Ассоциация эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека

Актуальность проблемы.

Эпителиальные опухоли кожи (ЭОК) — одна из самых распространенных групп опухолей человека, отличающаяся значительным разнообразием. Отмечаемый в последние годы неуклонный рост заболеваемости ЭОК некоторые авторы называют «бесшумной эпидемией» [Holme S. et al., 2000; Nguen Т. et al. 2002]. Этиология и патогенез ЭОК изучены не достаточно. Вместе с тем, исследования в данном направлении представляют значительный интерес с точки зрения оптимизации лечения и профилактики этих опухолей. [Сергеев Ю.В. и соавт., 1999; Снарская Е. С., 2004; Галил-Оглы Г. А. и соавт., 2005; Молочков В. А. и соавт., 2006; Kaplan В. et al., 2000; Arlette J. et al., 2004].

К факторам, способствующим развитию ЭОК, относят длительную инсоляцию, химические канцерогены, а также ионизирующее излучение [Tolbert P. et al., 1997; Armstrong В. et al., 2001]. Определенную роль отводят наследственным и иммунологическим нарушениям [Молочков В.А., 1993; Снарская Е. С., 2004; Галил-Оглы Г. А. и соавт., 2005; Grossman D. et al., 1997]. В последние годы благодаря достижениям в области молекулярной биологии сложились предпосылки для изучения новых аспектов этиологии и патогенеза ЭОК. В частности, предпринимаются попытки определить роль вируса папилломы человека (ВПЧ) в развитии отдельных вариантов ЭОК — кератоакантомы, себорейного кератоза, актинического кератоза, болезни Боуэна, базальноклеточного и плоскоклеточного рака кожи [Shamanin V. et al., 1996; Berkhout R. et al., 2000; Harwood A. et al., 2000; Weissenborn S. et al., 2005; de Villiers E., 2004].

Число больных, страдающих заболеваниями, ассоциированными с ВПЧ, продолжает непрерывно увеличиваться [Киселев В.И., 2004; Дмитриев Г. А., 2006; zur Hausen Н. et al., 1996]. В настоящее время известно около 200 генотипов вирусов папилломы, инфицирующих эпителий слизистых оболочек (род alpha) и кожи (род beta, gamma, mu и nu) [de Villiers E., 2004]. Опасность ВПЧ-инфекции заключается в высокой онкогенности отдельных разновидностей вируса [Киселев В.И., 2004; zur Hausen Н. et al., 2001]. Так, ВПЧ-16 и ВПЧ-18, относящиеся к роду alpha, признаны основными этиологическими агентами рака шейки матки и других раков аногенитальной области [ВОЗ, 2004]. Эпидемиологические и молекулярно-биологические данные позволяют предполагать, что кожные типы ВПЧ рода beta могут обуславливать формирование ряда ЭОК, однако данная взаимосвязь в настоящее время не достаточно изучена [Orth G., 2004; Pfister Н., 2005]. Частота выявления ВПЧ рода beta в различных ЭОК существенно варьирует [Shamanin V. et al., 1996; Harwood С. et al., 2000; Iftner A. et al., 2003; Forslund O. et al., 2003]. Это обусловлено разнообразием используемых с этой целью лабораторных методов: менее чувствительные — способны обнаруживать вирус только при его высокой концентрации, более чувствительные — даже единичные копии вируса в пробе [Meyer Т. et al., 2000]. Кроме того, предполагают, что ассоциация ВПЧ-инфекции с ЭОК может иметь региональные особенности, различаясь у жителей Восточной Европы, Центральной Европы и Америки [zur Hausen P. et al., 2005]. В России подобные исследования не проводились.

В последнее время становится очевидным, что обнаружение ВПЧ в ЭОК не может являться прямым доказательством этиологической роли вируса в развитии данных состояний. Присутствие ВПЧ в патологически измененном эпителии кожи может быть следствием как активной вирусной инфекции, так и бессимптомной персистенции, характерной для условно-патогенных инфекционных агентов. В связи с этим, помимо выявления ВПЧ, необходимо проводить измерение вирусной нагрузки (количество геномов ВПЧ в эпителиальных клетках) [Snijders Р.- 2003; Stoler М., 2006]. Определение вирусной нагрузки является сравнительно новым подходом в генодиагностике, уже продемонстрировавшим высокую значимость в мониторинге течения и прогрессирования генитальной (слизистой) ВПЧ — инфекции [Snijders P. et al., 2003; Stoler М., 2006]. В настоящее время не вызывает сомнений необходимость проведения количественного анализа вирусных геномов в коже. Это позволит более объективно судить о состоянии ВПЧ в опухолях кожи, а, следовательно, глубже понимать механизмы, связывающие ЭОК и ВПЧ [Snijders Р., 2003; Harwood С. et al., 2004; zur Hausen P. et al., 2005; Weissenborn S. et al., 2005].

Наиболее интересной нозологической формой для изучения связи вирусной нагрузки ВПЧ с динамикой клинического течения опухолевого процесса является кератоакантома. Известно, что эта опухоль быстро проходит стадию роста и стабилизации, а затем спонтанно самоизлечивается с формированием выраженного иммунного ответа на антигены опухоли [Беренбейн и др., 1980; Молочков В. А. и др., 2003; Schwartz et al., 1994]. Однако в «атипичных» случаях кератоакантома персистирует и даже подвергается злокачественному перерождению [Молочков В.А. и др., 2003; Shwartz R. et al., 1994]. Клинические особенности течения кератоакантомы представляют удобную модель для изучения вирус — индуцированного канцерогенеза в коже.

С учетом вышеизложенного, изучение ассоциации ВПЧ с различными формами ЭОК (доброкачественными, предраковыми и злокачественными) на основе количественного определения ДНК ВПЧ, является актуальной задачей дерматоонкологии, решение которой будет способствовать дальнейшему пониманию взаимосвязей ЭОК и ВПЧ.

Цель исследования: изучить ассоциацию эпителиальных опухолей кожи с вирусами папилломы человека.

Задачи исследования:

1. Разработать методику выявления и количественного определения ДНК ВПЧ в коже.

2. Оценить выявляемость ДНК ВПЧ в эпителиальных опухолях кожи.

3. Определить вирусную нагрузку ВПЧ в эпителиальных опухолях кожи.

4. На примере кератоакантом изучить изменение вирусной нагрузки ВПЧ в зависимости от динамики клинического течения опухолевого процесса.

Научная новизна.

Впервые разработана количественная методика обнаружения кожных типов ВПЧ рода beta с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) «в режиме реального времени».

На основе количественного анализа впервые детально изучена ассоциация доброкачественных (себорейный кератоз, кератоакантома), предраковых (актинический кератоз, болезнь Боуэна) и злокачественных (базальноклеточный рак, плоскоклеточный рак) ЭОК с ВПЧ рода beta.

На примере кератоакантом продемонстрировано изменение вирусной нагрузки ВПЧ в зависимости от динамики клинического течения опухолевого процесса.

Положения, выносимые на защиту:

1. Доброкачественные (себорейный кератоз, кератоакантома) предраковые (актинический кератоз, болезнь Боуэна) и злокачественные (базальноклеточный рак, плоскоклеточный рак) ЭОК не менее, чем в 70% случаев ассоциированы с инфекцией ВПЧ рода beta.

2. Концентрация ДНК ВПЧ рода beta у больных ВПЧ-ассоциированными ЭОК достоверно превосходит таковую у бессимптомных носителей ВПЧ (контрольная группа).

3. Динамика вирусной нагрузки ВПЧ может описывать клиническое течение ЭОК, что продемонстрировано на примере кератоакантом.

Внедрение в практику.

Результаты работы используются в лечебном и учебном процессе на кафедре кожных и венерических болезней ФППОВ ММА им. И. М. Сеченова, кафедре дерматовенерологии и дерматоонкологии ФУВ МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского, а также на базе Центра молекулярной диагностики ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании Московского областного общества дерматовенерологов, Москва, 2005 г.- 2007 г.- на научно-практической конференции «Пролиферативные заболевания кожи», Москва 25−26 апреля 2006 г.- 23rd INTERNATIONAL PAPILLOMAVIRUS CONFERENCE & CLINICAL WORKSHOP 2006 Prague, September 1−7 2006г.- на международной научно-практической конференции «Геномные технологии в медицине и медицинское образование на рубеже веков», Алмата 19−20 мая 2006 г.- на научно-практической конференции «Социально-значимые заболевания в дерматовенерологии», Москва 29−30 сентября 2006 г.- на научно-практической конференции «Современная диагностика и лечение урогенитального хламидиоза», Москва 26−27 апреля 2007 г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура диссертации.

Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, выводов и библиографического указателя. Указатель литературы включает 29 отечественных и 179 зарубежных работ. Работа иллюстрирована 3 фотографиями, 10 рисунками и 16 таблицами.

выводы.

1. Выявление и определение вирусной нагрузки 5 видов ВПЧ рода beta в коже можно проводить с помощью разработанной количественной методики на основе ПЦР в «режиме реального времени».

2. С помощью ПЦР в «режиме реального времени» ассоциация ЭОК с ДНК ВПЧ рода beta была выявлена в 75% случаев себорейного кератоза, 76,2% -кератоакантом, 93,3% - актинического кератоза, 80% - болезни Боуэна, 81,7% -базальноклеточного рака кожи и 70% - плоскоклеточного рака кожи. В нормальной коже здоровых людей ДНК ВПЧ рода beta обнаруживался в 46,9% случаев.

3. В образцах предраковых (актинический кератоз) и злокачественных (базальноклеточный и плоскоклеточный рак) ЭОК beta 1 и beta 2 виды ВПЧ встречались в 1,5−2 раза чаще, чем beta 3, 4, 5 виды. В 66,6% ЭОК отмечалась ассоциация 2 и более видов ВПЧ рода beta.

4. В ходе количественного анализа было установлено, что вирусная нагрузка ВПЧ во всех ЭОК превышала вирусную нагрузку ВПЧ в нормальной коже (1,4 ± 0,6 lg/ 105 клеток), причем при себорейном кератозе (3,0 ± 0,7 lg/ 105 клеток), кератоакантоме (3,2 ± 1,6 lg/ 105 клеток), актиническом кератозе (4,5± 1,2 lg/ 105 клеток) и базальноклеточном раке кожи (2,08 ± 1,4 lg/ 105 клеток) различия имели достоверный характер.

5. На примере кератоакантом продемонстрирована связь вирусной нагрузки ВПЧ с динамикой клинического течения опухолевого процесса: в фазу роста кератоакантом вирусная нагрузка составила 3,1 ± 1,6 lg/Ю5 клеток, в фазу стабилизации — 3,9 ± 1,6 lg/Ю5 клеток, в фазу регресса — 1,6 ± 1,5 lg/Ю5 клеток.

Практические рекомендации.

1. Всем больным эпителиальными опухолями кожи (доброкачественными, предраковыми и злокачественными) целесообразно проводить обследование на наличие папилломавирусной инфекции рода beta. Показана необходимость дифференцированного выявления 5 видов вирусов папилломы человека рода beta.

2. Обнаружение вирусов папилломы человека рода beta в эпителиальных опухолях кожи следует проводить с определением вирусной нагрузки, объективно отражающей состояние вирусов (активация или бессимптомная персистенция) в эпителиальных клетках кожи.

3. С целью уточнения клинического течения эпителиальных опухолей кожи обосновано определение динамики вирусной нагрузки.

4. Обнаружение и количественное определение вирусов папилломы человека рода beta в образцах кожи (биоптаты, соскобы) может проводиться с помощью разработанной методики ПЦР в «режиме реального времени».