). Этот же эффект наблюдается в случае B-клеточных линий СВ-1. Клон 26СВ-1 более резистентен к ЕКК, чем клон 13 СВ-1. После обработки бутира-том натрия, йодцезоксиуридином, 5-азацитидином, туникамицином чувствительность клеток клона 26СВ-1 к НЦТ ЕКК повышалась, тогда как чувствительность клеток клона 13СВ-1 почти не менялась (Clark et al., 1981).

Дифференцировка клеток играет, по-видимому, весьма существенную, если не центральную роль, в модуляции чувствительности клеток опухолевых линий к НЦТ ЕКК в результате обработки дифференцирующими агентами. Так, например, B-клеточная линия SB, имеющая незрелый («промежуточный») фенотип (B1+B2+CALLA" DU-ALL14″) при обработке ретиноевой кислотой повышает чувствительность к литическому действию ЕККнаоборот, клетки В-клеточной линии BJA-B, имеющие зрелый («поздний») фенотип (В1+В2″ CALLA’DU-ALLl"), в условиях обработки бутиратом натрия демонстрируют снижение чувствительности к НЦТ ЕКК (Storkus, Dawson, 1986). Исходно ЕКК-чувствительный клон клеток миелоидной линии HL-60, резистентный к химически-индуцированной дифференцировке, при обработке ФМА не изменял своей чувствительности к литическому действию ЕКК, в отличие от родительской ЕКК-чувствительной линии HL-60, клетки которой при обработке как ФМА, так и ДМСО, снижали чувствительность к НЦТ (Golden et al., 1983).

Вместе с тем, по-видимому, дифференцировка необязательно приводит к модуляции чувствительности клеток к НЦТ ЕКК. Например, обработка клеток.

К562 фагаронином, адриамицином, либо аклациномицином, А во всех трех случаях индуцирует эритроидную дифференцировку (синтез гемоглобина и гли-кофорина А). Вместе с тем, обработка клеток фагаронином не модулировала чувствительность к НЦТ, тогда как действие двух других агентов сопровождалось снижением величины лизиса клеток под действием ЕКК (Benoist et al., 1989).

Представленные данные позволяют предположить, что модуляция чувствительности клеток опухолевых линий к НЦТ ЕКК в сторону усиления или подавления эффекта может быть связана с гистогенетическим типом клеточной линии. В частности, имеет ли данная линия клеток лимфоидное происхождение, у которых в ответ на обработку дифференцирующими агентами наблюдается, главным образом, усиление чувствительности к НЦТ.

В основе измененной чувствительности клеток опухолевых линий к НЦТ ЕКК в условиях обработки дифференцирующими агентами может лежать либо модуляция клетками-мишенями способности ЕКК осуществлять неспецифический лизис, либо изменение способности самой опухолевой клетки-мишени подвергаться литическому действию ЕКК. Поскольку НЦТ, осуществляемая ЕКК, базируется главным образом (или исключительно) на перфорин-зависимом механизме (в то время как ЦТЛ лизируют клетки-мишени как пер-форин-, так и Fas-зависимым путем (Kagi et al., 1996)), то очевидно, что клетки-мишени могут модулировать скорость выброса содержимого цитолитических гранул, включая перфорин и гранзимы, либо подавлять активацию ЕКК за счет снижения частоты и аффинитета образования коньюгатов между клетками-мишенями и клетками-эффекторами, что часто и наблюдается (например: Storkus, Dawson, 1986). Однако, это определяется не всегда. Например, известны варианты мышиной лимфомы YAC-1, резистентные к НЦТ ЕКК, но имеющие одинаковую с родительской линией способность образовывать вышеуказанные коньюгаты (Wright, Bonavida, 1983). Из двух дочерних клонов, полученных из родительской линии К562 один (Е10/Р2) чувствителен к литическому действию ЕКК, другой (F9/P2) резистентеноднако, клетки обоих клонов не различались по способности к образованию коньюгатов между клетками-мишенями и клетками-эффекторами, причем, обработка ФМА (но не а2интерфероном) не влияла на способность клеток указанных клонов образовывать коньюгаты с ЕКК (Kimber et al., 1984).

С другой стороны, обработка клеток К562 бутиратом натрия уменьшает связывание клеток-эффекторов с клетками-мишенями, но не снижает литиче-скую эффективность клеток-эффекторов, тогда как обработка клеток-мишеней ФМА снижает то и другое (Garson et al., 1983). Следует отметить, что в основе способности клеток-мишеней модулировать литическую эффективность ЕКК может лежать изменение экспрессии на плазматических мембранах клеток-мишеней, в условиях индуцированной дифференцировки, антигенов главного комплекса гистосовместимости класса I, способных подавлять НЦТ ЕКК за счет взаимодействия, например, с рецепторами лектинового суперсемейства С-типа (Ly49) на ЕКК мышей или крыс, либо с рецепторами иммуноглобулино-вого суперсемейства (KIR) на ЕКК человека (Moretta et al., 1996; Lanier, 1998). Кроме того, определенную роль может играть модуляция сиалирования углеводных цепей гликопротеидов клеток опухолевых линий при их индуцированной дифференцировке (Werkmeister et al., 1983).

Характерная для апоптоза фрагментация ДНК клеток-мишеней на оли-гонуклеосомные фрагменты, кратные 200 парам нуклеотидов, наблюдается при взаимодействии клеток-мишеней как с ЦТЛ (Russell et al., 1980; Martz, Howell, 1989), так и с ЕКК (Froelich et al., 1996), причем последние индуцируют апоп-тоз опухолевых клеток-мишеней также in vivo (Ng et al., 1997). По своей структуре перфорин гомологичен С9-компоненту комплемента и имеет сходный механизм действия (образование полиперфориновых пор, состоящих из 12−18 мономеров и внутренним диаметром 10−20 нм (Kagi et al., 1996). Вместе с тем, при действии комплемента на клетки фрагментации ДНК не наблюдается, что предполагает участие в действии перфорина дополнительных факторов (в частности, сериновых протеаз семейства гранзимов (Tschopp, Nabholz, 1990), которые могут проникать в цитозоль клетки-мишени через перфорин-образованные поры в плазматической мембране и индуцировать запуск апоп-тотических событий (Froelich et al., 1996). Поскольку сигнальный путь, ведущий к фрагментации ДНК, который могут запускать гранзимы, остается неизученным, то очевидно, остается открытым и вопрос о сходстве внутриклеточных механизмов индукции Fas-зависимого апоптоза и фрагментации ДНК и аналогичного события, наблюдаемого при перфорин-зависимом цитолизе клетокмишеней естественными киллерами. Вместе с тем, независимо от природы механизма, лежащего в основе индукции фрагментации ДНК в клетках-мишенях в случае перфорин-зависимого цитолиза, запуск апоптоза клеток-мишеней естественными киллерами осуществляется при лиганд-рецепторном взаимодействии в межклеточном коньюгате.

Известен целый ряд активационных молекул, экспрессированных на поверхности ЕКК мышей и человека. У мышей — это молекулы CD28 (Natidi et al., 1994), Ly6 (Karlhofer, Yokoyama, 1991), 2B4 (Mathew et al., 1993), y человекаCD69 (Moretta et al., 1991), CD44 (Galandrini et al., 1994), CD40L (Carbone et al., 1997), которые при взаимодействии со своими лигандами (либо соответствующими моноклональными антителами) активируют литическую функцию ЕКК. На поверхности клеток ЕКК-чувствигельных линий К562, Molt-4 и Jurkat экс-прессирована активационная молекула р38.5, которая взаимодействует с белком р70 на мембранах ЕКК, что сопровождается лизисом клеток-мишеней (Das et al., 1997). Не исключено, что указанные межмолекулярные взаимодействия могут отвечать не только за активацию секреции цитолитических гранул ЕКК, но и за непосредственную индукцию этапов внутриклеточной передачи сигнала, что приводит к фрагментации ДНК и апоптозу клеток-мишеней. Поскольку индуцированная дифференцировка клеток опухолевых линий in vitro сопряжена с последовательным включением и выключением определенных групп генов, в том числе и тех, которые отвечают за синтез и экспрессию ряда транскрипционных факторов и белков, регулирующих протекание апоптоза клеток, то очевидно следующее. Если при индукции дифференцировки клеток изменяется экспрессия указанных молекул, то это должно отражаться и на чувствительности клеток к НЦТ ЕКК, поскольку гибель клеток-мишеней в тесте неспецифической цитотоксичности, по крайней мере, частично, обусловлена запуском апоптотических событий.

Поскольку, как было показано выше, индукция дифференцировки опухолевых клеток-мишеней может как подавлять, так и усиливать чувствительность их к НЦТ ЕКК, то представляет интерес обозначить возможные механизмы модуляции литического действия ЕКК на клетки опухолевых линий.

IV. Возможные механизмы модуляции литического действия ЕКК на клетки опухолевых линий дифференцирующими агентами.

Согласно одной из моделей, описывающих развитие ранних процессов при 6с/-2-чувствительном пути апоптоза клеток, индуцируемом, в частности, ФНОа, апоптотический сигнал, после взаимодействия лиганда с рецептором, распространяется через образование диацилглицерола, активацию кислой сфингомиелиназы, гидролиз сфингомиелина и генерацию церамида, активирующего цистеиновые протеазы каспазы 3 и 7 (Monney et al., 1998). Эти и другие протеазы ICE/CED-3-семейства гидролизуют ряд внутриклеточных субстратов, в частности, фермент репарации ПАРП, ДНК-зависимую протеинки-назу, U1 70 кДа-компонент ядерного рибонуклеопротеида U1, ИКС типа 8 (ПКС5), ламин и другие субстраты (Waterhouse et al., 1996), что сопровождается фрагментацией ДНК клеток (Wolf et al., 1997). Обработка клеток линии U937 ДНК-повреждающими агентами (цитозинарабинозид, цис-платина, это-позид, камптотецин), которые способны оказывать дифференцирующее действие на клетки опухолевых линий, приводит к активации в клетках U937 протеазы СРР32 (каспаза 3), представителя протеаз ICE/CED-3-семейства с последующим гидролитическим расщеплением ПАРП и изофермента ПКС6 (Datta et al., 1996). Активация этой протеазы чувствительна к повышенной экспрессии антиапоптотического белка Bcl-xL и белка р35 бакуловирусов, что не всегда наблюдается при Fas-индуцированной протеазной активации и апоптозе (например: Memon et al., 1998). Ингибирующее (на активность СРР32 и деградацию ПАРП) действие продуктов трансфецированных генов bcl-xL и bcl-2 показано и в случае цитозинарабинозид-, этопозиди митоксантрон-индуцированного апоптоза клеток HL-60 (Ibrado et al., 1996).

Выше было отмечено, что для неспецифического лизиса клеток-мишеней ЕКК используют главным образом гранульно-экзоцитозный путь (Kagi et al., 1996). Было показано, что один из компонентов цитолитических гранул, гранзим В, может запускать процесс апоптоза в клетках-мишенях, тогда как перфорин играет вспомогательную роль (Froelich et al., 1996). Гранзим В через активацию какого-то проксимального фермента активирует протеазы.

ICE/CED-3-семейства (CPP32, ICE/LAP3, Mch2) (Froelich. et al., 1996). В то же время, Fas-зависимый цитолиз, свойственный ЦТЛ, также приводит к активации СРР32-протеазы (Martin et al., 1996). Следует отметить, что Fas-индуцированный путь апоптоза в некоторых клеточных линиях нечувствителен к антиапоптотическому действию Bcl-xLи Bcl-2-белков (Huang et al., 1997), тогда как в других (например, клетки линий Jurkat (Memon et al., 1995) и MCF-7 (Shrinivasan et al., 1998) имеет место Bcl-2 (Вс1-хЬ)-зависимая ингибиция Fas-индуцированного апоптоза. Показано (Vaux et al., 1992), что повышенная экспрессия трансфицированного гена Вс1−2 не способна предотвратить фрагментацию ДНК в клетках-мишенях FDC-P1 при их взаимодействии со специфичными ЦТЛ мышей, в то время, как апоптоз клеток FDC-P1, возникающий в результате истощения среды по ростовому фактору, в тех же условиях мог быть подавлен. Не исключено, что экспрессия генов 0с/-2-семейства может оказывать ингибирующее влияние на гранзим В-индуцированный апоптоз, и, следовательно, на чувствительность клеток к НЦТ ЕКК. Таким образом, можно было бы ожидать, что наблюдаемое при дифференцировке клеток опухолевых линий понижение экспрессии антиапоптотических белков Вс1−2-семейства будет сопровождаться повышением чувствительности клеток к литическому действию ЕКК. Однако, из приведенных примеров следует, что указанное свойство обработанных клеток может изменяться как в сторону усиления, так и подавления эффекта, что, принципиально можно объяснить способностью указанных белков, в частности, Вс1−2, блокировать только некоторые пути апоптоза (Моппеу et al., 1998). Вместе с тем, не исключено, что белки Вс1−2-семейства могут оказывать модулирующее влияние на чувствительность клеток опухолевых линий к НЦТ ЕКК в условиях обработки дифференцирующими агентами.

Из вышеизложенного следует, что способностью модулировать индукцию апоптоза, ассоциированного с дифференцировкой клеток и, таким образом, оказывать влияние на чувствительность опухолевых клеток к литическому действию ЕКК могут обладать и другие указанные выше молекулы, в частности, продукты генов с-тус, р53 и bcr-abl. Однако, и в этом случае, строгой корреляции между модуляцией экспрессии указанных молекул при обработке дифференцирующими агентами и изменением чувствительности клеток опухолевых линий к НЦТ ЕКК, по-видимому, нет.

Различие индукторов дифференцировки по структуре и механизму действия на клетки может по-разному отражаться на регуляции ими экспрессии позитивных и негативных регуляторов апоптоза, количественные соотношения которых, по-видимому, могут вносить определенный вклад в установление как исходной чувствительности клеток к НЦТ ЕКК, так и той, которая возникает после обработки клеток дифференцирующими агентами. Не исключено, что это имеет прямое отношение и к сублиниям клеток, имеющим более или менее дифференцированный фенотип (Clark et al., 1981). Вместе с тем, чувствительность клеток опухолевых линий, различающихся по степени дифференцированное&trade-, к литическому действию ЕКК существенно повышается при использовании в качестве клеток-эффекторов, активированных интерлейкином-2 и другими агентами, ЕКК и/или Т-лимфоцитов (Болотников, Анисимов, 1994; Анисимов, Болотников, 1996). При этом влияние дифференцировочного статуса клеток-мишеней на чувствительность к НЦТ ЕКК снижается.

Таким образом, обработка клеток опухолевых линий дифференцирующими агентами может сопровождаться индукцией апоптоза клеток и модуляцией чувствительности их к НЦТ ЕКК. Поскольку в таких условиях обработки экспрессия и/или активность целого ряда рассмотренных выше внутриклеточных регуляторов апоптоза, как правило, изменяется, то, не исключено, что это может отражаться на эффективности литического действия ЕКК, в основе которого лежит индукция апоптоза клеток-мишеней. Вместе с тем, неоднозначность результатов обработки клеток дифференцирующими агентами, по отношению к их чувствительности к ЕКК, предполагает безусловное участие в этом процессе дополнительных факторов, в том числе и тех, которые связаны с модификацией гликопротеидов плазматических мембран клеток (Werkmeister et al., 1983).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использовали клетки человеческой эритромиелолейкозной линии К562 (Всероссийский банк клеточных культур, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург).

1. Клетки культивировали в полной среде (ПС): 89% RPMI 1640 (Научно-исследовательский Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, Москва) с добавлением 11% эмбриональной телячьей сыворотки (Научно-исследовательский Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН, Москва), 2 мМ L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина сульфата, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола («Ferak», Германия).

В ходе проведения серии экспериментов культуры ставили в 24-луночных (96-луночных) микропланшетах («Nunc») в объеме 1 мл (0.2 мл) при начальной плотности посева 0.1 млн (0.02 млн) клеток К562 в ПС, соответственно, и инкубировали в течение определенного времени (1−4 суток) в присутствии изучаемых химических реагентов. Схемы инкубации предусматривали обработку клеток единичными соединениями, либо сочетанием нескольких соединенийв этом случае использовалась совместная обработка клеток реагентами.

2. Численность клеток К562 определяли с использованием камеры Горяевапроцент жизнеспособности оценивали по тесту с трипановым синим («Sigma», США).

3. Определение внутриклеточной концентрации гемоглобина проводили с помощью бензидиновой пробы (Andersson et al., 1979). Клетки снимали с лунок микропланшет раствором Хенкса, подсчитывали в камере Горяева, дважды отмывали фосфатным буфером. К 70 тыс. клеток К562 добавляли 100 мкл 0.3% раствора бензидинового реактива (готовится на 20% уксусной кислоте и 80% этаноле) и 100 мкл 0.3% раствора перекиси водорода. Пробы фотометрировали через 30 мин на КФК-3 при Я 535 нм. Внутриклеточную концентрацию гемоглобина определяли по калибровочной кривой, построенной на основании величин оптической плотности, полученных при фотометрировании растворов с точно известным содержанием гемоглобина. Для построения калибровочной кривой использовали гемоглобин лошади («Reanal», Венгрия). Далее [Hb]? пересчитывали на 105 клеток.

4. Анализ фрагментации клеточной ДНК.

Для выявления олигонуклеосомной фрагментации ДНК выделяли клеточную ДНК (Yonish-Rouach et al., 1991). Клетки снимали с лунок микропланшет раствором Хенкса, подсчитывали в камере Горяева, два раза отмывали фосфатным буфером и лизировали в буфере Николетти (10 мМ трис-HCl, pH 7.5, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% додецилсульфата натрия, 100 мкг/мл протеиназы К («Sigma», США) в течение ночи при 43 °C. После депротеинизации фенолом и отмывания смесью хлороформ: изоамиловый спирт (24:1) раствор ДНК инкубировали с РНК-азой, А (100 мкг/мл) в течение 1 часа при 37 °C с последующим отмыванием смесью хлоро-форм:изоамиловый спирт вышеуказанного соотношения. Осаждение ДНК из водного раствора проводили при -20°С в течение ночи с предварительным добавлением 1/10 части от общего объема 3 М СНзСОО№ и двойного объема 96%-ного этанола. Осадок собирали центрифугированием и растворяли в буфере 20 мМ трис-НС1-ЭДТА (pH 8.0). Проводили вертикальный электрофорез в 2%-ном агарозном геле в 40 мМ трис-ацетатном буфере (pH 8.0) в течение 2 часов при 50−70 В. Каждая проба содержала ДНК, выделенную из 0.5 млн клеток К562.

5. Определение характера повреждений ДНК (1-й 2-нитевые разрывы) Проводили по изменению параметров флуоресценции двух ДНК-тропных красителей: бромистого этидия (EtBr) («Sigma», США) и 4', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) («Serva», США) (Иванов, 1992; Анисимов, Болотников, 1999). Клетки К562 предварительно синхронизировали инкубацией с 1 мМ тимидина в течение 24 часов, затем инкубировали с исследуемыми реагентами. Далее аликвоты клеток (0.02 млн клеток К562) снимали с лунок микропланшет, однократно отмывали 0.15 М NaCl. Для получения ДНК в нуклеоидном виде (Cook, Brazell, 1978) к полученным пробам добавляли по 20 мкл холодной лизирующей смеси (буфер А: 0.01 М трис-HCl, 0.1 М ЭДТА, 2 М NaCl, 0.5% тритон-ХЮО, pH 8.0) и после перемешивания встряхиванием инкубировали на холоду в течение 15 мин. Затем лизаты переносили в буфер Б (0.01 М трис-НС1, 0.1 М NaCl, 0.01 М ЭДТА, рН 7.4) в кювету для измерения флуоресценции. Измерения проводили на приборе ФМ-Ц-2. В кювету с опытной пробой последовательно вносили DAPI (конечная концентрация — 0.1 мкг/млпараметры интерференционных светофильтров: А, возбуждения — 357 нм, X эмиссии — 444 нм) и EtBr (конечная концентрация — 4 мкг/млпараметры интерференционных светофильтров: X возбуждения — 514 нм, А, эмиссии — 606 нм). Полосы пропускания для DAPI — 39 нм на возбуждение и 15 нм на эмиссиюдля EtBr -26 нм на возбуждение и 12 нм на эмиссию. После внесения каждого компонента измеряли флуоресценцию при. соответствующих длинах волн возбуждения и эмиссии. Перед внесением красителей определяли фоновую интенсивность флуоресценции при указанных длинах волн. Параллельно определяли аналогичные параметры в пробах, не содержащих лизатов клеток.

Находили ДЕШг и ADAPI, характеризующие изменение флуоресценции красителей при связывании с ДНК по формуле:

AEtBr (ADAPI) = h — h — (1з -14), где Ii-интенсивность флуоресценции пробы, содержащей клеточный ли-зат и EtBr (DAPI) в буфере Б;

12 — интенсивность флуоресценции клеточного лизата в буфере Б;

13 — интенсивность флуоресценции EtBr (DAPI) в буфере Б;

14 — интенсивность флуоресценции буфера Б.

В качестве стандартной ДНК использовали ДНК из эритроцитов цыплят («Reatial», Венгрия), пропущенную 20 раз через иглу с внутренним диаметром 0.3 мм в 0.01 М трис-НС1-ЭДТА-буфере, рН 7.4.

В качестве положительного функционального контроля деградации клеточной ДНК были использованы тимоциты крыс, обработанные в течение 4 часов 10 мкМ дексаметазона. 6. Определение суммарной внутриклеточной концентрации никотинамидных коферментов [NAD++NADH]j, с предварительной щелочной экстракцией из клеток, проводили по методу Ниссельбаума и Грина (Nisselbaum, Green, 1969). Для построения калибровочной кривой использовали ?-NAD+ («Sigma», США).

7. Определение ЕС50 клеток, инкубированных с реагентами, проводили по методу Тсуруо и др. (Tsuruo et al., 1981).

8. Определение чувствительности клеток К562 к неспецифическому цитоток-сическому лизису (НЦТ-лизису) лейкоцитами человека и крыс. НЦТ-лизис изучали в гомои гетерологичной системах.

В работе были использованы крысы линии Вистар неинбредного разведения, массой 180−200 г. Крыс декапитировали под эфирным наркозом. Время от усыпления до декапитации не превышало 3 мин. Селезенки отбирали асептически, суспензию одиночных клеток получали по прописи (Аниси-мов, Болотников, 1996). Лейкоциты периферической крови (ЛПК) человека выделяли из крови здоровых мужчин с помощью двухступенчатой процедуры, включающей фракционирование на градиенте фикола-гипака, с последующим лизисом эритроцитов дистилированной водой. Жизнеспособность спленоцитов и ЛПК, оцененная по тесту с трипановым синим, составляла не менее 93−95%.

Тест неспецифической цитотоксичности крысиных спленоцитов и ЛПК человека (клетки-эффекторы — КЭ) по отношению к клеткам К562 (клетки-мишени — КМ), инкубированным с индукторами и меченным 3Н-уридином («Изотоп», Россия), ставили по прописи (Сорокин и др., 1991; Анисимов, Болотников, 1998). Время инкубации культур со стимуляторами до постановки НЦТ-теста во всех вариантах составляло 2 суток. Соотношение клеток-эффекторов к клеткам-мишеням составляло 50:1 в НЦТ-тесте с крысиными спленоцитами и 40:1 в НЦТ-тесте с ЛПК человека. Цитотоксический индекс (ЦИ, %) рассчитывали по формуле:

ЦИ=1-(имп/мин) в опытных пробах/(имп/мин) в контрольных пробах х 100%, где за контроль принимали культуры клеток К562, меченые Н-уридином и не содержащие спленоцитов или ЛПК человека.

В работе использовали: тимидин («Reanal», Венгрия), форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) («Sigma», США), дексаметазон (KRKA, Словакия), кальциевый ионофор А23 187 («Sigma», США), алкогольдегидрогеназу (уд. акт. 25 ед. на 1 мг белка) («Reanal», Венгрия), феназинметосульфат (EGA-Chemie), нитросиний тетразолий (Chemapol), ДНК фага X (НПЦ «Биопол», Россия), эндонуклеазы рестрикции (НПЦ «Биопол», Россия). Хинолин (Q) и 2-метилхинолин (2-MeQ) получены из Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, США) — хинолин-1-оксид (QO), 2-метилхинолин-1-оксид (2-MeQO), 4-нитрохинолин-1-оксид (4-NQO) и 2-метил-4-нитрохинолин-1-оксид (2-Ме-4-NQO) были синтезированы в нашей лаборатории по методу (Ochiai, 1967) — 2-(4'-диметиламиностирил)хинолин-1-оксид (2-DQO) и 2-(4'-диметиламиностирил)пиридин-1-оксид (DPyO) синтезированы по оригинальной методике (Andreev et al., 1998). Индивидуальность полученных соединений подтверждена методами тонкослойной хроматографии (ТСХ), ВЭЖХ и по температурам плавления. Остальные реактивы отечественного производства квалификации «хч» .

Достоверность различий определяли по t-критерию Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В большинстве работ по изучению иммортализованных клеточных линий дифференцированными считаются клетки, обработанные индукторами диффе-ренцировки в течение 4−6 суток. В качестве контроля к дифференцировке обычно используют необработанные индукторами клетки, культивируемые в течение 1−2 суток (Малашичева и др., 1998). Инкубация клеток менее 4-х суток в присутствии дифференцирующих агентов приводит к увеличению числа клеток, несущих маркеры того или иного пути дифференцировки, однако общее количество дифференцированных клеток в культуре невелико, при этом может наблюдаться снижение темпа пролиферации и увеличение числа клеток в фазе Gi (Enoch, Norbury, 1995), т. е. имеет место изменение клеточного цикла (Onish-chenko, 2000). При дальнейшем увеличении времени инкубации число дифференцированных клеток возрастает и достигает некоторой постоянной величины (Епифанова, 1997). Индукция дифференцировки может повлечь за собой (или являться следствием) запуск программированной клеточной гибели (апоптоза) и модуляцию чувствительности опухолевых клеток к НЦТ-лизису ЕКК (Волян-ская и др., 1994).

Поскольку в настоящем исследовании предполагалось установление корреляции между антипролиферативным, дифференцирующим, апоптогенным и модулирующим НЦТ действием группы ксенобиотиков на клетки К562, то обработку клеток индукторами дифференцировки проводили в течение 2-х и 4-х суток инкубации.

Выбор конкретных индукторов дифференцировки клеток К562 связан с изучением, во-первых, изменения клеточных функций (пролиферации, апоптоза и чувствительности к НЦТ-лизису ЕКК) при индукции конкретного пути дифференцировки, в частности, эритроидногово-вторых, модуляции указанных клеточных функций при ингибировании эритроидного пути дифференцировки. Поэтому для обработки опухолевых клеток использовали известные эритроид-ные индукторы (тимидин, бутират натрия, ДМСО), а также известные (ФМА, дексаметазон) и установленные нами (QO, 4-NQO, 2-Me-4-NQO) ингибиторы эритроидного направления дифференцировки клеток К562.

ВЫВОДЫ.

1. Определено дозои время-зависимое изменение уровня пролиферации и жизнеспособности (токсический эффект индукторов) клеток К562 при обработке рядом химических реагентов:

— используемые ксенобиотики проявляют по отношению к клеткам различный токсический эффект, что объясняется структурными особенностями и различным механизмом действия реагентов на опухолевые клеткитак наиболее токсичным для опухолевых клеток из индукторов эритроидной дифференцировки является DPyO (ЕС50 33.11 мкМ), из ингибиторов указанного процесса — 4-NQO (2-Me-4-NQO) (ЕС50 1.04 (1.05) мкМ) — наименьший токсический эффект по отношению к опухолевым клеткам проявляет ДМСО (0.1−0.5% - во всех вариантах обработки жизнеспособность клеток составила более 90%), QO (ЕС50 316.23 мкМ) и DQO (ЕС50 208.93 мкМ);

— в используемых условиях обработки индукторами дифференцировки пролиферация опухолевых клеток была практически полностью блокирована.

2. Показано модулирующее действие нетоксичных доз исследуемых реагентов и их комбинаций на эритроидную дифференцировку опухолевых клеток К562:

— обработка клеток К562 тимидином, бутиратом натрия, ДМСО (0.1−0.5%), DPyO, а также комбинациями тимидина и бутирата натрия с ДМСО приводит к индукции синтеза гемоглобина (эритроидной дифференцировки) в опухолевых клетках;

— присутствие в культурах опухолевых клеток ФМА, QO, 4-NQO, 2-Ме-4-NQO ингибирует как спонтанный, так и индуцированный синтез гемоглобина (эритроидную дифференцировку) в клетках К562;

— инкубация опухолевых клеток с ДМСО (1.5%), Q, 2-MeQ, DQO не модулирует их эритроидную дифференцировку.

3. Определены уровни индукции (ингибирования) процессов фрагментации ядерной ДНК в клетках К562 при обработке дифференцирующими агентами:

— инкубация клеток в присутствии тимидина (3 мМ, 2 сут- 2 мМ, 4 сут), бутирата натрия (2 мМ, 4 сут), комбинаций указанных реагентов с дексаметазоном и А23 187, а также в присутствии 4-NQO, 2 -Me-4-NQO, DQO, DPyO приводила к индукции фрагментации ДНК в опухолевых клетках;

— при сочетанной обработке клеток К562 тимидином и ФМА, А23 187 и ДМСО наблюдалось ингибирование тимидини А23 187- индуцированной фрагментации ядерной ДНК клеток;

— обработка клеток К562 ДМСО, QO не модулировала фрагментации ДНК в клетках.

4. Установили, что:

— модуляция процессов дифференцировки может сопровождаться апоптозом опухолевых клеток, в частности, при обработке тимидином, бутиратом натрия, комбинациями указанных индукторов с дексаметазоном и А23 187, а также являться следствием возникших в ДНК апоптотических повреждений, например, при обработке клеток 4-NQO, 2-Me-4-NQO, DPyOпри обработке опухолевых клеток 0.1−0.5% ДМСО, QO имеет место только модуляция дифференцирующей активности реагентов по отношению к опухолевым клеткам, тогда как инкубация клеток с DQO приводит только к модуляции апоптоза.

5. Показано влияние видовой принадлежности донора эффекторных клеток и условий обработки клеток К562 индукторами дифференцировки на чувствительность опухолевых клеток к НЦТ-лизису ЕКК:

— чувствительность как «нативных», так и «дифференцированных» клеток К562 к НЦТ-лизису ЕКК существенно выше при использовании гомологичных клеток-эффекторов (ЛПК человека), чем при использовании гете-рологичных (спленоциты крыс);

— комбинированная обработка клеток К562 индукторами эритроидной и мие-лоидной дифференцировки во всех вариантах значительно модулирует чувствительность опухолевых клеток к НЦТ-лизису ЕКК по сравнению с вариантами обработки единичными индукторами или сочетанием эритро-идных агентов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Целью настоящей работы являлось изучение биологического действия ряда структурно различных ксенобиотиков с точки зрения их способности индуцировать дифференцировку и/или апоптоз эритролейкемических клеток К562, а также модулировать чувствительность опухолевых клеток указанной линии к НЦТ-лизису ЕКК.

В работе предполагалось подобрать условия и оптимальные схемы обработки клеток К562 химическими реагентами, в результате которых наблюдалась бы одновременная индукция процессов дифференцировки и апоптоза в опухолевых клетках, либо модуляция только одного из обозначенных процессов, и показать влияние индуцированных дифференцировки и/или апоптоза на чувствительность клеток к НЦТ-лизису гетерологичными (спленоциты крыс) и гомологичными (ЛПК человека) клетками-эффекторами. Кроме того, предстояло установить взаимосвязь (либо ее отсутствие) между сходством/различием в модуляции апоптоза и чувствительности клеток к НЦТ-лизису ЕКК реагентами, обладающими сходным типом дифференцирующего действия на опухолевые клетки. В связи с этим, в качестве индукторов дифференцировки клеток были использованы различные по структуре и механизму действия ксенобиотики (тимидин, бутират натрия, ДМСО, ФМА, дексаметазон, производные хинолина и пиридина).

Использование ряда методических подходов, включающих изучение временных и дозовых зависимостей, характеризующих цитотоксическое, антипро-лиферативное, дифференцирующее, апоптогенное и модулирующее НЦТ действие вышеуказанных реагентов позволяет сделать ряд выводов, общий смысл которых сводиться к следующему. При обработке клеток линии К562 химическими реагентами может наблюдаться запуск того или иного пути дифференцировки, в частности, эритроидного (при действии тимидина, бутирата натрия, ДМСО, БРуО), либо ингибирование указанного процесса (при действии ФМА, дексаметазона, производных хинолина). В зависимости от условий обработки, то есть используемых доз и времени инкубации опухолевых клеток в присутствии реагентов, индуцированная дифференцировка (в частности, тимидином, бу-тиратом натрия) может сопровождаться апоптозомпри использовании сочетаний различных индукторов апоптогенный эффект на клетки одного из них может быть подавлен, либо усилен, действием другого, например, при обработке опухолевых клеток тимидином+ФМА, тимидином или бутиратом на-трия+дексаметазон, соответственно. В некоторых случаях модуляция диффе-ренцировки клеток может являться следствием апоптотических повреждений ДНК, возникших под действием химических соединений (4~МСЮ, 2-Ме-4-К (30, БРуО). Модуляция обеих клеточных функций (дифференцировки и апоптоза) вносит вклад в изменение чувствительности опухолевых клеток к НЦТ-лизису ЕКК, которое может являться следствием индукции только дифференцировки, в частности, эритроидной (при обработке клеток бутиратом натрия), либо одновременного ингибирования процессов эритроидной дифференцировки и апоптоза в клетках К562 (при обработке комбинацией тимидин+ФМА).

Таким образом, при инкубации опухолевых клеток с химическими реагентами может наблюдаться индукция дифференцировки и/или апоптоза. Обработка клеток высокими дозами индукторов приводит к быстрой гибели значительной части клеток по типу апоптоза и/или некроза. Возникновение в организме подобного генерализованного процесса нежелательно, так как наряду с опухолевыми клетками в индукцию указанного процесса могут быть вовлечены нормальные клетки, в частности, клетки костного мозга. Снижение дозы используемых соединений, как правило, сопровождается снижением их цитотоксиче-ского действия. С другой стороны, низкие дозы реагентов могут стимулировать дифференцировку опухолевых клеток, которая в зависимости от условий может быть как обратимой, так и необратимой (терминальной). Финальным этапом терминальной дифференцировки является апоптоз клеток (Епифанова, 1997), тогда как обратимая дифференцировка может привести к сохранению части клеточной популяции с последующим появлением резистентного к индуктору клона. И в том, и в другом случае может иметь место модуляция чувствительности опухолевых клеток к НЦТ-лизису ЕКК.

В связи с вышеизложенным необходимо указать, что некоторые аспекты работы требуют дальнейшего изучения. Используемые в исследовании химические реагенты, обладающие дифференцирующим действием на клетки опухолевых линий, имеют в большинстве случаев различное химическое строение, что обуславливает различие внутриклеточных мишеней действия дифференцирующих агентов и неоднотипность путей метаболизма соединений. Последние, как известно, приводят к появлению целого ряда производных, дифференцирующие потенции которых могут различаться. В зависимости от происхождения опухолей, эффекты одного и того же соединения на клетки также могут бать различны. Кроме того, многое зависит от способа обработки опухолевых клеток: in vivo или in vitro. Дозы реагентов и временные интервалы, используемые для инкубации клеток in vitro, практически не приемлемы для обработки опухолевых клеток in vivo. В последнем случае они могут оказаться либо слишком низкими, в результате желаемый терапевтический эффект не будет достигнут, либо слишком высокими, тогда трудно сказать, все ли нормальные клетки организма останутся жизнеспособными, в то время как опухолевые будут повреждены. Другая проблема, которая также имеет отношение к клинической практике, -возникновение множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток к антинеопластическим препаратам, сопровождающаяся амплификацией mdr-генов, что является одной из основных причин неэффективной химиотерапии рака.

Вместе с тем, проблемы регуляции и взаимосвязи клеточных функций этим далеко не исчерпываются. Перспективы разработки данной темы в первую очередь связаны с получением новых клеточных линий, особенно трансгенных (например, линии с трансфецированными генами Вс1−2, р53 и другими), которые позволят проследить и вычленить отдельные этапы того или иного пути дифференцировки клеток, выявить транскрипционные факторы, вовлеченные в индукцию или подавление указанного процесса, а также установить сходство или различие в механизмах, контролирующих апоптоз и дифференцировку клеток. Кроме того, не менее важным является изучение биохимических путей метаболизма ксенобиотиков (модуляторов дифференцировки и апоптоза), в частности, энзиматических систем, участвующих в биодеградации и биотрансформации химических реагентов. С другой стороны, малигнизация клеток связана с нарушением таких фундаментальных биологических процессов, как рост, пролиферация, наследование признаков в клеточном потомстве, поэтому анализ молекулярных основ трансформации и канцерогенеза будет способствовать обогащению не только теоретической базы знаний о неоплазмах, но и эффективной диагностике злокачественных опухолей, поиску новых оптимальных.