Экспериментальное изучение фармакокинетики и биотрансформации нового дипептидного ноотропа ноопепта

Разнообразие и часто уникальность фармакологических эффектов эндогенных пептидов и их синтетических аналогов в сочетании с высокой активностью делают эти соединения перспективными в качестве потенциальных фармакологических средств. Современные достижения в создании лекарственных форм пептидов, позволившие в значительной степени преодолеть такие негативные характеристики этих соединений, как низкую устойчивость к протеолитическим ферментам, плохую всасываемость и низкую проницаемость через различные барьеры организма, в соединении с улучшенными методами производства привели к возрождению интереса фармацевтической промышленности к пептидным соединениям [1].

На сегодняшний день фармацевтический рынок пептидов насчитывает свыше 40 препаратов различных фармакологических групп, вакцин и диагностических продуктов [1]. Среди наиболее коммерчески успешных препаратов пептидной структуры, выпускаемых за рубежом, следует отметить аналоги люлиберина леупролид (leuprolide (Lupron®)) и госерелин (goserelin (Zoladex®)), ингибитор ангиотензин-конвертирующего фермента лизиноприл (lisinopril (Zestril® и Prinivil®)). В нашей стране также был создан ряд препаратов пептидной структуры. Это созданный в ВКНЦ АМН СССР под руководством академика Е. И. Чазова структурный аналог Leu-энкефалина противоязвенный препарат даларгин, разработанный под руководством академика И. П. Ашмарина на основе фрагмента АКТГ4.10 ноотропный препарат семакс и созданный под руководством академика В. И. Покровского на основе тимопоэтина иммуномодулятор имунофан.

Лекарственные средства пептидной природы интересны в качестве потенциальных ноотропов, поскольку в регуляции когнитивных функций основную роль играют нейропептиды [2]. В связи с большим количеством состояний, сопровождающихся нарушениями когнитивных функций таких как травма мозга, инсульты, хроническая церебро-васкулярная недостаточность и т. п., представляется необходимым разработка и внедрение в клиническую практику новых ноотропных препаратов пептидной структуры, поскольку в большинстве случаев пептидные препараты более эффективны, чем препараты из других химических групп [3].

Несмотря на значительный прогресс в создании лекарственных форм пептидных соединений, поиск пептидов, сохраняющих активность после приема внутрь, остается актуальным, поскольку именно этот путь введения предпочтителен при коррекции многих когнитивных нарушений, требующих проведения длительной терапии.

В ГУ НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН в результате целенаправленного создания лекарственных средств дипептидной природы на основе структуры известных непептидных препаратов [4], был создан оригинальный дипептид ноопепт, который имеет ноотропную активность, качественно и количественно превышающую активность классического ноотропа пирацетама [5], и при этом сохраняющий активность после приема внутрь [6].

Общеизвестно, что экспериментальное изучение фармакокинетики позволяет выявить закономерности концентрационных изменений лекарственного вещества в организме. Знание этих закономерностей способствует пониманию процессов всасывания, распределения и элиминации лекарственных средств, выяснению фармакокинетической составляющей биологической активности, идентификации и оценки основных метаболитов, выбору оптимальной лекарственной формы и пути введения. В конечном счете, изучение экспериментальной фармакокинетики направлено на решение главной задачи доклинических испытаний, заключающейся в обеспечении безопасного и эффективного использования лекарственных препаратов в клинике [7].

Актуальность темы

.

Актуальность исследования определяется тем, что доклиническое щ изучение фармакокинетики и путей биотрансформации ноопепта является необходимым этапом на пути внедрения этого оригинального препарата в клиническую практику.

Целью настоящего исследования является изучение фармакокинетики и биотрансформации ноопепта в эксперименте на двух видах животных. Задачи исследования.

1. Разработать методики качественного и количественного анализа ноопепта и его предполагаемых метаболитов в биологическом материале.

2. Изучить фармакокинетику ноопепта после внутривенного и орального введения у крыс и кроликов.

3. Установить пути биотрансформации ноопепта после его внутривенного введения у крыс.

4. Оценить способность ноопепта проникать через гематоэнцефалический барьер.

5. Изучить фармакокинетику и определить относительную биологическую доступность таблетированной лекарственной формы ноопепта у кроликов.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Установлены два параллельных пути биотрансформации ноопепта: путь с расщеплением пептидной связи и путь с дезацилированием, в результате которых образуются: N-фенилацетилпролин, фенилуксусная кислота и циклопролилглицин.

2. Абсолютная биологическая доступность составляет у крыс около 7%, а у кроликов в среднем 10%.

3. Ноопепт проникает через гематоэнцефалический барьер и его концентрация в мозге выше, чем в плазме. Тканевая доступность ноопепта для мозга составила 161% .

4. Выявлены различия во времени всасывании ноопепта в системный кровоток после введения кроликам таблеток и вводимой внутрь субстанцией. Вспомогательные вещества, входящие в таблетированную лекарственную форму, не влияют на скорость и степень всасывания ноопепта. Относительная биологическая доступность таблеток ноопепта составила в среднем 99.7%.

Научная новизна работы.

В настоящем исследовании впервые изучено фармакокинетическое поведение и основные пути биотрансформации ноопепта у крыс и кроликов при разных путях введения субстанции и после введения таблеток ноопепта у кроликов. Показано, что при внутривенном пути введения неизмененный ноопепт регистрируется в плазме крови крыс в течение 25 мин и за это время происходит его биотрансформация с образованием трех метаболитов — N-фенилацетилпролина, фенилуксусной кислоты и циклопролилглицина. Выявлено, что процесс элиминации ноопепта у кроликов протекает менее интенсивно, что обуславливает его более длительную циркуляцию в плазме крови у этого вида животных. Показано, что ноопепт способен проникать через гематоэнцефалический барьер и его количественное содержание в мозге превышает его содержание в плазме крови. Установлено, что в мозге, помимо ноопепта, регистрируются два его метаболита — фенилуксусная кислота и циклопролилглицин. Эти метаболиты являются идентичными соответствующим эндогенным соединениям, причем идентификация циклопролилглицина в качестве эндогенного соединения проведена впервые. Показано на двух видах животных, что ноопепт после введения внутрь подвергается «эффекту первого прохождения». Впервые проведена оценка относительной биологической доступности таблеток ноопепта у кроликов.

Практическая значимость работы.

Данные о фармакокинетике и биотрансформации ноопепта вошли в материалы, представленные в Фармакологический комитет РФ для получения разрешения на клинические испытания таблеток ноопепта. Данные настоящего исследования могут быть полезными при разработке новых лекарственных форм ноопепта.

Связь темы диссертации с планом научно-исследовательских работ ГУ НИИ фармакологии РАМН.

Диссертация выполнена в соответствии с плановой темой НИР НИИ фармакологии РАМН «Изучение молекулярных и клеточных механизмов эндои экзогенной регуляции функций ЦНС, создание нейрохимических основ для разработки новых оригинальных нейротропных средств» и с подпрограммой «Создание лекарственных средств методами химического и биологического синтеза» ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» .

Апробация работы.

Основные результаты работы доложены на VIII Российском национальном конгрессе «Человек и Лекарство», а также на 3-й Международной Конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» .

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 136 страницах и иллюстрированы 20 таблицами и 14 рисунками. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, заключения и выводов. Библиография представлена 25 отечественными и 130 зарубежными работами.

ВЫВОДЫ.

1. Разработана методика количественного определения ноопепта и его основных метаболитов в биологическом материале с использованием ВЭЖХ.

2. Установлены два параллельных пути биотрансформации ноопепта в плазме крови: первый — расщепление пептидной связи с образованием N-фенилацетилпролина, второй — дезацилирование с образованием фенилуксусной кислоты и циклопролилглицина, совпадающих с соответствующими эндогенными соединениями. В мозге обнаружены метаболиты, образующиеся только по второму пути.

3. Период полувыведения ноопепта после его внутривенного введения в 2−3 раза продолжительнее периода полувыведения незамещенных дии трипептидов.

4. После введения ноопепта внутрь препарат быстро всасывается и поступает в системный кровотокпри этом его абсолютная биодоступность составляет более 7%.

5. Ноопепт проникает через гематоэнцефалический барьер и его концентрация в мозге крыс, начиная с 10-минутного интервала после внутривенного введения значительно превышает его уровень в плазме.

6. Разработанная в ГУ НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН таблетированная лекарственная форма ноопепта обладает высокой относительной биодоступностью и рекомендована для клинических исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Известно, что интенсивность фармакологического эффекта зависит от фармакодинамических и фармакокинетических характеристик лекарственного средства. Другими словами, фармакокинетические свойства лекарственного средства, характеризующие процессы его всасывания, распределения и элиминации являются необходимыми факторами биологической активности. С этой точки зрения представляется важным, во-первых, выяснение взаимосвязи концентрации лекарственного средства, регистрируемого в изучаемом биоматериале, с выраженностью фармакологического эффекта, и, во-вторых, выявления таких фармакокинетических характеристик лекарственного средства, которые являлись бы определяющими в реализации активности.

Принимая во внимание выраженную зависимость эффекта ноопепта от дозы [5, 6, 147], можно предположить, что определяющим фармакокинетическим фактором, обусловливающим реализацию эффекта этого ноотропа будет площадь под фармакокинетической кривой или значение максимальной концентрации. Вместе с тем, интенсивная элиминация ноопепта предопределяет его низкий концентрационный уровень в плазме крови, следствием чего явилась необходимость использовать в фармакокинетическом исследовании дозы, значительно превышающие эффективные. В связи с этим представляется затруднительным оценка минимально эффективной площади под фармакокинетической кривой, то есть такой величины AUC, которая была бы способна реализовать фармакологический эффект.

Во многих случаях, интенсивный метаболизм лекарственного средства приводит к снижению фармакологической активности или к её видоизменению. Для ноопепта следствием быстрого исчезновения из организма является расхождение во времени детектирования его в плазме крови или ткани мозга со временем регистрации ноотропной активности, то есть оцениваемые ноотропные эффекты ноопепта наблюдались уже после окончания циркуляции данного дипептида в организме. Несопоставимость во времени проявления эффекта, и профиля концентрационной кривой лекарственного средства в организме обычно подразумевает отсутствие корреляционной зависимости между эффектом и концентрацией. В этом случае, наиболее вероятными механизмами реализации эффекта представляется либо действие, опосредованное активными метаболитами, либо «запуск» ноопептом эндогенных механизмов, формирующих эффект. Если ноопепт является пролекарством, то предполагаемый активный метаболит должен, во-первых, проникать через гематоэнцефалический барьер после его введения, во-вторых, биологическая активность этого метаболита должны быть полностью сопоставима с фармакологическими эффектами исходного соединения.

Следовательно, для ответа на вышепоставленный вопрос необходимо сравнить биологическую активность метаболитов, способных к проникновению через гематоэнцефалический барьер, с фармакологическим эффектом исходного соединения.

В настоящем исследовании было установлено, что после внутривенного введения ноопепта в мозге определяются два метаболита — фенилуксусная кислота и циклопролилглицин.

По литературным данным, фенилуксусная кислота присутствует в организме человека и животных в мозге [146], в цереброспинальной жидкости [148], в плазме крови [149] и в моче [150]. Согласно результатам исследований последних лет, фенилуксусная кислота имеет высокую степень проникновения через гематоэнцефалический барьер, причем ее концентрация в мозге крыс регулируется не только за счет образования конъюгатов, но также и за счет транспорта из мозга [146]. В плазме крови крыс 90% от всего содержания фенилуксусной кислоты находится в связанном состоянии в виде конъюгата с глютатионом, и только 10% определяется в свободном виде [146].

Большое количество зарубежных публикаций, посвященных биологической активности фенилуксусной кислоты обусловлено её способностью подавлять рост опухолевых клеток различного происхождения без проявления общей токсичности [151]. Цитотоксическое действие фенилуксусной кислоты связано с подавлением генной экспрессии злокачественных клеток, причем независимо от фазы их клеточного цикла [152]. К настоящему времени, в США проходят клинические испытания этой кислоты в качестве противоопухолевого средства, используемого для лечения рака мозга и предстательной железы. Сообщалось [153] об изучении фармакокинетики фенилуксусной кислоты после внутривенного введения онкологическим пациентам. Было установлено, что фармакокинетика фенилуксусной кислоты имеет нелинейный характер, и что интенсивная элиминация является результатом быстрого образования конъюгата фенилуксусной кислоты, в виде которого она экскретируется с мочой в количестве 99% от введенной дозы.

Вместе с тем, в доступной автору литературе, посвященной и эндогенной, и изучаемой после введения в условиях эксперимента и клиники фенилуксусной кислоты, отсутствуют сведения о ноотропной активности этого соединения.

Другим метаболитом, обнаруживаемым в ткани мозга крыс после введения ноопепта, является циклопролилглицин. Как и в случае с фенилуксусной кислотой, данный метаболит детектировался в биологических образцах опытных и контрольных животных. Это обстоятельство послужило основанием для предположения об эндогенной природе данного циклодипептида, что впоследствии и было подтверждено различными инструментальными методами. Всесторонний фармакологический анализ циклопролилглицина, выполненный в лаборатории психофармакологии ГУ НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН свидетельствует, во-первых, что циклопролилглицин имеет выраженную антиамнестическую активность, регистрируемую после внутрибрюшинного введения в дозах, сопоставимых с активными дозами ноопепта (0.1 — 1.0 мг/кг) — во-вторых, что он обладает и значительной мнестической активностью [154]. Таким образом, циклопролилглицин, как и исходное соединение, обладает выраженным ноотропным эффектом. Однако при дальнейшем [147] изучении фармакологии циклопролилглицина, были отмечены различия во влияниях этого эндогенного циклодипептида и ноопепта на фазы памяти. В отличие от ноопепта, который способен облегчать все фазы памяти, включающие ввод информации, её консолидацию и извлечение, циклопролилглицин оказывает влияние только на начальные фазы. При этом, в отличие от ноопепта, влияние циклопролилглицина на извлечение информации напротив имеет тенденцию к торможению воспроизведения памятного следа [147].

Из приведенных данных следует, что ноотропный эффект ноопепта качественно отличается от сопоставляемого эффекта циклопролилглицина, и, следовательно, можно утверждать, что ноопепт не является пролекарством, хотя и возможен вклад этого метаболита в ноотропную активность ноопепта.

Другая возможность реализации эффекта ноопепта, отсроченного от времени его циркуляции в организме, может осуществляться по принципу «появился и исчез». Предполагается, что определенное количество ноопепта достигая клетку-мишень «запускает» эндогенные процессы, влияющие на формирование механизмов памяти. С фармакокинетической точки зрения, возможность реализация такого эффекта будет зависеть от минимального значения параметров Со или Стах (в зависимости от способа введения), которое бы обеспечило нахождение ноопепта в месте непосредственного приложения в количестве, достаточным для такого «запуска». Не рассматривая проблемы механизмов клеточного действия ноопепта на формирование памяти, можно предположить, что такой процесс, связанный с функциональными изменениями, будет продолжителен по времени и, следовательно, нахождение ноопепта в плазме крови и его действие будут разобщены во времени.

С предположениями, высказанными выше, согласуются данные о сохранении активности ноопепта после орального введения [6]. Во-первых, обычно пролекарство характеризуется изменением фармакологической активности после орального введения, что не наблюдалось у ноопепта, во-вторых, низкое значение биодоступности ноопепта при условии зависимости концентрации от эффекта предполагала бы отсутствие последнего.

В настоящее время предлагается [155] биофармацевтическая классификация лекарственных средств согласно их растворимости в воде и способности к проницаемости через биологические мембраны. Предполагается, что лекарственные средства, сгруппированные в один из 4 возможных классов по принципу отношения к вышеуказанным признакам, будут иметь сходное поведение при оценки биодоступности. Согласно этой классификации, ноопепт относится к группе И, в которую выделены лекарственные средства по таким признакам как низкая растворимость в воде и высокая проницаемость через биологические мембраны. Считается, что для этой группы фактором, ограничивающим биодоступность может выступать растворимость лекарственного средства в условиях in vivo, в связи с чем рекомендуется проводить тщательное изучение растворимости при физиологических значениях рН, в различных средах и по разным методикам.

По-видимому, растворимость ноопепта в условиях in vivo, не является причиной его низкой биодоступности (см. 3.4.4.). Можно утверждать, что низкая биодоступность ноопепта является результатом незначительной степени его всасывания в системный кровоток из-за интенсивной пресистемной биотрансформации, протекающей в кишечнике. А это означает возможность увеличения биодоступности с помощью биофармацевтических подходов без химической модификации исходного соединения.

Одной из задач настоящего исследования являлась оценка относительной биодоступности разработанной в опытно-технологическом отделе ГУ НИИ фармакологии им. В. В. Закусова РАМН лекарственной формы ноопепта — таблеток. В результате фармакокинетического изучения установлено, что таблетированная лекарственная форма ноопепта соответствуют по скорости всасывания из ЖКТ, и по степени достижения системного кровотока вводимому внутрь водному раствору ноопепта. Из этого следует, что вспомогательные вещества, входящие в таблетированную лекарственную форму, индифферентны в фармакокинетическом отношении.

Можно отметить, что с помощью использования вспомогательных веществ, возможно значительно снизить потери лекарственного вещества в желудочно-кишечном тракте. Поскольку, как указывалось выше, низкая биодоступность ноопепта является следствием именно биотрансформации, то в роли таких вспомогательных веществ должны выступать ингибиторы ферментов. В биофармацевтической практике в этом качестве, например, рассматривают: бестатин (bestatin) — пепстатин (pepstatin) — арфанамин (arphanamine) и ряд других специфических ингибиторов [10].

Возможно использование и других биофармацевтических подходов, реализуемых в настоящее время при создании препаратов на основе пептидов. Эти подходы позволяют преодолевать такие негативные характеристики этих соединений, как низкую устойчивость к протеолитическим ферментам, плохую всасываемость и их низкую проницаемость через различные барьеры организма включая слизистые оболочки. Наиболее успешной лекарственных формой для пептидов следует признать терапевтические системы с длительным высвобождением действующего начала, в частности, такой подход был реализован при создании нафарелина (nafarelin) и золадекса (zoladex) [1].

В заключение можно отметить, что современные достижения в области создания и производства пептидов обеспечили бурный рост количества препаратов этой группы в последние пять лет, и, возможно с началом использования проекта «геном человека» в терапии, пептидные соединения станут наиболее жизнеспособными кандидатам в фармакологические вещества.