Ферменты, используемые в генетической инженерии

При конструировании векторных плазмид используют специальные ферменты, которые можно подразделить на несколько групп:

• 1) ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);
• 2) ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);
• 3) ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);
• 4) ферменты, позволяющие осуществлять изменение структуры концов фрагментов ДНК.

Рестриктазы. Для выделения фрагментов ДНК используют ферменты, которые специфически расщепляют молекулы ДНК, — бактериальные эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы).

Все рестрикционные эндонуклеазы узнают специфические, довольно короткие последовательности ДНК и связываются с ними. Этот процесс, определяемый типом фермента, сопровождается разрезанием молекулы ДНК, либо в самом сайте узнавания (последовательности, которые распознаются эндонуклеазами и в которых происходит расщепление молекулы ДНК), либо в каком-то другом сайте.

Различают 3 основных класса рестриктаз. Рестриктазы 1-го класса осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК, а рестриктазы.

2-го и 3-го классов узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них расстоянии. В генной инженерии используются исключительно ферменты 2-го класса, которые узнают последовательности, содержащие от 4 до 6 нуклеотидных пар, поэтому рестриктазы делят на мелкои крупнощепящие.

Мелкощепящие рестриктазы узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем крупнощепящие, узнающие последовательность из шести нуклеотидных пар. Это связано с тем, что вероятность встречаемости определенной последовательности из четырех нуклеотидов гораздо выше, чем последовательности из шести нуклеотидов.

Если сайт рестрикции окажется внутри гена, то обработка ДНКрестриктазой приведет к его инактивации. Вероятность такого события очень велика при обработке мелкощепящими рестриктазами и незначительна при применении крупнощепящих эндонуклеаз. Поэтому с целью получения неповрежденного гена расщепление проводят поочередно несколькими крупнощепящими рестриктазами, либо применяют прием «недорестрикции», т. е. рестрикцию проводят в таких условиях, когда происходит расщепление лишь в одном сайте.

В настоящее время выделено более 500 рестриктаз класса 2. Для их обозначения используются сокращенные названия микроорганизмов — продуцентов. Род микроорганизма обозначается прописной буквой, а вид — двумя строчными; штамм обычно не указывается. Римские цифры — порядковый номер данной эндонуклеазы в ряду прочих рестриктаз, выделенных из данного микроорганизма. Например, Hpal и НраИ — это соответственно первая и вторая рестрицируюшие эндонуклеазы класса 2, выделенные из Haemophilus parainfluenzae.

Одна из самых употребляемых в генной инженерии рестриктаза EcoRI — это эндонуклеаза, выделенная из Escherichia coli. Подобно многим другим рестриктазам, этот фермент расщепляет ДНК по палиндромной последовательности, т. е. короткому сегменту ДНК, в котором обе цепи при считывании в направлении 5'—>3' имеют одинаковую последовательность. Для EcoRI это последовательность 5'-GAATTC-3 EcoRI расщепляет фосфодиэфирные связи обеих цепей между G и А. Разрывы в цепи ДНК располагаются наискось друг от друга, в результате чего образуются одноцепочечные комплементарные концы с «хвостами» из четырех нуклеотидов в каждом («липкие» концы). Каждый одноцепочечный «хвост» заканчивается 5'-фосфатной группой, а З'-гидроксильная группа противоположной цепи как бы утоплена. Эти комплементарные «липкие» концы (ААТТ), удерживаются вместе за счет спаривания оснований. Их, однако, можно легко отделить друг от друга путем небольшого нагревания. При охлаждении липкие концы гибридизуются вновь в правильной ориентации.

Помимо рестриктаз, гидролизующих (расщепляющих) полинуклеотидную цепь с образованием «липких» концов, существуют рестриктазы, которые вносят разрывы в цепи строго друг против друга с образованием фрагментов ДНК с «тупыми» концами. Сайты узнавания для них могут состоять из четырех, пяти, шести, восьми или более пар нуклеотидов.

Обработка образца ДНК определенной рестриктазой всегда дает один и тот же набор фрагментов — при условии, что расщепление происходит по всем сайтам узнавания. Если использовать несколько ферментов рестрикции и сначала обработать ДНК каждой из рестриктаз в отдельности, а затем их комбинациями, можно построить физическую карту данной ДНК, т. е. установить порядок следования сайтов рестрикции вдоль молекулы. Определив размер полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза, можно найти положение рестрикционных сайтов.

ДНК-лигаза. Создание рекомбинантных ДНК было бы невозможно без использования рестрицирующих эндонуклеаз. Однако одних только ферментов рестрикции недостаточно для осуществления молекулярного клонирования. Водородные связи между теми четырьмя основаниями, которые образуют липкие концы, недостаточно прочны, чтобы удержать два объединившихся фрагмента ДНК. Устранение разрывов в сахарофосфатном остове молекулы, т. е. восстановление связи между З'-гидроксильной концевой группой одной цепи и 5'-фосфатной группой другой, проводят ферментом ДНК-лигазой бактериофага Т4, которую открыли в 1961 г. Мезельсон и Вейгл. Лигаза фага Т4 универсальна, так как помимо лигирования «липких» концов способна катализировать реакцию воссоединения двухцепочечных фрагментов ДНК с «тупыми» концами, которые сближаются друг с другом после того, как объединяемые фрагменты связываются с ферментом.

Обратная транскриптаза (ревертаза). При конструировании векторных молекул используется также фермент, синтезирующий ДНК на матрице РНК, который называется обратная транскриптаза или ревертаза.

При изучении ретровирусов, геном которых представлен молекулами одноцепочечной РНК, было обнаружено, что в процессе внутриклеточного развития ретровирус проходит стадию интеграции своего генома в виде двухцепочечной ДНК в хромосомы клетки-хозяина. В 1964 г. Темин выдвинул гипотезу о существовании вирусспецифичного фермента, способного синтезировать на РНК-матрице комплементарную ДНК. В 1970 г. Темин с Мизутани, а также независимо от них Балтимор, открыли искомый фермент в препарате внеклеточных вирионов вируса саркомы Рауса. Данная РНК-зависимая ДНК-полимераза получила название обратная транскриптаза, или ревертаза. Она обладает, по крайней мере, тремя ферментативными активностями:

• 1) ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы как РНК, так и ДНК;
• 2) активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе гибрида РНК—ДНК, но не одноили двухцепочечную РНК;
• 3) ДНК-эндонуклеазной активностью.

Очищенная обратная транскриптаза синтезирует ДНК как на РНК-, так и на ДНК-матрицах.

Ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК. Полимеразы. Впервые ДНК-полимераза была выделена Корнбергом с сотрудниками в 1958 году из Е. coli. ДНКполимераза IЕ. coli (Pol I) не связывается с молекулами двухцепочечной кольцевой ДНК, а только с одноцепочечными формами, полученными после денатурации. Фермент состоит из мономерной полипептидной цепи с молекулярной массой 103 кДа и имеет 3-х доменную структуру. Каждый домен обладает своей ферментативной активностью: 5'—3' полимеразной, 3'—5' экзонуклезной и 5'—3' экзонуклеазной.

Для целей генетической инженерии часто используют, так называемый, фрагмент Кленова, состоящий из полимеразы и 3'—5' экзонуклеазы. Фрагмент Кленова (Pol 1К) обычно используют для достройки одноцепочечных 5'-концов на двухцепочечной ДНК, часто генерируемых рестриктазами, до тупых; для синтеза второй цепи на одноцепочечной ДНК, а также для гидролиза одноцепочечных З'-концов на двухцепочечных молекулах ДНК.

Другая полимераза поли (А) — полимераза Е. coli была открыта в 1973 году Сиппелом. Она катализирует присоединение к З'-ОН концу одноцепочечных молекул РНК поли (А) последовательностей. Применяется при подготовке молекул РНК к копированию с них комплементарной ДНК для введения радиоактивной метки в З'-конец РНК.

Терминальная трансфераза (концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза) Фермент был обнаружен Боллумом в 1962 году в тимусе теленка. Его субстратом при использовании в качестве кофактора ионов Mg²⁺ является одноцепочечная ДНК с З'-ОН концом или двухцепочечная ДНК с выступающим одно цепочечным З'-ОН концом. Если в качестве кофактора используются Со²⁺, этот фермент может катализировать присоединение дезоксинуклеотидов к З'-ОН концу двухцепочечной ДНК с тупыми концами. При введении в реакцию, направляемую терминальной трансферазой, дезоксинуклеотидов лишь одного типа образуются молекулы ДНК, имеющие гомополимерные 1-цепочечные З'-концы. Таким же образом можно достроить другим молекулам ДНК гомополимерные З'-концы, комплементарные первым. Смешение полученных препаратов ДНК при определенных условиях может приводить к формированию гибридных молекул ДНК. Именно с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы в 1972 г. был выполнен первый эксперимент по рекомбинации молекул ДНК in vitro.