Факторы, определяющие динамику вызванной секреции медиатора в ходе длительной высокочастотной активности нервно-мышечного синапса лягушки

1.1. Актуальность исследования.

Основной формой функционирования нервно-мышечного синапса является проведение не одиночных, а достаточно высокочастотных серий импульсов. В естественных условиях частота импульсации мотонейрона может достигать нескольких десятков импульсов в секунду [20,88]. Такая высокочастотная активность сопровождается изменениями амплитуды постсинаптического ответа, которая напрямую связана с количеством выбрасываемого медиатора. Вызванная секреция медиатора в нервно-мышечном синапсе при высокочастотной активности нейрона может меняться как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения. Изменения вызванной секреции носят название синаптической пластичности. Выраженность и кинетика синаптической пластичности определяется не только исходной величиной секреции, но и частотой импульсации мотонейрона [142]. Увеличение вызванной секреции медиатора в нервно-мышечном синапсе при высокочастотной стимуляции наиболее ярко проявляется в условиях пониженной концентрации ионов кальция и повышенной концентрации магния. Однако, исследования вызванной секреции в ходе длительной высокочастотной активности нервно-мышечного синапса до сих пор не проводились. Обычно, для исследования синаптической пластичности в нервно-мышечном препарате используются одиночные, парные, либо кратковременные высокочастотные пачки импульсов: [178]. Согласно современным представлениям, медиатор выделяется квантами, находящимися в пузырьках — везикулах, расположенных в активных зонах двигательного нервного окончания (НО) [13,82], где располагаются специальные кальций-чувствительные белки экзоцитоза, кальциевые и кальций-активируемые калиевые каналы. В настоящее время признано, что ключевую роль в усилении секреции •-. ,. п медиатора при высокочастотной активности играет увеличение внутриклеточной концентрации ионов кальция [140]. Считается, что в ходе высокочастотной стимуляции нерва ионы кальция не успевают полностью утилизироваться внутриклеточными кальциевыми буферными системами, в то время, как в ответ на последующий стимул входит новая порция кальция, что и приводит к постепенному увеличению концентрации ионов кальция в нервном окончании (гипотеза «остаточного» кальция). Однако не исключаются и другие механизмы. Высказываются предположения, что в усиление секреции медиатора могут вовлекаться системы внутриклеточных мессенджеров, G-белок связанные кальциевые каналы, внутриклеточные кальциевые депо и изменения потенциала действия в ходе ритмической активности двигательного нейрона [22,129]. Считается, что эндоплазматический ретикулум может влиять на концентрацию ионов кальция в цитозоле нервного окончания [1,118,44]. В этом случае выброс ионов кальция происходит через лиганд-активируемые кальциевые каналы (рианодиновые рецепторы). Кроме этого, появляются данные о присутствии и инозитол-3-фосфатных рецепторов на мембране эндоплазматического ретикулума двигательного нервного окончания [38,44]. Не исключается тот факт, что митохондрии тоже могут принимать участие в изменении внутриклеточной концентрации ионов кальция в ходе ритмической активности нейрона [136,172,177]. Снижение вызванной секреции медиатора в ходе ритмической активности, по современным представлениям, объясняется интенсивной тратой медиатора и опустошением везикулярного пула в нервной терминали [178].

Раскрытие механизмов, лежащих в основе синаптической пластичности и процессов, позволяющих ее регулировать, необходимо для углубления знаний о механизмах передачи информации между возбудимыми клетками, что позволит подойти ближе к решению вопроса о функционировании нервной системы в целом. Поэтому решение вопросов связанных с механизмами синаптической пластичности в процессе длительной ритмической активности является актуальной проблемой нейрофизиологии на сегодняшний день.

6. Выводы.

1. В ходе высокочастотной ритмической активности нервно-мышечного синапса с частотой стимуляции 10 имп/с (10 мин) наблюдается прогрессивное увеличение вызванной секреции медиатора, которое к концу стимуляции достигает 322%±16% по сравнению с первоначальным уровнем вызванной секреции. Повышение частоты раздражения двигательного нервного окончания лягушки до 50 имп/с (5 мин) сопровождается двухфазным изменением вызванной секреции — первоначальным ростом до 429%±65%, который на 2 мин стимуляции сменялся депрессией секреции.

2. Длительная высокочастотная стимуляция нервно-мышечного препарата приводит к изменению электрического ответа нервного окончания лягушки. При частоте стимуляции 10 имп/с (10 мин) наблюдается значительное снижения амплитуд второй и третьей фаз ответа, НО и расширение второй фазы ответа НО. При частоте стимуляции 50 имп/с изменения ответа, НО становятся более выраженные.

3. Моделирование ионных токов двигательного нервного окончания лягушки показало, что в процессе длительной ритмической активности нервно-мышечного препарата происходящие изменение ответа НО, связаны с частотозависимым уменьшением потенциалзависимых натриевых и калиевых проводимостей.

4. Расчеты натриевой и калиевой проводимостей на модели ионных токов двигательного нервного окончания лягушки показали, что уменьшение ионных токов в процессе длительной высокочастотной активности нервно-мышечного синапса связано с уменьшением ионной проводимости потенциал-зависимых калиевых и натриевых каналов, происходящей с разной скоростью. Снижение проводимости калиевых каналов происходит с х = 680 с и натриевых с т = 1460 с при частоте стимуляции 10 имп/с, а при увеличении частоты стимуляции нервно-мышечного синапса до 50 имп/с снижение проводимости калиевых каналов и натриевых каналов происходит с т=159 и т=240 соответственно.

5. Моделирование ионных токов нервного окончания лягушки показало, что в процессе длительной ритмической активности двигательного нерва происходящее уменьшение калиевой и натриевой проводимостей приводит к увеличению кальциевого тока при частоте стимуляции двигательного нервного окончания 10 имп/с, а при увеличении частоты ритмических раздражений до 50 имп/с динамика кальциевого тока имеет двухфазную форму — первоначальный рост, сменяющимся затем уменьшением.

6. Использование ибериотоксина как антагониста кальций-активируемых калиевых каналов ведет к более быстрому уменьшению амплитуд второй и третьей фаз ответа нервного окончаний лягушки и к более выраженному увеличению вызванной секреции медиатора при высокочастотной ритмической активности синапса (50 имп/с), чем в контроле.

7. Применение высокоспецифичных мембранопроникающих внутриклеточных кальциевых буферов ЕГТА-АМ и БАПТА-АМ сопровождается более быстрым и выраженным увеличением вызванной секреции в ходе длительной высокочастотной ритмической активности с частотой стимуляции 50 имп/с, чем в контроле.

8. Применение активаторов рианодиновых рецепторов коффеина (1 ммоль) и рианодина (5 нмоль) приводит к увеличению первоначального квантового состава. Однако, в ходе длительной высокочастотной ритмической активности, увеличение вызванной секреции остается достоверно меньше значений полученных в контрольных экспериментах, что связано с активацией рианодиновых рецепторов и постоянным, но низким уровнем выброса ионов кальция из эндоплазматического ретикулума в цитозоль нервного окончания.

9. Использование рианодина, как антагониста рианодиновых рецепторов, в концентрации 20 мкмоль приводит к более выраженному уменьшению амплитуд второй и третьей фаз ответа нервного окончания. Таким образом, рианодин в антагонистической (по литературным данным) концентрации 20 мкмоль приводит к частотозависимому нарушению проведения возбуждения по мембране двигательного нервного окончания лягушки.

10. Использование блокатора фосфолипазы С (1 173 122 — ЮмкМ), нарушающего образование инозитол-3-фосфата ведет к меньшему увеличению вызванной секреции медиатора в ходе длительной высокочастотной стимуляции нервно-мышечного синапса, чем в контроле, при этом динамика ответа, НО в присутствии И73 122 не отличается от полученной в контроле.

11. В ходе длительной ритмической активности применение ингибиторов работы митохондрий таких как СССР (Карбонил-цианид-м-хлорфенилгидразон) (5 мкмоль) и азид натрия (1 ммоль) приводит к трехкратному увеличению первоначального квантового состава и более быстрому развитию депрессии вызванной секреции, чем в контроле.

5.3аключение Синаптическая пластичность остается одной из самых интересных и еще до конца неизученных тем нейронауки на сегодняшний день. Большой интерес связан с важностью процесса передачи информации между возбудимыми клетками. Принято вычленять несколько фаз процесса в зависимости от изменения уровня вызванной секреции и от времени их развития. Наиболее часто встречаемой фазой является облегчение секреции. Принято считать что в основе этой фазы лежит увеличение концентрации ионов кальция в цитозоле нервной клетки. Однако до сих пор остается неясным какие механизмы ведут к этому. Широко обсуждаются несколько механизмов. Такие как активация внутриклеточных кальциевых депо и выброс кальция из них [94], накопление «остаточного» кальция в ходе высокочастотной стимуляции [154] и изменение формы ответа нервного окончания ведущее к увеличению поступления ионов кальция в цитозоль нервной клетки [10]. В данной работе мы попытались оценить роль и важность каждого из этих механизмов в развитии облегчения как фазы синаптической пластичности.

В ходе длительной высокочастотной активности нервно-мышечного синапса наблюдаемые изменения со стороны вызванной секреции определяются изменениями цитозольной концентрации ионов кальция. Этот постулат не поддается сомнению. Однако полученные данные указывают на присутствие нескольких механизмов, участвующих в регуляции вызванной секреции медиатора путем изменения цитозольной концентрации ионов гтч и и кальция. Так, в ходе длительной высокочастотной активности двигательного нейрона происходит снижение потенциал-зависимых натриевой и калиевой проводимостей, что ведет к изменению формы ПД нервного окончания, что в свою очередь влияет на входящий кальциевый ток, либо увеличивая, либо уменьшая его, в зависимости от степени инактивации потенциал-зависимых натриевых и калиевых каналов. В ходе длительной высокочастотной активности нервно-мышечного синапса (50 имп/с) нарастающая деполяризация мембраны, НО и увеличение входа ионов кальция в цитоплазму постепенно приводят к активации кальций-активируемых калиевых каналов, увеличению выходящего калиевого тока и ускорению реполяризации ПД. Таким образом, происходит ограничение входящего кальциевого тока и роста секреции медиатора, что увеличивает длительность функционирования синапса, за счет экономии запасов медиатора. Эндоплазматический ретикулум, в ходе длительной высокочастотной активности участвует в усилении вызванной секреции путем выброса ионов кальция при активации рианодиновых рецепторов в ответ на увеличение цитозольной концентрации ионов кальция в ходе длительной высокочастотной активности. Синтез инозитол-3-фосфата за счет активации Р1-подтипа фосфолипазы С в ответ на увеличение цитозольного кальция в, НО в ходе длительной высокочастотной активности двигательного нерва также увеличивает выброс ионов кальция через каналы инозитол-3-фосфатных рецепторов, обеспечивая усиление секреции медиатора. Однако для ограничения выброса медиатора и обеспечения более длительного функционирования нервно-мышечного синапса служат митохондрии, которые постоянно утилизируют ионы кальция, тем самым, ограничивая вызванную секрецию медиатора.