Осмометрический метод определения молекулярной массы белка

На основании.

различных экспериментальных исследований, включающих титрование, электрофорез и другие методы, устанавливаются значения очень важных параметров для белков — ИЭТ и молекулярной массы. Величина молекулярной массы белков колеблется от 6000 до нескольких миллионов. В табл. 3.5 приведены значения этих параметров для некоторых белков.

Таблица 3.5

Значения pH в изоэлектрических точках и молекулярная масса для некоторых белков

Название белка.	Молекулярная масса белка, г/моль.	ИЭТ.
Миоглобин кашалота.	17 600.	7,0.
Пепсин.	35 000.	1,1.
Альбумин яйца.	40 000.	4,6.
Гемоглобин лошади.	68 000.	6,6.
Уреаза.	483 000.	4,9.

На явлении осмоса, рассмотренного в гл. 2 (см. рис. 2.2), основан осмометрический метод определения молекулярной массы белка, заключающийся в измерении осмотического давления на осмометре (рис. 3.8). Зависимость между осмотическим давлением и молекулярной массой имеет вид.

где М — молекулярная масса, г/моль; с — концентрация, моль/л; R — универсальная газовая постоянная; Т — температура эксперимента, К; я — осмотическое давление, Па.

Этим методом можно определить степень полимеризации (СП) — число молекулярных звеньев в полимерной молекуле. СП = М_Рг/М_{ср (}лк) = 10²…10⁴, где Мр, — молекулярная масса полипептида; М_{ср (А}к) — средняя молекулярная масса аминокислоты (АК), как правило, равная и 110 г/моль.

Диализ. Для отделения низкомолекулярных примесей или замены среды используют диализ. Метод основан на том, что большой размер молекул белка не позволяет им проходить через полупроницаемые мембраны, а низкомолекулярные вещества легко диффундируют и равномерно распределяются между объемом, ограниченным мембраной, и окружающим раствором (рис. 3.9). После многократной замены внешнего раствора состав среды в диализном мешочке, выполненном из полупроницаемой мембраны (pH, концентрации солей и т. п.), будет соответствовать составу окружающего раствора.

Высаливание. Растворимость белков сильно зависит от ионной силы раствора (концентрации солей). В дистиллированной воде белки плохо растворимы, а при добавлении солей в раствор (по мере увеличения его ионной силы) их растворимость возрастает. Это явление обусловлено тем, что при повышении ионной силы гидратированные неорганические ионы связываются с поверхностью белка и тем самым снижают степень агрегации белковых молекул между собой. Такое явление носит название высаливание. При высокой ионной силе молекулы белка лишаются гидратирующих оболочек, молекулы слипаются (происходит агрегация) и, как следствие, белок выпадает в осадок (высаливание). Используя различие зависимостей растворимости белков от ионной силы раствора, можно фракционировать смесь белков. Таким образом, высаливание является методом выделения белков.