Ультраструктурная и цитохимическая характеристика макрофагов, инфицированных РНК-содержащими вирусами

Актуальность проблемы.

Характерной чертой современной вирусологии является развитие мо-лекулярно-генетических исследований структуры и патогенности вирусов. Вместе с тем, что теоретическое и практическое значение таких исследований не вызывает сомнений, изучение сложного процесса взаимодействия вируса и клетки с позиций морфологии остается не менее актуальным. Так, если в 50−80-х гг. прошлого столетия имелись многочисленные публикации российских и зарубежных ученых, посвященные исследованиям морфологической структуры как вирусов, так и зараженных ими клеток, то на данный момент последняя российская монография, посвящепная вопросам вирусной цитопатологии, была опубликована в 1986 г [7]. Начиная с 2000 годов, в зарубежной литературе появились сообщения о необходимости возобновления ультраструктурных исследований в клеточной биологии, интерес к которым был снижен в конце прошлого столетия по разным причинам, в частности: ограниченности методологических подходов, перенаправленности исследований в сторону молекулярно-генетических методов, а также малочисленности специалистов-морфологов, способных дать точную интерпретацию данных [73, 225, 288]. Последняя причина особенно характерна для России, так как на настоящий момент в области медицинской вирусологии практически не существует школы морфологов.

Известно, что в результате взаимодействия клетки и вируса возникает сложный комплекс морфологических и цитофизиологических изменений, которые специфичны только для данного типа взаимоотношений и не встречаются при других патологических состояниях клеток [4]. Детальное ультраструктурное исследование взаимоотношений «вирус-клетка», позволяет решать как общебиологические проблемы (запуск и синтез белков и нуклеиновых кислот, образование и движение клеточных органелл, осуществление эн-дои эктоцитоза и другие), так и медицинские, а именнопонять механизмы развития патологического процесса в макроорганизме. Не менее важно, параллельно ультраструктурному, проводить исследование функциональной и ферментативной активности инфицированных вирусом клеток, так как при синтезе нуклеиновых кислот и белковых компонентов вирусом могут использоваться ферментные системы самой клетки без их модификации, либо индуцируется синтез новых, не свойственных ей ферментов. Одномоментно, активность собственных клеточных энзимов резко угнетается. Таким образом, применение высокочувствительных методов определения ферментативной активности зараженных вирусом клеток является важным способом индикации вирусной репродукции, дифференцировки цитопатогенного действия вирусов, а также характера и формы инфекционного процесса в клетках [229]. Несмотря на важность подобной информации, в литературе последних лет такие работы встречаются редко.

При защите организма от инфекционного агента клетки моноцитарной линии относят к одним из основных компонентов его резистентности к возбудителю. Функциональное предназначение этих клеток складывается из участия в обезвреживании возбудителя путем фагоцитоза и продукции биологически активных веществ стимулированными клетками [34, 48, 55, 397]. Данные клетки в силу доступности методов их выделения, фракционирования и культивирования из периферической крови и перитонеального экссудата служат прекрасной моделью для изучения ряда общих цитофизиологи-ческих закономерностей. Клетки моноцитарной линии филогенетически относятся к самой древней системе защиты организма и являются эффекторами и модуляторами различных инфекционных процессов. В норме функциональное состояние этих клеток находится под строгим контролем и нарушение такого гомеостатирующего состояния может привести к так называемому «синдрому активации макрофагов» — редкого, но тяжелого заболевания [291]. На поверхности плазматической мембраны макрофагов выявлены многочисленные рецепторы, принимающие участие в процессах адгезии, эндои фагоцитоза, межклеточных взаимодействий, восприятия регулягорных воздействий, причем часть из них относится к рецепторам, присутствующим на всех стадиях созревания этих клеток от моноцитов до макрофагов [32, 133, 138]. Несмотря на то, что с помощью специфических сывороток, включая моноклональные антитела, на мембране этих клеток выявлены различные категории антигенов, фагоциты различных видов млекопитающих связаны единством происхождения, общностью основных функций и сходством структур и метаболических процессов, обеспечивающих реализацию их функций. Используя в качестве модельной системы макрофаги перитонеаль-ного экссудата мышей без применения каких-либо индукторов воспаления и достигнув функциональной однородности клеточной популяции путем их культивирования, результаты исследований взаимодействия этих клеток с инфектами можно экстраполировать в целом на клетки моноцитарного происхождения класса млекопитающих. Данная популяция клеток соответствует резидентным макрофагов, а при воздействии инфекта они определяются как активированные.

Известно, что в процессе адгезии различных типов вирусов участвуют интегрины (гликопротеины, состоящие из различных комбинаций аи (3-цепей), которые также присутствуют на мембране макрофагов [109, 253, 410]. На настоящий момент различными исследователями доказано участие клеток моноцитарного происхождения в развитии защитного ответа организма при вирусном инфицировании. В основном в подобных исследования очерчивается функциональная характеристика этих клеток, связанная с их способностью к синтезу различных цитокинов [313, 326, 365, 509]. Так, противовирусная активность моноцитов/макрофагов подразделяется на прямую и опосредованную [88]. Первая определяется внутриклеточной способностью макрофагов нарушать вирусную репликацию либо ей способствовать, а вторая обусловливается внеклеточной активностью макрофага влиять на вирус. Что же касается непосредственного взаимодействия вирусов с макрофагами, то существует мнение, что их участие в развитии вирусных болезней ограничено свойствами «профессионального» фагоцита, способного только к фагоцитозу зараженных вирусом клеток-мишеней и их фрагментов [47, 50, 51].

Определено, что энтеровирусы [181, 461], вирусы Денге, Хунин, Хан-таан [134, 460] и вирус клещевого энцефалита [44, 52] способны проникать в моноциты/макрофаги, но при этом морфофункциональная изменчивость этих клеток не изучалась. Известны единичные работы, в которых с позиции вирусной цитопатологии частично описаны морфологические внутриклеточные изменения макрофагов после их заражения вирусами: гриппа [48], Денге [493] и вируса иммунодефицита человека [367]. Однако оценка цитохимического состояния макрофагов не приводилась. Тем не менее, немаловажны сообщения, что при размножении, в частности, вируса иммунодефицита человека в макрофагах, при невыявляемом цигопатическом действии определяется снижение бактерицидного потенциала и синтезирующей активности клеток. Это, в последующем, может выражаться в реализации потенциала макрофагов как инициаторов иммунного ответа организма [431]. Исходя из того, что моноциты/макрофаги одними из первых клеточных элементов способны реагировать на проникновение возбудителей, особый интерес представляет оценка их функциональной активности в начальном этапе заболевания.

На настоящий момент, при исследовании патогенеза вирусных инфекций, к важному и нерешенному вопросу относится определение в начальный период заболевания места кодирования главных детерминант вирусов. Это включает: 1) выявление типа клеток, поддерживающих первый круг размножения вируса при естественной инфекции- 2) обнаружение локализации рецепторов, используемых вирусами при адгезии на поверхность клетоки, 3) выяыление механизма тропизма вирусов к тканям, где они также могут размножаться. В этой связи весьма актуальными являются исследования, связанные со значением клеток моноцитарно-макрофагальной системы в патогенезе инфекций, вызываемых РНК-содержащими вирусами. Для комплексной оценки процесса взаимодействия вируса и макрофага в качестве инфекционных агентов мы использовали вирусы, принадлежащие к трем семействам: Picornaviridae, Flaviviridae и Bunyaviridae. Несмотря на то, что все эти вирусы являются РНК-содержащими, мы руководствовались их структурными различиями. Так, Picornaviridae относятся к вирусам без наличия супер-капсида, тогда как вирусы остальных двух семейств имеют липопротеиновый суперкапсид. Нами также взято во внимание, что Hantavirus, сем. Bunyaviri-dae, отличается структурой нуклеокапсида — спиральной и отрицательной нитью РНК, тогда как вирусы семейств Picornaviridae и Flaviviridae — икоса-эдральной и положительными нитями РНК. Эти признаки могут определять специфичность взаимодействия данных вирусов с макрофагами.

Цель работы: дать комплексную цитохимическую и ультраструктурную характеристику резидентных макрофагов в процессе взаимодействия с РНК-содержащими вирусами, патогенными для человека. Установить механизмы развития цнтофизиологических изменений, специфичных для макрофагов, инфицированных различными видами РНК-содержащих вирусов. Задачи исследования:

1. С помощью молекулярно-генетических методов (ПЦР, нМФА, ИФА) и путем титрования на клеточных культурах вируссодержащих жидкостей определить адсорбцию и возможную репликацию изучаемых РНК-содержащих вирусов (вирус клещевого энцефалита, хантавирус и вирусы семейства Picornaviridae) в первичной культуре макрофагов.

2. Дать комплексную морфофункциональную характеристику резидентных макрофагов, зараженных указанными вирусами.

3. С помощью электронной микроскопии исследовать механизмы проникновения и выхода РНК-содержащих вирусов в резидентных макрофагах.

4. Выявить локализацию центров репродукции РНК-содержащих вирусов в макрофагах.

5. Изучить ультраструктурные изменения инфицированных РНК-содержащими вирусами макрофагов и выявить вирусспецифические структуры в этих клетках.

6. Исследовать активность эктоферментов плазмалеммы и цитоплазмати-ческих ферментов резидентных макрофагов, инфицированных РНК-сод ержащими вирусами.

7. Изучить нитроксидобразующую активность макрофагов, зараженных указанными вирусами.

8. Провести сравнительный анализ ультраструктурных и цитохимических изменений макрофагов, зараженных различными видами вирусов. Научная новизна:

С помощью морфологических и вирусологических методов установлена способность PHK-содержащих вирусов (энтеровирусов, вируса клещевого энцефалита и вируса Хантаан) к адсорбции и репродукции в макрофагах.

На основании комплексного исследования ферментативной активности зараженных макрофагов выявлены метаболические изменения в процессе репродукции в них вирусов. Определены типы цитопатогенного действия указанных вирусов на макрофаги, а также формы вирусной инфекции этих клеток.

Раскрыты этапы входа и выхода PHK-содержащих вирусов в макрофагах в связи со структурными особенностями их видов. Вирусы с наличием су-перкапсида (ВКЭ, хантавирус) входят в макрофаги путем локального лизиса плазмалеммы, тогда как вирусы без липопротеиновой оболочки (по-лиовирус, энтеровирусы ECHOl 1, Коксаки В1, 71) используют различные способы (локальный лизис плазмалеммы, кавеолы, эндосомы) проникновения в фагоциты. Выход хантавируса и ВКЭ, в отношении которых была установлена репродукция в макрофагах, осуществлялся подобно входу, тогда как для энтеровируса ECHO 11 выявлено два способа — путем локального лизиса мембраны и клазмагоза.

Дана ультраструктурная характеристика центров репродукции РНК-содержащих вирусов и их компонентов в инфицированных макрофагах.

На основании электронномикроскопического исследования классифицирована морфология вирусспецифических и вирусиндуцированных структур в макрофагах при репродукции в них РНК-содержащих вирусов.

Определены цитофизиологические критерии специфичности противовирусной защиты макрофагов, зараженных РНК-содержащими вирусами.

Теоретическое значение.

В работе раскрыты клеточные и молекулярные основы взаимодействия макрофагов с вирусными агентами, охарактеризована роль этих клеток в качестве как эффекторов фагоцитоза, так и триггера вирусной инфекции.

Полученные сравнительные данные о способах входа в макрофаги РНК-содержащих вирусов с наличием суперкапсида и без него расширяет общетеоретические представления о механизмах проникновения вирусов в клетки.

Установленные закономерности изменений структуры и функций макрофагов в процессе их взаимодействия с РНК-содержащими вирусами позволили выявить особенности защитной реакции этих клеток при вирусной инфекции. Эти новые данные имеют значение для понимания общебиологических процессов (запуск и синтез белков и нуклеиновых кислот, образование и движение клеточных органелл, осуществление эндои эктоцитоза и других), а также для выявления патологических изменений эукариотических клеток, что позволит подойти к обоснованию подходов к контролируемой коррекции клеточных процессов.

В целом, полученные в работе комплексные данные о морфофункцио-нальном состоянии макрофагов, зараженных вирусами семейств Picornaviri-dae, Flaviviridae и Bunyaviridae, вносят вклад в проблему вирусной цитопато-логии, а также способствуют углублению знаний о патогенезе вирусных инфекций.

Практическое значение.

Решение актуальной проблемы взаимоотношений макрофагов с РНК-содержащими вирусами с помощью современных методов иммуноэлектронной микроскопии позволило выявить критерии для ультраструктурной идентификации вызываемых ими вирусных заболеваний. Подобные исследования смогут обеспечить понимание не только процесса инфицирования и стратегии вирусного заражения клетки, но и дать возможность воздействия на этот процесс с целью определения терапевтических подходов для лечения вызываемых ими заболеваний.

Тестирование ферментативной активности макрофагов может быть использовано для исследования эффективности биологически-активных веществ при вирусной патологии, направленной как в отношении вирусов (влияя на их репродукцию), так и в отношении макрофагов (стимулируя их противовирусную защиту).

Материалы диссертации были использованы при подготовке:

• методических рекомендаций «Определение функциональной активности лейкоцитов периферической крови в качестве показателя неспецифической защиты организма» (Авторы: J1.M. Сомова, Н. Г. Плехова, Н.М. Кон-драшева, Т.С. Запорожец). Утверждены Департаментом здравоохранения Администрации Приморского края. Владивосток.- 2005.

• патента РФ «Способ определения биологической активности вещества (варианты)» (Патент 2 270 251 РФ от 10.09.2003) Авторы: Н. Г. Плехова, JI.M. Сомова. Заявитель и патентообладатель: ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. — 2 003 109 097/12- Заявл. 10.07.03. Опубл. 10.07.03., Бюлл. № 5.-7 с.

• патента РФ «Способ оценки состояния иммунитета» (Патент РФ от.

10.03.2007) Авторы: Н. Г. Плехова, J1.M. Сомова, Д. В. Заворусва, Н. М. Кондрашова. Заявитель и патентообладатель: ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Получено положительное решение, per. № 2 007 111 666/15(12 676).

• патента РФ «Способ оценки влияния фармакологических препаратов на местные факторы защиты организма на примере бронхолегочных заболеваний» (Патент РФ 2 337 620 от 09.01.2008) Авторы: Л. М. Сомова, Д. В. Заворуева, Н. Г. Плехова, Н. М. Кондрашова, Б. И. Гельцер. Заявитель и патентообладатель: ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМЫ. -2 007 100 308/14. Опубл. 10.11.08, Бюлл. № 31.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Резидентные макрофаги являются клетками-мишенями при инфицировании РНК-содержащими вирусами, имеющими липопротеиновый су-перкапсид (вирус клещевого энцефалита и хантавирус), а также энтеровирусами ECHOl 1, неимеющими его.

2. Одним из механизмов воздействия РНК-содержащих вирусов на макрофаги является стимуляция кислородзависимой и нитроксидобра-зующей активности клеток. К специфическим механизмам воздействия на фагоциты группы вирусов с наличием суперкапсида (ВКЭ, хантавирус) относится их способность активировать фермент — кислую фосфа-тазу, участвующую в процессе расщепления макромолекул их оболочки, тогда как группа вирусов без суперкапсида (полиовирус и эптеро-вирусы ЕСНОП, Коксаки В1 и 71) стимулирует неспецифическую эс-теразу — фермент отвечающий за иммунологическую стимуляцию макрофагов.

3. Характерным свойством группы вирусов, имеющих липопротеиновый суперкапсид, является их способность осуществлять вход и выход, не нарушая плазмалеммы клеток-мишеней, тем самым не оказывая выраженного цитопатогенного эффекта на макрофаги, тогда как вирусы без липопротеновой оболочки обладают подобным воздействием на эти клетки.

4. Тип инфицирования макрофагов РНК-содержащими вирусами является автономным, так как активация их генома происходит в цитоплазме, независимо от клеточного. При репродукции указанных вирусов в резидентных макрофагах выявляется острая, литическая инфекция, причем при заражении фагоцитов вирусами с наличием суперкапсида и энтеровирусом ECHO 11 установлена продуктивная инфекция, а в случае заражения энтеровирусами Коксаки В1 и 71 — абортивная.

5. РНК-содержащие вирусы обладают мембранотропным действием на макрофаги, которое выражалось в образовании на поверхности клеток большого количества псевдоподий с последующей гипертрофией мем-браносодержащих органелл. Наибольшим мембранотропным действием обладали вирусы без суперкапсида.

6. В цитоплазме макрофагов, инфицированных Хантавирусом, имеющим в составе своего генома РНК отрицательной полярности, формируются вирусиндуцированные структуры, морфологически отличающихся от структур, образующихся в результате репродукции вирусов с РНК положительной полярности (вирус клещевогоэнцефалита, энтеровиру-сы).

Апробация работы.

Основные материалы диссертации были представлены на: научно-практической конференции «Инфекционная патология в Приморском крае» (Владивосток, 1994) — научно-практической конференции «Проблемы инфекционной патологии в Сибири, на Дальнем Востоке и Крайнем Севере» (Новосибирск, 1996) — региональной конференции по актуальным проблемам морской биологии и экологии (Владивосток, 1998) — Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии» (Ростов-на-Дону, 1999) — III научно-практической конференции «Инфекционная патология на Дальнем Востоке» (Новосибирск, 1999) — XVIII и XIX Российских конференциях по электронной микроскопии (Черноголовка, 2000, 2008) — международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней — прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург 2003) — научно-практической конференции «Хантавирусы и хантавирусные инфекции (к 70-летшо изучения ГЛПС на Дальнем Востоке России)» (Владивосток, 2003) — 13-м, 14-м конгрессах европейских микроскопистов (Бельгия, 2004; Германия, 2008) — 8-м Азиатско-Тихоокеанской конференции по электронной микроскопии (Япония, Каназава, 2004) — 16-м международном конгрессе по микроскопии (Япония, Саппоро, 2006) — юбилейной конференции, посвященной 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита (Владивосток, 2007) — Всероссийской научной конференции «Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита» (Москва, 2007) — III научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособи-тельных процессов» (Новосибирск, 2007) — 16-м международном симпозиуме «Наноструктуры: физика и технология» (Владивосток, 2008) — IV съезде Всероссийского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).

Публикации. Основные положения и результаты работы отражены в 45 научных работах, в том числе: 8 — в международной печати, 19 — в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, а также в 1 методических рекомендациях и 3 патентах на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 330 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографического списка использованной литературы, включающего 514 источников, — из них 63 отечественных, 451-зарубежных. Работа иллюстрирована 1 схемой, 69 рисунками и 2 таблицами.

271 ВЫВОДЫ.

1. С помощью молекулярно-генетических (ПЦР, ИФА), вирусологических (титрование на клеточных культурах) и морфологических методов исследования (нМФА) установлено, что РНК-содержащие вирусы (вирус клещевого энцефалита, хантавирус и вирусы семейства Picornaviridae — полиовирус, энтеровирусы 71, ECHOl 1 и Коксаки В1) способны из ви-руссодержащей жидкости адгезировать к поверхности макрофагов и проникать в них. Вирусы, имеющие суперкапсид (ВКЭ и хантавирус), и энтеровирус ECHOl 1 способны к репродукции в макрофагах.

2. Установлено, что РНК-содержащие вирусы проникают в макрофаги, используя различные механизмы. Вирусы, содержащие суперкапсид (ВКЭ, хантавирус), проникают в макрофаги путем локального лизиса плазмалеммы. Вирусы, не имеющие липопротеиновой оболочки (полиовирус, энтеровирусы 71, ECHO 11 и Коксаки В1), используют различные способы проникновения в фагоциты (локальный лизис плазмалеммы, кавеолы, эндосомы). Выход хантавируса и ВКЭ, в отношении которых была установлена репродукция в макрофагах, осуществлялся подобно входу, тогда как для энтеровируса ECHO 11 выявлено два способа выхода из клетки путем локального лизиса плазматической мембраны и клазматоза.

3. Определена гипертрофия мембраносодержащих органелл и формирование разнобразных псевдоподий в макрофагах, зараженных РНК-содержащими вирусами. Наибольшим мембранотропным действием обладали вирусы, не содержащие суперкапсид.

4. Выявлено, что наряду с неспецифическими признаками поражения клеток (вакуольная и зернистая дистрофия, гелизация цитоплазмы и другие), в макрофагах, инфицированных РНК-содержащими вирусами, определялись изменения, характерные для вирусных инфекций, а именно: образование вирусспецифических и вирусиндуцированных структур — виропластов, трубчатых и пластинчатых образований, полинуклеопротеидных нитей и микрофиламентов, где определялись новообразованные вирусные частицы.

5. Установлено, что для макрофагов, зараженных РНК-содержащими вирусами, кроме полиовируса, характерен автономный тип инфицирования, на что указывали ультраструктурные признаки активации вирусного генома в цитоплазме при неизмененной морфологии клеточного ядра.

6. Определена продуктивная инфекция при заражении макрофагов вирусами, содержащими суперкапсид, и энтеровирусом ECHO 11, поскольку в этих случаях образуется морфологически выявляемый полноценный вирус. Абортивная форма инфекции обнаружена при взаимодействии фагоцитов с энтеровирусами 71 и Коксаки В1, на что указывает отсутствие формирования полноценных вирионов.

7. Комплексное исследование метаболизма клеток выявило, что этап проникновения РНК-содержащих вирусов в макрофаги сопровождается выраженной стимуляцией кислородзависимой и нитроксидобразующей ферментных систем. Нарастание активности данных систем носило более выраженный характер в случае инфицирования макрофагов вирусами, способными в них размножаться — ВКЭ, хантавирус и энтеровирус ЕСН011. На это указывало повышение активности как НАДФ-оксидазного комплекса первого порядка (плазматические мембраны), так и активности митохондриальных ферментов третьего порядкалактатдегидгеназы, сукцинатдегидрогеназы и цитохромоксидазы.

8. Установлено, что активность цитоплазматических ферментов, участвующих в процессах расщепления макромолекул, — кислой фосфатазы и неспецифической эстеразы — зависела от вида вируса, которыми были инфицированы макрофаги. В макрофагах, зараженных вирусами, содержащими суперкапсид (ВКЭ, хантавирус), увеличивалась активность кислой фосфатазы, тогда как при инфицировании клеток группой виру сов без липопротеиновой оболочки (полиовирус и энтеровирусы 71, ECHOl 1 и Коксаки В1) — неспецифической эстеразы.

9. Выявлена активная наработка метаболитов NO макрофагами, зараженными вирусами, содержащими суперкапсид (ВКЭ, хаитавирус). При этом в начальном периоде инфекции (15 мин — 4 ч) проукция метаболитов NO клетками коррелировала с изменением активности ферментов кислородзависимого их метаболизма. В поздние сроки наблюдения (от 1 до 4-х сут), у этих макрофагов отмечалась активность супероксид-дисмутазы — фермента, принимающего участие в ликвидации избыточного количества активных метаболитов кислорода.

10. Для макрофагов, зараженными указанными видами вирусов, характерна острая, литическая инфекция, так как при синтезе вирусных компонентов в клетках отмечается изменение ее метаболизма, обнаруживаются патологические внутриклеточные изменения и формирование вирусин-дуцированных образований, которые вызывают токсическое и механическое повреждение клеток. Это приводит к подавлению клеточного метаболизма и несостоятельности защитных реакций макрофагов.

11. Установлено, что вирусы, имеющие суперкапсид, осуществляют вход и выход, не нарушая плазмалеммы клеток-мишеней. Эго определяет способность этих вирусов к длительной репродукции в макрофагах без выраженного цитопатического эффекта. При отсутствии выраженных деструктивных изменений эти клетки могут выступать в роли источника указанных вирусов и принимать определенное участие в процессе их диссеминации в организме.

Рекомендации для внедрения результатов исследования:

— в науку.

1. при изучении процесса взаимодействия вирусов с клеточными культурами рекомендуется проводить комплексное исследование метаболизма клеток. Сопоставление этих данных с результатами вирусологических методов исследования позволит более точно идентифицировать характер воздействия вирусов на клетки с целью выявления защитных клеточных механизмов и способов их коррекции.

2. при исследовании патогенеза вирусных инфекций, у больных рекомендуется дополнительно проводить комплексное исследование ферментативной активности моноцитов/макрофагов, являющихся клеточными элементами врожденного иммунитета организма, и способными посредством выделяемых цитокинов оказывать влияние на его защиту.

— в учебный процесс.

Рекомендуется использовать в учебном процессе кафедры цитологии и гистологии ДВГУ новые данные о взаимодействии вирусов с клетками, а также методы оценки функциональной активности макрофагов (методические рекомендации «Определение функциональной активности лейкоцитов периферической крови в качестве показателя неспецифической защиты организма» (Авторы: JI.M. Сомова, Н. Г. Плехова, Н. М. Кондрашова, Т.С. Запорожец). Утверждены Департаментом здравоохранения Администрации Приморского края. Владивосток.- 2006).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Патологические процессы, развивающиеся в клетках под влиянием вирусов, принципиально отличаются от всех других форм ее патологии. Некоторый период времени инфицированные вирусом клетки могут оставаться жизнеспособными как при проявлении цитопатических изменений, так и без них. В таких клетках определяется не только деструкция или гипертрофия (гиперплазия) их отдельных органелл, но и выявляется формирование новых структур, которые обеспечивают репликацию вируса, транспорт его отдельных компонентов и выделение из клеток новой популяции вирионов. Причем исчезающие структуры нередко связаны с вновь возникающими, деструкция одних органелл индуцирует развитие патологических процессов в гомои ге-терологичных органеллах, которые при необратимости подобных процессов могут привести к гибели инфицированной вирусом клетки. Подобные изменения тесно связаны с метаболизмом и изучение ферментативного профиля инфицированных вирусом клеток позволяет дифференцировать характер взаимоотношений клетка-вирус.

Основным компонентом первого барьера защиты организма от инфекционных агентов являются клетки моноцитарного происхождения. При всем их разнообразии, обусловленном степенью зрелости и различной тканевой специализацией, эти клетки связывают единство происхождения, сходство структуры, общность основных функций и метаболических процессов, обеспечивающих реализацию этих функций. Макрофаги являются клетками-эффекторами и модуляторами различных воспалительных процессов, и по данным многих исследователей вирулицидные свойства этих фагоцитов относятся к важным элементам устойчивости организма при многих вирусных инфекциях [313, 365]. Также необходимо отметить, что различные вирусы могут проникать как в интактные, так и в стимулированные макрофаги и доказано, что источником инфекции в организме могут становиться и те фагоциты, которые являются непермиссивной системой для вируса [47, 52]. Исходя из того, что моноциты/макрофаги одними из первых клеточных элементов способны реагировать на проникновение возбудителей, особый интерес представляет оценка их функциональной активности в начальном этапе заболевания.

В наших исследованиях в качестве модельной системы использована первичная культура макрофагов перитонеального экссудата мышей без применения каких-либо индукторов воспаления, и эта популяция клеток называется резидентной. В силу филогенетической однородности этих клеток, данные, полученные при исследовании их взаимодействия с вирусами, можно экстраполировать на клетки моноцитарного происхождения класса млекопитающих [133, 365]. Подобным образом использованная модель первичной культуры макрофагов позволила провести детальное исследование взаимоотношений этих клеток с РНК-содержащими вирусами с первых минут и до последних часов развития инфекции.

Необходимо отметить, что конкретные механизмы активации макрофагов при различных вирусных инфекциях не идентичны и на данный момент находятся в стадии интенсивного изучения. Для комплексной оценки процесса взаимодействия вируса и макрофага в качестве инфекционных агентов мы использовали вирусы, принадлежащие к трем семействам: Picornaviridae (по-лиовирус, энтеровирусы ЕСН011, Коксаки В1 и 71), Flaviviridae (вирус клещевого энцефалита, ВКЭ) и Bunyaviridae (хантавирус). Несмотря на то, что все эти вирусы являются РНК-содержащими, мы руководствовались их структурными различиями. Так, Picornaviridae не содержат липопротеиновой оболочки — суперкапсида, и являются так называемыми «неодетыми» вирусами. Вирусы остальных двух семейств ее имеют и входят в группу «одетых» вирусов. Названные структурные отличия использованных вирусов могут определять различие в механизмах их проникновения в клетку, что в наших исследованиях и было обнаружено.

Первой стадией при вирусном инфицировании является адгезия вирусных частиц к специфическим рецепторам на клеточной поверхности и для проникновения в клетки-мишени хаитавирус [109, 231] и вирусы семейства Picornaviridae — ECHO 1 и Коксаки А21 и ВЗ используют гликопротеины — интегрины, состоящие из различных комбинаций, а и (3-цепей [144, 277], наличие которых также отмечается на поверхности моноцитов/макрофагов [138, 253]. Тогда как флавивирусы могут связываться с гепарансульфатным про-теогликаном, рецептором, обнаруженном на поверхности моноцитов/макрофагов [117, 233]. Была определена зависимость адгезии вирусов от стадии дифференцировки моноцито/макрофагов. К поверхности зрелых макрофагов присоединялось большее количество полиовирусных частиц, чем к различным популяциям моноцитов [113]. Также было установлено, что при заражении хантавирусом перевиваемой линии клеток — ТНР-1, являющейся предшественником моноцитов, и моноцитов/макрофагов первичной культуры цито-кини хемокинпродуцирующая активность последних была выше. Эти данные указывают на повышенную способность более зрелых клеток к реакции в ответ на введение инфекта, что позволяет применять первичную культуру моноцитов/макрофагов как модель для изучения хантавирусной инфекции [365]. В своем исследовании мы использовали популяцию перитонеальных клеток, которая включала в себя макрофаги примерно в одинаковой степени зрелости. По данным литературы [239], предварительная инкубация в течение 3 сут соответствует окончанию периода созревания моноцитов в резидентные макрофаги, которая происходит в результате адгезии этих клеток к поверхности. Таким образом, мы получали равноценную по функциональным свойствам популяцию резидентных макрофагов, которую впоследствии заражали вирусами.

С помощью нМФА количество клеток с адгезированным на них вирусами через 1 ч контакта в среднем составило 48,6%, что указывало на равноценную адгезию всех использованных вирусов сем. Picornaviridae к макрофагам. Адгезия энтеровирусов на макрофаги была подтверждена методом титрования надосадочных вируссодержащих жидкостей на клеточных культурах, с помощью ОТ-ПЦР и с использованием иммуноферментной тест-системы для определения специфических антигенных белков энтеровирусов. Несмотря на то, что традиционно считается, что каждый представитель сем. Picornaviri-dae для проникновения в клетку может взаимодействовать лишь с одним строго определенным специфичным клеточным рецептором, результаты наших исследований указывают на способность полиовируса, энтеровирусов ECHO 11, Коксаки В1 и 71 адгезировать к поверхности макрофагальных клеток. Это подтверждается литературными данными о способности энтеровирусов Коксаки, ECHO и 70 задействовать для своего входа разнообразные клеточные рецепторы [56]. При исследовании адгезии к макрофагам «одетых» вирусов, содержащих суперкапсид (хантавируса и ВКЭ), также определялена способность этих вирусов из вируссодержащей жидкости активно адсорбироваться на поверхности клеток.

Таким образом, полученные в настоящем исследовании результаты указывают на то, что при невосприимчивости к вирусным инфекциям в целом организма (известно, что взрослые мыши невосприимчивы к энтерои флави-вирусным инфекциям человека, а также к геморрагической лихорадке с почечным синдромом [51, 56]), к этим инфекциям могут быть чувствительны его отдельные клеточные компоненты, а именно — макрофаги. Это определяет макрофаги в качестве мишеней для использованных нами вирусов, особенно в случае их размножения, как было установлено при инфицировании этих клеток вирусами — ВКЭ, хантавирусом, и энтеровирусом ECHOl 1. С позиции имеющейся концепции противовирусного иммунитета [52], на начальном этапе заболевания инфицированные вирусами моноциты/макрофаги способны инициировать иммунный ответ организма, даже в случае если вирусы в них не размножаются. Действительно, при исследовании ферментативной активности макрофагов, зараженных всеми использованными вирусами как способными к репродукции — хантавирус, ВКЭ, энтеровирус ECHOll, так и не способными к ней — полиовирус, энтеровирусы 71 и Коксаки В1, нами была обнаружена стимуляция метаболизма этих клеток.

По основным биохимическим параметрам макрофаги не имеют принципиальных отличий от других клеток человека и животных, а пути метаболизма и его механизмы регуляции общие, как для всех эукариотических клеток. Вместе с тем, можно выделить важные особенности обмена макрофа-гальных клеток, связанные, с одной стороны, с их ультраструктурой, а с другой, — со специализацией их функций в направлении обезвреживания и переваривания различных объектов. РНК-содержащие вирусы способны к активной и нередко длительной репродукции в различных клетках.

К одному из наиболее ярких отличий резидентных макрофагов от стимулированных относится понижение активности ферментов плазматической мембраны 5'-нуклеотидазы и АТФазы [29]. Нами при исследовании активности этих ферментов определена достоверная стимуляция макрофагов в первые минуты контакта с энтеровирусом Коксаки В1 и полиовирусом. В ответ на введение вирусов, содержащих суперкапсид — ВКЭ и хантавируса, стимуляция клеток наступала в более поздние сроки (после Зч инкубации). Причем, в ответ на заражение хантавирусом, реакция клеток по показателям активности АТФазы была более выраженной, затем следовала активность ферментов фагоцитов, инфицированных вирусом Коксаки В1, полиовирусом и ВКЭ. В отличие от клеток, инфицированных указанными вирусами, в макрофагах, зараженных энтеровирусом ЕСНОП, выявлялась высокая активность 5'-нуклеотидазы и АТФазы. Вместо снижения внутриклеточного содержания этих ферментов, которые обычно расходуются клетками при различных пространственных преобразованиях плазмалеммы, в случае контакта фагоцитов с энтеровирусом ECHOl 1, мы наблюдали противоположный процесс — их синтез. Известно, что в течение процесса репликации вирусов многих семейств обнаруживается ингибирование экспрессии генов клетки-хозяина. Одной из причин этого считают образование в ресурсах клеток высокого уровня ферментов, таких как нуклеозид трифосфатаз и нуклеотидаз, используемых при синтезе вирусных компонентов [285]. Причем, нуклеозидтрифосфаты, которые синтезируются при участии 5'-нуклеотидаз, служат строительными блоками для вирусной РНК или функционируют в качестве коферментов. Наряду с этим, цитоплазматическая область АТФ-азы принимает участие в реакционном цикле фоефорилирования/дефосфорилирования при переносе синтезированных нуклеотидов. Нами с помощью ОТ-ПТ TP было установлено значимое различие между показателями количества вирусной РНК через 4 и 24 ч инкубации зараженных энтеровирусом ECHOl 1 клеток. Это указывало на внутриклеточный синтез специфической вирусной РНК. При сопоставлении этих результатов с полученными нами данными об увеличении внутриклеточного содержания 5-нуклетидазы и АТФазы в зараженных энтеровирусом ECHOl 1 макрофагах, можно утверждать, что они отражали наличие активного синтеза вирусных нуклеотидов в фагоцитах при ингибиции синтеза ее собственных белков. В литературе приводятся данные о способности пикорнавирусов ин-гибировать синтез белков клетки-хозяина, не оказывая влияния на продукцию белковых компонентов вируса [232]. Во многих случаях ингибиция белкового синтеза клетки-хозяина является результатом ее ответа на появление вирусной двойной нити РНК (dsRNA) с последующей активацией синтеза полипротеина. Также вскоре после заражения вирусом в клетках начинает синтезироваться и функционировать фермент — репликаза, обеспечивающая синтез вирусной дочерней РНК с ее матрицы. РНК репликаза выявляется, главным образом, в цитоплазме клетки-хозяина, и очень часто этот фермент связан с ее различными органеллами. Этот фермент катализирует синтез РНК из рибо-нуклеозид-5'-трифосфатов, который также может протекать при участии 5'-нуклеотидазы и АТФазы клеток-хозяев [421].

В физиологических условиях в макрофагах, в отличие от остальных клеток макрооргапизма, супероксидный анион-радикал фактически не образуется или образуется в очень небольших количествах [14, 16, 17]. В состоянии покоя фактически не функционируют на внутренней поверхности мембран NADPoKCHfla3bi и оксидазы Д-аминокислот фагоцитов. При анализе метаболической активности макрофагов, зараженных РНК-содержащими вирусами, нами установлена стимуляция ферментов кислородзависимой системы, которая зависела от вида вируса, которыми заражались клетки. Наибольшая активность ферментов отмечалась в случае инфицирования макрофагов вирусами, способными к внутриклеточному размножению, а именно — ВКЭ и энтеровирусом ECHO 11. В ответ на заражение этими вирусами в макрофагах определялось повышение активности NADP-оксидазного комплекса первого порядка (плазматические мембраны), на что указывали показатели НСТ-теста, а также мито-хондриальных ферментов третьего порядка — ЛДГ, СДГ и ЦХО. Эти данные свидетельствуют о стимулирующем эффекте указанных вирусов на макрофаги. Известно, что редокс-молекулы — активные метаболиты кислорода — участвуют в проведении внешнего сигнала, которое начинается на плазматической мембране клетки [16]. Дальнейшее внутриклеточное перемещение сигнала также может быть связано с активацией редокс-молекул определенных цитоплазма-тических элементов и транскрипционных факторов [17, 22]. Полученные нами данные выявили быструю реакцию макрофагов в ответ на введение вирусов, способных размножаться в макрофагах, так как уже в первые 15 мин одновременно повышается активность ферментов, связанных с наработкой супероксидных радикалов. На наш взгляд, наблюдаемая цикличность в динамике активности исследованных ферментов в фагоцитах отражала в первом периоде (до 3 ч) реакцию клеток на проникновение вирусов, а во втором (с 5 и до 48 ч) — наличие синтеза и выхода вирусных частиц во внеклеточное пространство.

Необходимо отметить, что данные по активности СДГ можно расценивать двояко. С одной стороны их повышение показывает наличие кислородоб-разующей активности клеток, с другой стороны, их понижение (ниже контроля) указывает на присутствие цитотоксического действия инфектов на клетки. Этот вывод базируется на известном факте, что преобразование метилтиазолилтетра-золия в формазан происходит с помощью СДГ митохондрий и уменьшение количества указанного фермента происходит при разрушении этих клеточных органелл [397]. Нами установлено, что в случае заражения макрофагов полиови-русом и вирусом Коксаки В1 отмечалось снижение активности СДГ, что отражало цитопатогенное воздействие этих вирусов на клетки. Эти данные были подтверждены нами с помощью морфологических методов.

Нельзя не отметить наличие активности ферментов, которые принимают участие в защите макрофагов от избытка перекисных продуктов. Так, несмотря на признаки деградации клеточной культуры, зараженной ВКЭ, в поздние сроки наблюдения (от 1 до 4-х с) выявлена активность супероксиддисмутазы, принимающей участие в ликвидации избыточного количества активных метаболитов кислорода. По-нашему мнению, наибольшая активность этого фермента в поздние сроки инфицирования макрофагов, совпадающая с периодом репродукции ВКЭ, указывала на реализацию защитных функций макрофагов. Именно в этот период происходит активный синтез в цитоплазме зараженных клеток различных белковых и нуклеиновых компонентов ВКЭ, которые могут выступать в качестве специфического стимула для активации ферментных систем макрофагов.

В настоящее время клеткам моноцитарной линии при вирусных инфекциях придаётся принципиальное значение, определяемое их способностью в стимулированном состоянии продуцировать оксид азота, который, в свою очередь, оказывает влияние на синтез у-интерферона и фактора некроза опухоли ос. Причем, внесение в культуру инфицированных макрофагов интерферона у увеличивало нитроксидобразующую активность клеток, а его комбинация с фактором некроза опухоли, а приводила к ее ингибированию [290]. Различают два механизма образования NO: 1) NADPH-зависимый синтез NO и L-цитруллина из окисленного гуанидиного нитрогена L-аргинина, катализируемый ферментом нитроксидсинтазой, и 2) нитритредуктазный, действующий в условиях дефицита кислорода. Данные механизмы связаны между собой и являются составляющими компонентами цикла NO [46]. Также известно, что индуци-бельная NO-синтаза солокализована с мембранными структурами макрофагов и ее концентрация в норме очень низка. В период активации iNOS происходит повышение эндогенной продукции NO, который является одним из ингредиентов агрессивных веществ, используемых в защите организма от проникающих болезнетворных организмов [18]. Действительно, на различных клеточных культурах было продемонстрировано, что NO в равной степени влияет как на репликацию вируса, так и на инфицированные клетки. Так, на модели макро-фагальной культуры, зараженной вакцинным ДНК-содержащим вирусом, выявлено, что индуцируемый под влиянием ИФН-у NO через инактивацию рибонуклеиновой редуктазы клеток воздействует на поздние стадии репликации вируса, включая ДНК-синтез, синтез белков и созревание вирионов [115].

Нами с помощью различных методов исследования установлена стимуляция нитроксидобразующей активности макрофагов, зараженных группой вирусов, содержащих суперкапсид — хантавирусом и ВКЭ. На фоне активной продукции клетками метаболитов NO, обнаруженной на протяжении всего периода наблюдения, выявлялась активность НАДФ-диафоразы и индуцибельной NO-синтазы. Причем показатели активности этих ферментов в зараженных указанными вирусами фагоцитах не всегда сочетались с динамикой активности ЦХО. По нашему мнению, при понижении активности NO-синтазы генерация NO в клетках осуществлялась по нитритредуктазному пути, на что указывали данные о повышении показателей активности митохондриалыюй ЦХО в зараженных вирусами макрофагах. В то же время в начальный период инфицирования макрофаги продуцируют метаболиты N0 по нитроксидсинтазному пути при участии в качестве катализатора фермента — нитроксидсинтазы. При заражении клеток группой вирусов, не содержащих липопротеиновой оболочки — полиовирусом и энтеровирусами Коксаки В1 и ECHO 11, преимущественно определялся нитритредуктазный путь образования NO.

Необходимо остановиться на установленном нами факте образования метаболитов N0 макрофагами под влиянием ВКЭ, поскольку в литературе этот вопрос освещен неоднозначно. В исследованиях Т. R. Kreil и М. М: Eibl [290] было показано, что в инфицированных ВКЭ макрофагах мышей значительно снижается продукция N0. При заражении популяций моноцитов/макрофагов флавивирусом Западного Нила определено его стимулирующее воздействием на адгезивную и нитроксидобразующую активность этих клеток [429]. Также при инфицировании макрофагальной культуры вирусом.

Японского энцефалита выявлен внутрии внеклеточный стимулирующий эффект ИФН-у на нитроксидобразующую активность клеток. Причем, в этих фагоцитах установлено NO-опосредованное ингибирующее действие на репликацию данного вируса [299]. Наряду с увеличением уровня N0, выделяемого in vitro моноцитами крови больных инфицированных вирусом Денге, в этих клетках была установлена экспрессия индуцибельной NO-спнтазы [265] и доказано, что для полноценного антивирусного действия макрофагальных клеток необходима активация кислородзависимой ферментной системы. В этом случае при одномоментной продукции активных метаболитов кислорода и NO происходит образование пероксинитрита, который, в свою очередь, усиливает цитотоксичность макрофагов в отношении вируса Денге [115]. Таким образом, очевидно, что способность моноцитов/макрофагов к продукции N0 имеет определенное значение в патогенезе флавивирусных инфекций. Причем, интерес представляет, каким образом NO может ингибировать репродукцию вируса: либо оказывая действие на сам процесс синтеза вирусов, либо опосредованно через активацию защитных механизмов клетки.

Нами установлено, что в макрофагах, зараженных ВКЭ, отмечается активная наработка метаболитов NO, динамика которой в начальном периоде инфекции (15 мин — 4 ч) коррелирует с изменением активности ферментов кислородзависимого метаболизма клеток. Необходимо отметить отсутствие двухфазной продукции NO клетками, подобной изменению активности кислородзависимого метаболизма клеток. По-видимому, генерация N0 в этих клетках может осуществляться также и по нитритредуктазному пути, что нуждается в дополнительном исследовании. На это также указывают полученные нами данные о повышении активности митохондриальной ЦХО в зараженных ВКЭ макрофагах. Известно, что этот фермент принимает участие в образовании NO по нитритредуктазному пути [31].

В зависимости от вида вируса, которыми были инфицированы макрофаги, выявлялось различие также в активности ферментов, входящих в состав ли-зосом этих клеток (кислой фосфатазы и неспецифической эстеразы). Известно, что в макрофагах большая часть гидролитических лизосомальных ферментов находится в неактивной форме и при стимуляции клеток происходит синтез активных форм ферментов за счет связывания субстрата с коферментом [31]. Нами установлено, что заражение указанными вирусами макрофагов вызывало активацию этих ферментов. При инфицировании вирусами, содержащими супер-капсид (ВКЭ и хаитавирус), в макрофагах увеличивалась активность кислой фосфатазы — фермента, катализирующего процесс расщепления макромолекул. На наш взгляд, высокую активность этого фермента можно связать с его участием в этапе освобождения вирусов от суперкапсида. Это предположение подтверждается данными других исследователей, которые указывают на особенное значение рН для процесса освобождения вирусов от оболочки, оно должно быть низкое в эндосомах или в окружающем вирус участке цитоплазмы [127]. При таких значениях рН активизируется кислая фосфатаза [61], последующее накопление которой, на фоне активного синтеза вирусных компонентов, мы связываем с реализацией макрофагами защитных функций.

При инфицировании макрофагов вирусами без липопротеиновой оболочки — полиовирусом и энтеровирусами 71, ECHOl 1 и Коксаки В1 — выявлена активность другого протеолитического фермента — неспецифической эстеразы. Известно, что этот фермент принадлежит к группе лизосомальных, обеспечивающих протеолитическую и переваривающую функции фагоцитов. Причем, указывается на факт изменения эстеразной активности, связанной с физиологической или иммунологической стимуляцией макрофагов [61]. Установленное нами высокое содержание этого фермента в случае заражения макрофагов вышеуказанными вирусами, которым не свойственен период освобождения от суперкапсида, они его не имеют, отражает активную стимуляцию этих клеток в ответ на внедрение инфекта. Это подтверждается нашими данными о наибольшей эстеразной активности макрофагов после их контакта с полиовирусом, который обладал наибольшим цитопатогенным действием на культуру клеток. При этом, несмотря на активную наработку макрофагами неспецифической эстеразы, что относится к защитной реакции клетки, они оказываются не способными к обезвреживанию и уничтожению внедренного в них вируса.

Итак, комплексная оценка ферментативных изменений в макрофагах является высокочувствительным способом индикации репродуктивной активности вирусов в цитоплазме клетки, а также дифференциации типов их цитопато-генного действия (рис. 69). Исходя из результатов исследования метаболизма макрофагов, зараженных РНК-содержащими вирусами, можно предположить, что период активации генома этих вирусов в цитоплазме клетки-хозяина сопровождается первоначальным повышением активности ферментов плазмалеммы, а период транскрипции вирусной РНК и синтеза компонентов вируса сопровождается стимуляцией кислородзависимой и нитроксидобразующей активностей фагоцитов. Этот вывод обосновывает полученный нами факт достоверного повышения ферментативной активности клеток, а также выявленной связи между ее динамикой и периодами взаимодействия указанных вирусов с фагоцитами. Так, постепенное повышение активности ферментов кислородзависимой системы в период до 2-х ч после заражения объясняется пространственным изменением плазматической мембраны макрофагов в результате проникновения вирусов внутрь цитоплазмы, что коррелирует с активностью эктоферментов плазмалеммы (5″ -нуклеотидазы и АТФ-азы). Это становится понятным, так как известно, что фермент, окисляющий NADPH-оксидазу, находится в плазма-лемме и мембранных фагосомах, образующихся из ее инвагинатов. При этом плазматическая мембрана структурно или функционально сопряжена с рецепторами, распознающими внешние сигналы, и активируется при связывании ли-гандов либо на фоне общей перестройки мембраны [34, 55]. Наличие активности плазмалеммы было подтверждено нами при ультраструктурном исследовании макрофагов, зараженных РНК-содержащими вирусами. Было установлено, что после адсорбции на поверхности фагоцита вирусы, содержащие суперкап-сид (ВКЭ и хантавирус), проникают в клетку путем слияния их оболочки с плазматической мембраной, при этом мы не обнаружили у этих клеток образования инвагинатов на поверхности плазматической мембраны и эидосом. Тем.

1 этап, начало инфекции, вход вирусов.

2 этап, развитие инфекции в макрофагах.

3 этап, завершение инфекции в клетках.

Ультраструктурные изменения макрофагов вирусы, содержащие суперкапсид вирусы, не содержащие суперкапсид.

Незначительное изменение плазмалеммы в результате проникновения хантавируса и ВКЭ путем локального лизиса плазмалеммы Энтеровырус ЕСIIO11 и по-лиовирус — образование псевдоподий через 15−45 мин контактавход энтеровирусов 71 и Коксаки В1 путем локального лизиса плазмалеммы.

Цитохимические изменения макрофагов вирусы, содержащие суперкапсид вирусы, не содержащие суперкапсид.

Повышение активности ферментов плазмалеммы, указывающее на активацию макрофагов, повышение активности кислой фосфатазы Энтеровирус ECHO 11 — синтез ферментов плазмалеммыполиовирус, энтеровирус Коксаки В1 — повышение активности ферментов плазмалеммы, указывающее на активацию макрофаговповышение активности неспецифической эстеразы.

Хантавирус — вакуольная дистрофия цитоплазмыформирование Зх типов ви-русиндуцированных структурВКЭ — зернистая дистрофия цитоплазмы, образование виропластов и специфических псевдоподий Энтеровирусы — зернистая дистрофия цитоплазмы, образование виропластов и характерных специфической стимуляции клеток псевдоподий полиовирус — вакуольная дистрофия цитоплазмы.

Продуктивная инфекция макрофагов с выходом вирусов во внеклеточное пространствопатологические изменения клеточных ядер, Хантавирус — образование миелиноподобных структур Общее свойство вирусов — гипертрофия мембраносодержащих органеллэнтеровирус ЕСН011 -продуктивная инфекция с выходом вирусов во внеклеточное пространствоэнтеровирусы 71 и Коксаки В1 -абортивная инфекция клетокполиовирусдегенеративные изменения макрофагов.

Двухволновая динамика повышения активности ферментов кислород-зависимой системы и высокая нитроксидоб-разую-щая активность макрофагов Энтеровирус ECHO 11 -двухволновая динамика повышения активности ферментов кислородзависи-мой системыполиовирус, энтеровирус Коксаки В1 — снижение активности этих ферментов.

Повышение активности ферментов кислородзависи-мой системы и кислой фосфатазыснижение нитроксидобразую-щей активности макрофагов Общее свойство вирусов — высокая активность неспецифической эстеразы. Энтеровирус ECHO 11 — повышение активности ферментов кислородзависи-мой системыполиовирус, энтеровирус Коксаки В1 — отсутствие активности этих ферментов.

Рис. 69. Схема ответной реакции макрофагов на введение РНК-содержащих вирусов не менее, исследования ферментативной активности этих клеток доказывают стимуляцию резидентных макрофагов в начальный период (до 1 ч) проникновения в них указанных вирусов. Необходимо отметить, что значения показателей активности ферментов кислородзависимой системы в этот период были ниже, чем в период, сопряженный с началом синтеза вирусных компонентов (после 4−5 ч инкубации).

По литературным данным известно, что хантавирус входит в клетки перевиваемых культур путем клатрин-зависимого эндоцитоза, используя в ранней стадии проникновения эндосомы, а в поздней стадии — внутриклеточные органеллы с низким значением рН — лизосомы [231]. Для флавивирусов Денге и Западного Нила также указывается проникновение путем клатрин-зависимого эндоцитоза без формирования ранних и поздних эндосом, при условии использования клеточных органелл с низким значением рН. Эти исследования были проведены на клетках культуры комара, носителя вируса Денге [68], и перевиваемой культуре Vero, в которой отмечалось интенсивное размножение вируса Западного Нила [123]. При ультраструктурном исследовании входа вирусов, имеющих суперкапсид — хантавируса и ВКЭ, в резидентные макрофаги нами было установлено, что для них характерен механизм проникновения путем локального лизиса плазмалеммы. В процессе проникновения указанных вирусов мы не наблюдали инвагинации плазмалеммы фагоцитов и образования морфологических структур, подобных кавеолам и эн-досомам, как, например, в случае инфицирования макрофагов энтеровируса-ми. Вероятно, в наших исследованиях механизм входа указанных вирусов путем локального лизиса плазмалеммы обусловлен морфофункциональными особенностями макрофагов как фагоцитов. Было показано, что этот механизм используется флавивирусом Денге при выходе из макропиноцитозной вакуоли при его поглощении моноцитами [493]. Также в литературе указывается на способность одного и того же вида вирусов использовать различные механизмы проникновения в клетки, зависящие от типа клеток, с которыми они контактируют [184, 238].

Принято, что вирусы без суперкапсида, к которым относятся энтеровиру-сы, преимущественно проникают в клетки путем клатрин-опосредованного эндоцитоза либо с помощью локального лизиса плазмалеммы [151]. Так, энтеро-вирусы Коксаки А21 и В1 [136, 185], после присоединения к клеточной поверхности через рецепторы, характерные для адгезии аденовирусов и CD55, входят в клетки образуя кавеолы. При этом необходимо отметить, что в основном процесс входа и репродукции энтеровирусов исследовался на популяции клеток перевиваемых культур эпителиального происхождения. При инфицировании первичной культуры макрофагов энтеровирусами 71 и Коксаки В1 нами было обнаружено, что эти вирусы входят в клетки только путем формирования кавеол, тогда как вход полиовируса в макрофаги осуществлялся тремя путями: путем формирования кавеол, локального лизиса плазмалеммы и, после продолжительной инкубации до 45 мин, путем макропиноцитоза. В литературе указывается на проникновение полиовируса в клетки путем клатринлибо динамин-опосредованного эндоцитоза, при этом обязательно формирование везикул крупного размера [513]. Также, наряду с этим, указывается, что вход этого вируса не зависит от динамина, так как для образования везикулы на поверхности клетки необходим фермент гуанинтрифосфатаза, активность которого в некоторых случаях не опреляется, что предполагает вход полиовируса по иному пути [151]. По-видимому, наблюдаемые нами способы проникновения полиовируса в макрофаги определяются специфичностью данной клетки как фагоцита, для которого характерно активное поглощение чужеродного материала. Подобные свойства макрофагов обнаруживались после 45-минутной инкубации с по-лиовирусом, когда наблюдался макропиноцитоз вирусных частиц, что связано с ответной реакцией клеток на их внеклеточное присутствие. Активация макрофагов в этот период была подтверждена нами результатами биохимического исследования активности ферментов клеток, зараженных полиовирусом.

Недавно различными исследователями сообщалось [166, 275], что энте-ровирусы ECHO 1, как и Коксаки, способны проникать в эпителиальные клетки перевиваемых культур путем образования кавеол. Нами обнаружено, что в течение первых 15 мин энтеровирус ECHO 11 проникает в цитоплазму макрофагов путем локального лизиса их плазмалеммы. В дальнейшем, наблюдалась инвагинация и формирование в цитоплазме зараженных макрофагов эндоцигар-ных вакуолей с включенными в них вирусными частицами. Выход вируса из эндоцитарных вакуолей осуществлялся путем локального лизиса мембраны клеток. Несмотря на наличие специфической стимуляции макрофагов, на что указывало появление на поверхности фагоцитов клапановидных псевдоподий с электронноплотными зернистыми включениями, нами не было обнаружено макропиноцитоза этого вируса.

Таким образом, нами установлено, что пути проникновения пикорнави-русов в макрофаги разнообразны. По нашему мнению, это связано как с видовой принадлежностью этих вирусов, так и с типом клеток, с которыми они взаимодействуют, в данном случае с однородной популяцией клеток — резидентными макрофагами. На возможность проникновения вирусов различными путями в зависимости от типа клеток указывалось в литературе. Например, вирусы герпеса, используют альтернативные пути входа — эндоцитарный или не-эндоцитарный, зависящий от типа клетки — кератиноциты или нейроны [238]. Вирус Эпштейн-Барр входит в эпителиальные клетки путем слияния с их плазмалеммой, а в В-лимфоциты — эндоцитозом [323], подобно последнему, цито-мегаловирус человека проникает в фибробласты путем локального лизиса их мембраны, тогда как в эпителиоциты — с помощью эндоцитоза [184].

До проникновения вируса в клетку, при его внеклеточной локализации, вирион биологически инертен. Эта инертность сохраняется до тех пор, пока вирусный геном не начинает функционировать внутриклеточно как самостоятельная единица. В дальнейшем, вирус способен вызывать гибель клетки, так как, размножаясь в ней, индуцирует синтез вирусспецифических белков, способных в той или иной степени подавлять клеточный метаболизм. В наших исследованиях показано, что вирусы, имеющие суперкапсид — хантавирус и ВКЭ, проникают в макрофаг, на первом этапе не повреждая его. Затем в процессе активации своего генома в цитоплазме макрофага, они способны изменять метаболизм клетки — хозяина. При этом тип инфицирования макрофага относится к автономному, потому что вирусный геном реплицируется независимо от клеточного генома. Также необходимо отметить некоторые особенности морфогенеза вирусов этой группы. Снаружи нуклеокапсиды хантавируса и ВКЭ покрыты двухслойным липидным суперкапсидом, на котором располагаются белковые структуры с гемагглютинирующей активностью. Поверхностные специальные F-белки обеспечивают слияние вирусного суперкапсида и клеточных мембран. Из литературных источников известно, что на поверхности плазмалеммы макрофагальных клеток отмечается наличие F-рецепторов, которые и определяют эту клетку как мишень [220]. Обнаруженное нами проникновение вирусов, имеющих суперкапсид, путем слияния и последующее их освобождение таким же способом, подтверждает их особенные свойства, присущие этой группе вирусов. Так, при ультраструктурном исследовании начального этапа адгезии вирусных частиц к поверхности макрофагов нами была обнаружена активация поверхностных белков суперкапсида. Морфологически это выражалось в утолщении оболочек вирусов и наличии на его поверхности blebs-структур. Подобные структуры были описаны как показатели активации поверхностного белка суперкапсида — гемагглюти-нина у вируса инфлюэнции [430]. Таким образом, свойство группы вирусов, содержащих суперкапсид, осуществлять вход и выход, не нарушая плазмалеммы клеток-мишеней, определяет их способность к длительной репродукции в этих клетках без цитопатического эффекта. Нами также были выявлены различия в патологических изменениях макрофагов, инфицированных этой группой вирусов.

В зараженных хантавирусом макрофагах было обнаружено изменение плазмалеммы, которое проявлялось в появлении неглубоких многочисленных выемок, тогда как при инфицировании фагоцитов ВКЭ было установлено иное изменение плазмалеммы, характерное для специфической стимуляции макрофагов в ответ на внедрение инфекта (рис. 69). Это выражалось в появлении многочисленных псевдоподий округлой формы с электронноплотным содержимым. Отличия были обнаружены и в изменениях цитоплазмы клеток, зараженных этими вирусами. Так, в случае заражения макрофагов хантавирусом отмечалось разряжение периферической части цитоплазмы вследствие дислокализации ее органелл в околоядерное пространство, что приводило к ее вакуольной дистрофии. Сайты внутриклеточной локализации частиц хантавируса и их последующей репродукции нами были выявлены в участках цитоплазмы клеток с повышенным содержанием рибосом и наличием цистерн эндоплазматического ретикулума. Помимо этого, были обнаружены специфические морфологические признаки вирусной инфекции клетки. Это выражалось в одновременном присутствии в цитоплазме зараженных макрофагов трех типов вирусных включений: 1) плотные виропласты- 2) сформированные из первых, морфологически четко обозначенные специфические структуры с ограничивающей их двухслойной мембраной- 3) пластинчатые и трубчатые структуры, которые, в основном, располагались в околоядерной зоне цитоплазмы инфицированных клеток. В случае инфицирования макрофагов остальными вирусами мы не наблюдали подобного различия в структуре вирус-специфических образований. По мнению Авцына [2], наличие подобного типа структур можно объяснить нарушением внутриклеточного синтеза белка в инфицированных клетках. Белки вируса, являясь чужеродными для клетки, не подвергаются ее катаболизму. Мы предполагаем, что как и трубчатые, так и пластинчатые структуры являются местом синтеза белков хантавируса. В свою очередь, плотные виропласты и рибонуклеопротеидные нити, по-видимому, определяют место синтеза рибонуклеиновых кислот. Таким образом, полученные нами ультраструктурные данные свидетельствуют о различном внутриклеточном местоположении центров синтеза белковой оболочки и нуклеопротеидов хантавируса. Этот вывод подтверждается исследованиями на перевиваемых культурах клеток, зараженных вирусами сем. Bunyaviridae [80, 316, 388, 494]. Было показано, что после проникновения вирусные частицы перемещаются внутрь цистерн эндоплазматической сети, где происходит их освобождение от суперкапсида путем гликолиза гликопротеинов G1 и G2, после чего эти белки остаются и накапливаются в аппарате Гольджи. Нуклео-капсидный белок перемещается в околоядерную зону цитоплазмы, где инициируется транскрипция вирусной РНК и происходит сборка рибонуклеопро-теина. Морфологически это проявляется в формировании различного типа виропластов [332], как и было установлено нами при исследовании макрофагов, зараженных хантавирусом. Рибонуклеопротеин вновь перемещается к цистернам аппарата Гольджи, где происходит специфическое опознавание цитоплазматического вирусспецифического компонента для его соединения с гликопротеинами суперкапсида, после чего формируются вирионы [332]. Другие авторы на основании электронно-микроскопического и радиоизотопного исследования культуры клеток Vero-б, инфицированной хантавирусом, обнаружили локализацию синтеза его нуклеопротеидов в цистернах гранулярной эндоплазматической сети, а синтеза белка нуклеокапсида — в цитоплазме инфицированных клеток [257]. При этом образование вирусных включений в процессе онтогенеза вируса в этих клетках авторами не отмечено.

Необходимо отметить, что заражение макрофагов хантавирусом вызывало чрезмерное расширение цистерн агранулярной эндоплазматической сети, и в этих клетках в результате слияния различных мембраносодержащих органелл отмечалось образование миелиноподобных структур, занимающих всю цитоплазму. Формирование подобных структур на последних этапах развития инфекций характерно для клеток, зараженных вирусами, содержащими суперкапсид. Этот процесс связан с образованием липои мукопротеидов, необходимых для формирования вирусной липопротеиновой оболочки, когда в клетках обнаруживаются неспецифические расстройства обмена липидов [173].

Из всех флавивирусов, наиболее полноценно исследованы взаимоотношения вируса Денге с клетками моноцитарно-макрофагальной системы, причем скорость его размножения в макрофагах выше, чем в периферических В-лимфоцитах [129]. В отношении рецепторов, используемых вирусом Денге для проникновения в моноциты/макрофаги, существуют разноречивые мнения. Так, одними исследователями указывается, что для входа этого вируса в фагоциты человека не задействуются Fc рецепторы этих клеток, и в качестве возможных рецепторов используются мембранные протеины молекулярной массой 27, 45, 67 и 87 килоДальтон [330]. Другими же исследователями считается, что для вируса Денге характерно проникновение в макрофаги посредством рецепторов, чувствительных к трипсину, а также трипсин-резистентных Fc рецепторов — 22 [115]. По данным А. А. Смородинцева [50. 51] известно, что ответная реакция макрофагов на заражение вирусом Лангат, относящимся к комплексу КЭ проявляется в их способности фагоцитировать клетки с адсорбированными на них вирусными частицами. Нами установлено, что ВКЭ без участия каких-либо других факторов способен адгезировать из вируссодержащей жидкости к поверхности резидентных макрофагов, проникать и размножаться в них. Подобные данные об избирательной адсорбции к моноцитам/макрофагам были получены при исследовании взаимодействия этих клеток с флавивирусом Денге [115, 117]. При морфологическом исследовании клеточной культуры, зараженной ВКЭ, нами были обнаружены признаки цитопатического действия этого вируса па макрофаги. Это выражалось в наличии зернистости в цитоплазме клеток, усилении ее эозинофилии, что характеризовало увеличение реакции на РНК и белок, а также в кариопикнозе у некоторых клеток. Наряду с указанными клетками, определялись макрофаги с признаками апоптоза.

При ультраструктурном исследовании культуры моноцитов, зараженных вирусом Денге, установлено, что его вход в клетки осуществляется путем фагоцитоза и макропииоцитоза. На это указывало наличие в цитоплазме моноцитов большого количества вакуолей с вирусными частицами, обнаруживаемых после одного часа инкубации инфицированных клеток. В дальнейшем, исследователями не наблюдалось морфологических признаков репродукции этого вируса в моноцитах, что дало основание авторам считать маловероятным факт функционирования этих клеток в качестве источника вирусной инфекции. Также одним из доказательств этого вывода, являлся обнаруженный после 2-х суток инкубирования апоптоз зараженных вирусом клеток, который характеризовался конденсированием хроматина вдоль мембраны ядра с последующей ядерной фрагментацией, уменьшением размеров клеток и вакуолизацией их цитоплазмы. Эти данные дали авторам основание считать, что предполагаемая роль моноцитов/макрофагов в патогенезе заболевания, вызванном вирусом Денге, состоит в элиминации вирусных частиц и фагоцитировании остатков вирусиндуцированных апоптозных клеток [493]. Тем не менее, работами других исследователей установлено [115], что дифференци-ровка в течение 45 дней моноцитарно-макрофагальной культуры клеток, в последующем зараженной вирусом Денге, может поддерживать размножение вируса и продукцию цитокинов и хемокинов фагоцитами. Эти данные указывают на функциональную компетентность зрелых макрофагальных клеток в развитии вирусной инфекции. Также исследователями отмечалось, что размножение вирусов сосредотачивается в макрофагальных клетках, имеющих четкие признаки функциональной активности, и в них обнаруживаются виропласты и нуклеокапсиды [48].

В наших исследованиях использовалась первичная культура макрофагов, которая предварительно инкубировалась в течении 3-х сут, что позволило получить однородную популяцию клеток, прошедших все этапы диффе-ренцировки. Подготовленные таким образом макрофаги были способны поддерживать репродукцию ВКЭ при сохранении клеточных структур в течение 4-х суток, что позволило нам исследовать все этапы репродукции этого вируса. При ультраструктурном исследовании нами было обнаружено, что в макрофагах, инфицированных ВКЭ, выявляется зернистая дистрофия цитоплазмы, которая выражается в уплотнении цитозоля в результате появления в нем различных электронноплотных образований. Зернистая дистрофия цитоплазмы возникает при усиленном синтезе новых структур, таких как рибосомы, полирисомальные нити, микрофиламенты и другие органеллы. Известно, что подобного типа дистрофия является выражением напряжения функциональных процессов и приспособительно-компенсаторных реакций клеток [2]. При этих нарушениях накапливается необычное количество (или необычные типы) макромолекул или продуктов их распада. При развитии дистрофий наиболее уязвимы аэробное дыхание, (окисление, связанное с фосфолирировани-ем), синтез ферментов и структурных белков, сохранность интегрированности клеточных мембран и генетического аппарата клетки. Подобные изменения цитоплазмы были выявлены в клетках при заражении культуры лимфобла-стов флавивирусом Денге [492], а также в макрофагах мышей, зараженных Бразильскими флавивирусами (вирус желтой лихорадки, вирусы энцефалитов — Rosio, Bussuquara и Saint Louis). Было показано, что на 3-ий день инфекции не зависимо от випа вируса обнаруживаются активированные клетки с повышенным количеством цитоплазматических выростов, у которых шероховатая и гладкая эндоплазматическая сеть была гипертрофирована. В цитоплазме таких фагоцитов обнаруживалось большое количество рибосом и синтезированных вирусных частиц [85].

Флавивирусы являются типичными цитозольными вирусами, поскольку их РНК-зависимый полимеразный комплекс ассоциирован с внутриклеточными мембранами, что определяет механизм биосинтеза вирусного РНК-генома в цитоплазме инфицированных клеток. Репликационный цикл флавивирусов в клетках перевиваемых культур начинается в цитоплазме с трансляции вирусной РНК. После этого одномоментно образуются полипротеиновые нити и дочерняя РНК. Установлено [124], что полипротеиновые нити, образованные из РНК флавивируса Кунин, сопряжены с ви русиндуцированными мембранными структурами цитоплазмы инфицированных клеток. Эти структуры морфологически выявляются как плотное скопление везикул в виде свернутых мембран и паракристаллических структур и включают компоненты вирусспецифических протеаз. Синтез гликопротеинов суперкапсида этого вируса связан с промежуточными цистернами эндоплазматической сети и аппарата Гольджи [425]. Сборка вирионов происходит в расширенных цистернах эндоплазматической сети, где могут обнаруживаться цепочки новообразованных вирусных частиц [308, 309, 310]. Подобный репликационный цикл был описан в клетках культуры нейронального происхождения для флавиви-руса Японского энцефалита [490] и для ВКЭ в клетках почек хомяка ВНК-21 [442]. Также отмечается, что на поздних стадиях флавивирусной инфекции комплекс Гольджи перемещается из центральной околоядерной зоны в периферическую и входит в состав вирусных включений [425]. В этот момент параллельных цистерн аппарата Гольджи обнаружить не удается, остается только скопление гигантских вакуолей [395].

Проведенный нами ультраструктурный анализ макрофагов, зараженных ВКЭ, выявил морфологические особенности, связанные с синтезом вирусных компонентов в цитоплазме, отличающиеся от известных для другого типа клеток, описанных выше. Установлено, что вход и выход вирусных частиц происходит путем локального лизиса мембраны клеток. Эти данные отличаются от известного факта поглощения флавивируса Денге моноцитами с помощью макропиноцитоза [493], тогда как, установленный нами механизм выхода ВКЭ из клеток согласуется с результатами других исследователей, которые указывают особенное значение плазмалеммы клетки-хозяина в процессе окончательного формирования на их поверхности флавивирусов Западного Нила [343]. Несмотря на отмеченное присутствие ВКЭ в цистернах эндоплазматической сети, ни в одном случае нами не было обнаружено признаков синтеза вирусных частиц в этих структурах. Преимущественно вирионы локализовались в цитоплазме клеток, со временем перемещаясь в околоядерную зону, где и обнаруживались вирусные частицы с морфологическими признаками активации в них синтетических процессов. На это указывало появление на поверхности вирионов нитевидных образований, а в результате разрежения нуклеоида отмечалось увеличение аирусных частиц и повреждение их оболочки. Затем обнаруживалось формирование вирусспецифических и виру-синдуцированных структур в цитоплазме, где осуществлялся синтез нуклеиновых и белковых компонентов ВКЭ. На поверхности виропластов выявлялось формирование новобразованных вирусных частиц. Помимо этого после инкубации в течение 24 ч в околоядерной зоне цитоплазмы обнаруживалось интенсивное формирование нуклеокапсидов ВКЭ, которые морфологически были связаны с полипротеиновыми нитями. Вероятно, последние являются белковыми компонентами суперкапсида ВКЭ. Мы не наблюдали гексагональных упаковок и цепочек новообразованных вирусных частиц, формирующихся при размножении флавивирусов в нейронах [23]. По-видимому, это связано со специфической принадлежностью макрофагов к фагоцитарной системе и обусловлено их морфологическим отличием от нейронов, а именно, меньшей площадью ядра и цитоплазмы, наличием менее развитой и четко структурированной эндоплазматической сети, а также меньшим количеством митохондрий.

На данный момент определено, что при инфицировании клеток крови пикорнавирусы дифференцируются по их способности использовать различные системы рецепторов, поэтому при исследовании патогенеза энтеровирус-ных инфекций необходимо учитывать, что инфицирование и размножение вирусов в моноцитах/макрофагах значительно зависит от степени их диффе-ренцировки. Так, если энтеровирусы ЕСН05 и 11 эффективно размножаются в этих клетках, а репродукция энтеровирусов ЕСН09 и Коксаки А9 отмечается в небольшом количестве, но все-таки поддерживается, то репродукция энтеровируса Коксаки В не установлена [207]. Указывается, что источником инфекции в организме могут стать и те макрофаги, которые являются непер-миссивной системой для полиовирусов, потому что с адсорбированным на мембране вирусом фагоциты могут приобретать способность инфицировать чувствительные к возбудителю клетки [56]. Так, инфицированные пикорна-вирусами на начальном этапе заболевания моноциты/макрофаги могут являться инициаторами иммунного ответа организма. Причем, необходимо отметить, что пикорнавирусы относятся к той группе вирусов, которая резистентна к действию макрофагов и способна к внутриклеточной репродукции в них, таким образом, преодолевая биологический барьер, препятствующий распространению возбудителя из первичного очага инфекции и защищающий от заражения высокочувствительные клетки центральной нервной системы и паренхиматозных органов.

Нами установлена способность всех использованных видов пикорнави-русов — полиовируса, энтеровирусов 71, ЕСНОП и Коксаки В1 проникать в макрофагальные клетки. При этом к одному из характерных признаков внедрения этой группы вирусов, не имеющих суперкапсид, относилось появление на поверхности макрофагов многочисленных разнообразных псевдоподий. Так, при заражении полиовирусом и энтеровирусом ECHO 11 в течение первого часа после внесения инфектов наблюдалось формирование нитевидных псевдоподий, при участии которых впоследствии образовывались эндо-цитарные вакуоли, содержащие вирусные частицы. Затем после 7−9 ч инкубации на периферии цитоплазмы из плазмалеммы клеток, зараженных этими вирусами, образовывались многослойные структуры, которые формировались в результате объединения многочисленных нитевидных псевдоподий.

Известно, что икосаэдрическая структура поверхности нуклеокапсида пикорнавирусов состоит из 60 эквивалентных субъединиц (граней), которые состоят из пяти протомеров (VP) и отличие использованных нами видов вирусов состоит только в рецепторах, посредством которых они присоединяются к определенным типам клеток. После присоединения пикорнавирусов, нуклеокапсидный белок VP4 отсоединяется от протомера и начинается процесс расщепления полипептида [100]. В процессе проникновения этих вирусов через мембрану клетки при участии различных вирусных репликаз инициируется освобождение РНК от нуклеокапсида, и эти вирусные ферменты принимают участие в процессах инвагинации и везикуляции мембран клеток-хозяев [421]. Эти участки мембран впоследствии функционируют как защитная окружающая среда для размножения PITK вирусов. Подобные изменения плазмалеммы были обнаружены нами при инфицировании макрофагов пикорнавирусами. Наряду с нитевидными псевдоподиями у фагоцитов, зараженных энтеровирусом ЕСНОП, наблюдались также клапановидные. Формирование такого типа псевдоподий на поздних сроках инфекции связано с экскрецией макрофагами во внеклеточное пространство биологически активных веществ. В случае заражения энтеровирусами 71 и Коксаки В1 возникновение на поверхности макрофагов псевдоподий, преимущественно округленной формы, обнаруживалось несколько позже — после 7 ч инкубации. Таким образом, установленное нами мембранотропное действие пикорнавирусов на макрофагальные клетки морфологически выражалось в образовании на их поверхности большого количества псевдоподий и последующей гипертрофии мембраносодержащих органелл.

Установлено, что в случае инфицирования пикорнавирусами — полиовирусом, энтеровирусами 71, Коксаки В1 и ECHO 11 — наблюдаются патологические изменения цитоплазмы макрофагов, которые связаны с характерными для вирусной инфекции признаками. Под воздействием пикорнавирусов, как и в макрофагах, инфицированных ВКЭ, обнаруживалось уплотнение ци~ тозоля вследствие появления в нем различных электронноплотных образований, свойственных для зернистой дистрофии. Подобная дистрофия цитоплазмы возникает в результате усиленного синтеза клеткой новых структур, таких как рибосомы, полирисомальные нити, микрофилламентов и другие органел-лы. Наибольшим воздействием, как активатор клеточного метаболизма, обладал вирус ECHO 11 и в этом случае, обнаруживались новообразованные вирусные частицы. Образование полноценных вирусных частиц в случае заражения клеток энтеровирусами Коксаки В1 и вирусом 71 не отмечалось. Возникновение зернистой дистрофии данных макрофагов, вероятно, происходило после освобождения в цитоплазме вирусной РНК от нуклеокапсида, в ответ на ее распознавание и трансляцию рибосомами клетки. В результате этого процесса образуется полипротеиновая молекула, которая может выявляться в цитоплазме клеток как отдельная структура и которая одинакова для всех вирусов этого семейства, из чего следует, что в их РНК содержится общий ген для ее образования [173]. Указывается, что синтез белковых компонентов вирусов начинается уже через 15 мин после заражения клетки. Микрофибриллы в макрофагах, зараженных пикорнавирусами, мы наблюдали после 5 ч инкубации. Исключение составил полиовирус, обладающий выраженным цитопа-тогенным действием на фагоциты. Полипептид пикорнавирусов включает участки, которые имеют протеолитическую активность с включенными в них цистеиновыми протеазами. Известны данные, что репликационный комплекс полиовируса отграничен специфическими мембранными везикулами от содержимого клетки-хозяина и образует высокоспецифичный структуры [454]. При заражении макрофагов полиовирусом мы не наблюдали формирования многочисленных везикул с электронноплотным компонентом, которые бы отражали наличие подобных структур. В отношении макрофагов, зараженных этим вирусом, нами была установлена острая литическая инфекция, приводящая к резкой деградации культуры. В этих клетках не наблюдалось морфологических признаков усиления синтетических процессов. Уже через 9 ч после инфицирования полиовирусом в результате деструктуризации органелл в клетках выявлялось просветление цитоплазмы. На денатурацию белковых компонентов цитоплазмы указывала ее глыбчатая ультраструктура, которая характеризовалась чередованием просветленных участков с электронноплот-ными. Подобного типа изменения наблюдались в большинстве фагоцитов, причем после 24 ч инкубации процесс деградации клеток усиливался и наблюдалась секверстрация измененных участков цитоплазмы макрофагов. Все эти признаки характеризует дегенеративный процесс.

Электронно-микроскопические исследования макрофагов, зараженных энтеровирусами 71, Коксаки В1 и ECHO 11, показали, что с течением времени наиболее выраженные деструктивные изменения наблюдаются в мембранных структурах. Помимо этого, в макрофагах отмечалось увеличение количества везикул разнообразной формы и величины, которые локализовались как внутри цитоплазмы, так и у плазмалеммы. Сохранившиеся канальцы и цистерны эндоплазматического ретикулами с течением времени расширялись. Наблюдались гипертрофированные митохондрии с просветленным матрик-сом, при этом в них отмечалось нарушение двухконтурности мембран и деформация крист. Основное скопление этих вирусов отмечалось в цитоплазматическом матриксе макрофагов. Подобные патологические изменения были описаны в макрофагах, инфицированных вирусом гриппа [48]. Другими исследователями [89] в ядре и цитоплазме макрофагов, зараженных этим же вирусом, были обнаружены «трубчатые включения», необычные для нормальной клетки. Появление подобных включений в цитоплазме сопровождалось локальной или обширной деструкцией ядерной мембраны макрофагов. Во всех случаях заражения макрофагов РНК-содержащими вирусами нами не было выявлено морфологических признаков активации клеточных ядер. Усиление синтетических процессов отмечалось только в цитоплазме клеток вне их ядер, что указывало на автономный тип вирусной инфекции макрофагов. Тем не менее, необходимо отметить, что в случае заражения макрофагов группой вирусов, содержащих суперкапсид (хантавирус и ВКЭ), отмечалось нарушение ядерной мембраны и формирование около ядра различных фибриллярных компонентов.

После появления РНК репликаз в клетках, инфицированных пикорна-вирусами, обнаруживается двухспиральная репликативная форма РНК (dsRNA), состоящая из так называемой «плюс» (вирусная РНК) и «минус» (синтезированная, дочерняя РНК) спиралей РНК. На этой РНК происходит синтез следующих дочерних вирусных РНК, судьба которых после завершения синтеза может отличаться. Так, часть из них принимает участие в образовании новых репликативных форм, другие выполняют функции информативной РНК, кодируя синтез вирусных белков, а третьи уже входят в состав новообразованных вирусных частиц. Морфологически двухспиральная репликативная форма РНК выявляется в виде вирусспецифических структур. При выделении репликативного комплекса полиовирусов было определено, что он представляет собой везикулы розетковидной формы гетерогенного размера, состоящие из РНК и вирусных неструктурных белков [92]. Также обнаружено, что в образовании репликативного комплекса этих вирусов принимают участие белковые компоненты мембран шероховатой эндоплазматической сети и аппарата Гольджи инфицированных клеток [140, 495, 273]. Подобные свойства были выявлены и для членов семейства Picornaviridae, а именно для энтеровирусов [156]. При инфицирования макрофагов энтеровирусами 71, ECHO 11 и Коксаки В1 в их цитоплазме отмечалось формирование разнообразных вирусспецифических структур — виропластов, полирибосомальных нитей и микрофиламентов. На наш взгляд, образование виропластов, которое отмечалось несколько позже, чем формирование полирисомальных нитей и микрофиламентов, указывало на цитозольную локализацию двухспиральных репликативных форм пикорнавирусных РНК. При этом необходимо отметить, что несмотря на отмеченное присутствие РНК-содержащих вирусов в цистернах эндоплазматической сети, ни в одном случае нами не было обнаружено вирионов с измененной морфологией. Преимущественно вирусные частицы локализовались в цитоплазме клеток, со временем перемещаясь в околоядерную зону, где и обнаруживались формирование вирусиндуцированных структур.

Этап синтеза вирусных белков происходит подобно закономерностям синтеза белков клетки. В этом случае синтез запускается после того, как вирусная РНК соединилась с рибосомами, и начинается трансляция закодированной в ней информации. Результатом этого процесса является образование полисом, которые могут быть неодинаковыми по величине. Известно, что геном полиовируса транслируется непрерывно от единой начальной точки до единой терминальной точки, образуя длинную единую полипептидную цепь [405]. В ее состав входят все белки, впоследствии выявляемые в зрелом ви-рионе. Последующее образование белков происходит путем фрагментации большой полипептидной цепи с помощью цитоплазматических протеаз. Одновременно образуются неструктурные белки, не входящие в состав вирионов, но необходимые для формирования полноценных вирусов [173]. При инфицировании макрофагов энтеровирусами 71, Коксаки В1 и ECHO 11 наиболее интенсивное образование полирибонуклеиновых нитей и скоплений рибосом около виропластов отмечалось через 9 ч инкубации, и в этих зонах обнаруживалось формирование вирионов.

Защитная реакция макрофагов, инфицированных использованными РНК-содержащими вирусами, выражалась в виде формирования в их цитоплазме фагосомоподобных везикул, которые можно отнести к аутофагирую-щим структурам, образующимся в результате синтеза мембран de novo вокруг поврежденного участка цитоплазмы клетки. С течением времени в макрофагах выявлялись огромные фагосомовидные вакуоли, включающие вирусные частицы, и обнаруживалось слияние мембраносодержащих органелл клетки. Подобные патологические изменения были описаны в клетках перевиваемых культур, зараженных полиовирусом [457], а также указывалась стимуляция фаголизосомной активности клеток, зараженных вирусом полиомы [104]. Этот вирус локализовался в гигантских фагосомах, которые были покрыты многослойными мембранами. Эти структуры были соединены с мембранами (при энтеровирусной инфекции), либо находится в свободном состоянии в цитоплазме клетки около виропластов в виде линейных структур (например, при инфекции, вызванной вирусом оспы) [67].

Выход РНК-содержащих вирусов, в отношении которых была установлена внутриклеточная репродукция и образование вирионов, а именно, хантавируса и ВКЭ, осуществлялся подобно входу — путем локального лизиса их плазмалеммы. Подобный способ выхода их макрофагальных клеток был описан для вирусов гриппа и Марбург (Иржанов, 1977, Скрипченко, 1997). Свойство этой группы вирусов, содержащих суперкапсид, осуществлять вход и выход из клетки-мишени, не разрушая ее плазмалеммы, определяет их способность к длительной репродукции в макрофагах без цитопатического эффекта. Относительно энтеровируса ЕСНОП, принадлежащего к вирусам без липопротеииовой оболочки, нами было установлено, что он покидал клетку с помощью 2-х механизмов, а именно, с помощью локального лизиса плазмалеммы или путем клаз-матоза, что разрушало целостность плазмалеммы клетки. Для этой группы вирусов характерно высвобождение популяции при массивном повреждении клеточной мембраны с последующим лизисом клетки [457], что и наблюдалось нами в поздние сроки наблюдения (2-е сут) макрофагальных клеток, инфицированных энтеровирусом ECHO 11.

Таким образом, в случае заражения фагоцитов группой вирусов, содержащих суперкапсид, и энтеровирусом ECHO 11 выявлена продуктивная инфекция, поскольку в этих случаях образуется морфологически выявляемый полноценный вирус. При инфицировании макрофагов энтеровирусами 71 и Коксаки В1 установлена абортивная инфекция, для которой характерно изменение метаболизма клетки в результате появления в ее цитоплазме вирусспе-цифических и вирусиндуцированных образований, а также различных патологических внутриклеточных изменений, но не наблюдается формирования полных вирионов.

Итак, на наш взгляд, исследование ультраструктурной организации процесса внутриклеточного размножения вирусов необходимо проводить с позиций анализа механизмов, лежащих в основе изменения структуры и функции клетки. Несмотря на то, что подобное исследование макрофагальных клеток, зараженных различными вирусами, позволило бы более полно оценить степень участия этих клеток в патологическом процессе, на настоящий момент этому вопросу уделяется незаслуженно мало внимания. Известно небольшое количество работ по исследованию ультраструктурных изменений макрофагов при вирусных инфекциях. Тем не менее, раскрытие механизмов проникновения и репродукции РНК-содержащих вирусов на модели их взаимоотношений с макрофагами, которые филогенетически относятся к наиболее древней фагоцитарной системе иммунитета, позволит раскрыть некоторые свойства вирусов как паразитов, приобретенные ими в ходе эволюционного развития. Так, с помощью комплекса цитоморфологических и ультраструктурных методов, нами установлено, что РНК-содержащие вирусы способны проникать в макрофаги и воздействовать на их метаболизм. Способы входа вирусов в клетку не зависят от наличия в их структуре липопротеиновой оболочки, тогда как в зависимости от вида эти вирусы в различной степени способны активировать или ингибировать синтетические процессы в клетках-хозяевах.

Отличие использованных нами видов вирусов с наличием суперкапсида — хантавируса и ВКЭ, помимо геномной последовательности, обусловлено различной структурой нуклеокапсида — спиральной и икосаэдрической, различной полярностью РНК — отрицательной или положительной, а также структурой поверхности их суперкапсида. Гликопротеины у хантавируса сформированы в виде решетки, а у ВКЭ в виде шипов длиной 10 нм. По нашим данным, несмотря на все перечисленные отличия указанных вирусов, они оказывали равное по степени выраженности воздействие на метаболизм макрофагов как клеток-мишеней. Тем не менее, необходимо отметить, что в зависимости от наличия липопротеиновой оболочки определялось воздействие вирусов на различные ферментативные системы макрофагов. Так, установлено, что активность цитоплазматических ферментов, участвующих в процессах расщепления макромолекул — кислой фосфатазы и неспецифической эстеразы — зависела от вида вируса, которыми были инфицированы макрофаги. В макрофагах, зараженных вирусами, содержащими суперкапсид (ВКЭ, хантавирус), увеличивалась активность кислой фосфатазы, тогда как при инфицировании клеток группой вирусов без липопротеиновой оболочки (полиовирус и энтеровирусы 71, ЕСНОП и Коксаки В1) — неспецифической эстеразы. Также специфической особенностью хантавирусов, имеющих в составе своего генома РНК отрицательной полярности, является их способность вызывать образование в цитоплазме резидентных макрофагов виру-синдуцированных структур, морфологически отличающихся от структур, сформированных в результате репродуктивной активности вирусов с РНК положительной полярности (ВКЭ, энтеровирусы). Выход новообразованных вирусов во внеклеточное пространство происходил на 1-е сутки после заражения, и экспрессия метаболических процессов, связанная с репродукцией вирусных компонентов в клетках, была одинаково выражена, что было подтверждено нами путем использования биохимических методов.

В случае инфицирования клеток вирусами, не имеющими липопротеи-новой оболочки — полиовирусом, энтеровирусами Коксаки 71, В1 и ECHO 11 нами были получены иные данные. Хотя отличие этих видов вирусов состоит только в рецепторах, посредством которых они присоединяются к определенным типам клеток, тем не менее, наши исследования показали, что в начальном этапе инфицирования макрофага энтеровирусами 71 и Коксаки В1 эта клетка не активна, так как не было обнаружено признаков ее поглотительной активности в виде образования на ее поверхности псевдоподий. Эти вирусы проникали в макрофаги физиологическим путем, а именно, с помощью кавеол, которые выявляются в незараженных клетках — эндотелиоцитах, гистиоцитах и др., в том числе моноцитах/макрофагах. Эти структуры клетки используют для поглощения внеклеточно расположенных питательных веществ. Напротив, в ответ на присутствие полиовируса происходила активация макрофагов, так как этот вирус они поглощали с помощью макропиноцитоза. Причем, полиовирус обладал выраженным цптопатогенным действием, ингибируя метаболизм клеток, тогда как остальные использованные энтеровирусы, напротив, в различной степени активизировали синтетические процессы.

В целом, анализ полученных нами данных показал, что комплексное исследование взаимодействия макрофагов с РНК-содержащими вирусами, особенно с позиций их структурных отличий, позволит подойти к пониманию контролируемой коррекции молекулярных и метаболических процессов, происходящих в клетках-хозяевах. Этот вывод усиливается известным фактом, что успешный исход вирусного заболевания происходит при достижении баланса между индукцией антивирусных эффекторных механизмов, реализация которых связана с клеточными элементами моноцитарно/макрофагальной системы, и исключением повреждений различных тканей организма. На данный момент определено, что чувствительность моноцитов/макрофагов к вторжению инфекта зависит от платоподобного — рецептора—TLR, а их стимуляция или ингибиция осуществляется через Jan-Stat механизм (киназный сигнальный преобразователь — Janus и активатор транскрипции — Stat). К одному из сигналов контроля течения вирусных инфекций относят интерферон гамма, синтез которого также зависит от функционального сигнала трапсдукции — Statl, тогда как сигнал Stat3 активизируется рядом цитокинов, включающих ИЛ-10, ИЛ-6 и ИЛ-27. Недавно было доказано, что регуляция продукции макрофагами цитокинов осуществляется подобной SW-активацией их рецепторов или сигнальных компонентов, и это определяет важность данного механизма в контроле над вирусной инфекцией. Таким образом, с помощью современных методов возможно определение подходов к раскрытию молеку-лярно-генетических механизмов активизации и депрессии клеток моноцитар-но-макрофагальной системы. Это сделает вероятным в ближайшем будущем идентифицировать и охарактеризовать целевые гены и молекулярные посредники, которые могут ингибировать разрушение этих фагоцитов вирусами и внутриклеточными патогенами, что позволит контролировать разрушение тканей, а в конечном итоге и развитие иммунного ответа при вирусных инфекциях. Так, наряду с выявленным противовирусным действием моноцитов/макрофагов, характеризующемся поглощением, обезвреживанием, перевариванием и элиминированием вируса, эти клетки также могут являться мишенями для его размножения, в результате чего их функции дополняются новыми, что в свою очередь может оказывать влияние на первичный и адаптивный иммунный ответ организма.

Таким образом, для понимания механизмов иммунологических реакций организма и их роли в патогенезе вирусных инфекций необходима объективная оценка роли местных факторов иммунитета, где ключевыми являются клетки моноцитарно-макрофагальной системы. Значение этих клеток многогранно и, наряду с тем, что фагоциты могут осуществлять положительный противовирусный эффект путем поглощения, обезвреживания, элиминации вирусов, а также фагоцитоза инфицированных вирусами клеток, в результате чего происходит активизация клеток и они начинают продуцировать в месте заражения цитокины, макрофаги могут обладать и отрицательным действием. При первичном иммунном ответе оно выражается в том, что фагоцитированные вирусы могут репродуцироваться в макрофагах и разноситься по организму. В результате этого возникает депрессия функциональной активности клеток, причем такие фагоциты могут уничтожать здоровые клетки в месте воспаления, когда продуцируемые ими активные радикалы кислорода и N0, помимо противовирусного действия, инициируют процесс апоптоза клеток и увеличивают проницаемость капилляров. В этом случае, моноциты/макрофаги при вирусном инфицировании организма не всегда проявляют себя в качестве защитного барьера. Тем не менее, активация этих клеток при репродукции в них вируса позволяет им осуществить антигенпредставляю-щую функцию для стимуляции Ви Т-лимфоцитов и активации цитотоксиче-ских Т-лимфоцитов для уничтожения инфицированных клеток при развитии специфического иммунного ответа.