Кометаболизм ЭДТА и глюкозы у бактериального штамма LPM-4

Федеральное агентство по образованию.

Пензенский государственный педагогический университет.

им. В. Г. Белинского.

Факультет Кафедра.

Естественно-географический биохимии.

Дипломная работа.

Кометаболизм ЭДТА и глюкозы у бактериального штамма LPM-4.

Студент __________________________________________ Юдина Е. И.

подпись.

Руководители ___________________________________ Сметанин В. А.

подпись.

__________________________________ Дедюхина Э.Г.

подпись.

К защите допустить. Протокол № от «_ «200 г.

Зав. кафедрой ______________________________________ Генгин М.Т.

подпись.

Пенза, 2007 г.

Введение

…4.

Глава 1. Обзор литературы… 6.

1.1. Хелатирующие соединения… 6.

1.1.1. Свойства, строение и комплексообразование ЭДТА …6.

1.2. Бактериальная деградация ЭДТА …7.

1.2.1 Бактерии, разрушающие ЭДТА …10.

1.2.2. Характеристика штамма LPM-4… 12.

1.3. Понятие о кометаболизме …14.

1.4. Периодическое культивирование …20.

1.5. Периодическое культивирование с подпиткой …23.

Глава 2. Материалы и методы …25.

2.1. Условия культивирования…25.

2.2. Методика приготовления питательных сред …26.

2.3. Методы анализа…28.

2.3.1 Вычисление энергетического выхода роста штамма LPM-4 …29.

2.3.2. Вычисление удельной скорости роста штамма LPM-4 …32.

Глава 3. Результаты и их обсуждение …33.

3.1. Исследование влияния степени деградации ЭДТА на ассимиляцию глюкозы бактериальным штаммом LPM-4 …33.

3.1.1. Динамика роста и потребления глюкозы и ЭДТА …33.

3.1.2. Динамика накопления биомассы и удельная скорость роста штамма LPM-4 …39.

3.1.3. Накопление аммония в процессе роста штамма LPM-4 …42.

3.1.4. Показатели роста штамма LPM-4 при кометаболизме ЭДТА и глюкозы…44.

3.2. Исследование способности штамма LPM-4 к ассимиляции ЭДТА и глюкозы в процессе длительного культивирования с добавлением субстрата…46.

3.2.1. Исследование ассимиляции ЭДТА штаммом LPM-4 в процессе культивирования с добавлением ЭДТА …47.

3.2.2. Исследование ЭДТА-индуцированной ассимиляции глюкозы штаммом LPM-4 в процессе длительного культивирования с добавлением глюкозы.50.

3.2.3. Исследование способности штамма LPM-4 к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА …52.

Заключение

…60.

Выводы …62.

Литература …63.

Приложение …66.

Проблема очистки сточных вод, производство которых в России достигает 500 литров в сутки на душу городского населения, является одной из актуальнейших проблем наступившего века. В настоящее время разработаны и развиваются современные технологии очистки сточных вод. Наибольший интерес и перспективу имеют естественные и самые дешевые биологические методы очистки, представляющие собой интенсификацию природных процессов разложения органических соединений микроорганизмами в аэробных или анаэробных условиях. Существует множество биопрепаратов, используемых для очистки сточных вод. Это консорциумы микроорганизмов, выделенные методом накопительных культур обычно из активного ила аэротенков городских сооружений очистки сточных вод. Они используются для очистки сточных вод местного значения, например в селах, дачных и коттеджных поселках, небольших поселках городского типа, мини-заводах и т. п. Биопрепараты, содержащие ограниченное число видов микроорганизмов, по спектру разлагаемых веществ уступают свежему активному илу. Однако, они содержат быстро растущие штаммы, которые инициируют процессы разложения органических загрязнений. В нестерильном процессе развиваются также микроорганизмы, содержащиеся в отходах, и в микробное сообщество включаются недостающие звенья.

Мониторинг окружающей среды показывает, что в ней происходит постоянное накопление ЭДТА. В мире производится примерно 100 000 тонн ЭДТА в год [2−5]. Многочисленные исследования показали, что деградации ЭДТА в очистных сооружениях не происходит, а в природе существует лишь один значимый способ деградации ЭДТА — разложение комплекса Fe (III)EDTA под действием УФ лучей, который происходит лишь на поверхности воды. Накопление ЭДТА в воде приводит к ухудшению качества питьевой воды, так как ЭДТА способствует переходу в растворенное состояние ионов металлов (в том числе тяжелых и токсичных). Большая часть этих комплексов проникает в грунтовые воды и водопроводы, ухудшая качество питьевой воды. Следует обратить внимание на то, что здоровью человека в первую очередь угрожают комплексы ЭДТА с токсичными металлами, а не ЭДТА, как химическое соединение.

До настоящего времени было выделено лишь несколько смешанных культур и всего три чистые культуры ЭДТА-деградирующих бактерий:

Agrobacterium sp. ATCC 55 002, грам-отрицательный изолят BNC 1,.

грам-отрицательные бактерии DSM 9103 и Pseudomonas sp. LPM-410.

В лаборатории физиологии микроорганизмов ИБФМ РАН был выделен новый ЭДТА-разрушающий бактериальный штамм LPM-4 со специфической потребностью в ЭДТА. Данный штамм является уникальным, т.к. способен расти только на средах, содержащих ЭДТА. Отличительной особенностью данного штамма является то, что он способен метаболизировать глюкозу только в присутствии ЭДТА.

И целью настоящей работы было исследование совместного метаболизма ЭДТА и глюкозы у бактериального штамма LPM-4.

Соответственно были поставлены следующие задачи:

1. Исследование влияния степени деградации ЭДТА на ассимиляцию глюкозы бактериальным штаммом LPM-4;

2. Изучение способности клеток к деградации ЭДТА при дополнительном внесении ЭДТА в среду;

3. Исследование ЭДТА-индуцированной способности клеток ассимилировать глюкозу в процессе длительного культивирования с добавлением глюкозы;

4. Изучение способности штамма LPM-4 к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА в процессе длительного культивирования в присутствии глюкозы.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Хелатирующие соединения (комплексоны).

Термин «хелат» был предложен Морганом для обозначения циклических структур, которые образуются в результате присоединения катионов к двум или более донорным атомам, принадлежащим одной молекуле комплексообразующего агента. Название «хелат» происходит от греческого слова, которое означает «клешня», отсюда и еще одно название этих соединений — «клешневидные». Основным свойством комплексонов является способность образовывать с большинством ионов металлов в водных растворах комплексонаты. Получается это следующим образом: при введении комплексона в раствор, содержащий катион металла, создаются условия для конкуренции между молекулами гидратной оболочки катиона и молекулами внесенного в раствор хелата, происходит это из-за высокой, по сравнению с водой, донорной способности лигандных групп, их стерической доступности, а также соответствующего значения рН раствора. Конкурирующий с водой коплексообразующй агент, удовлетворяющий этим требованиям, при соответствующих условиях способен вытеснить из координационной сферы аквакомплекса воду с образованием нового комплексного соединения (МеY). Для ЭДТА подобный процесс выглядит следующим образом:

Ме (Н₂О)_х^п+ +Y^4-=MeY^(n-4)+ + xH₂O.

1.1.1 Свойства, строение и комплексообразование этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).

Этилендиаминтетрауксусная кислота (С₁₀Н₁₆О₈N₂) — четырехосновная аминокарбоксильная кислота. Молекулярный вес 292,35. Белый кристаллический порошок. Хорошо растворим в воде, образует стойкие растворы. Растворимость ЭДТА минимальна при рН 1,6−1,8, при уменьшении концентрации ионов водорода в растворе она растет и проходит через максимум при [H]=2,5 г-ион/л.

Структурная формула ЭДТА и идеализированная октаэдрическая комплекса металл — ЭДТА приведены на рис. 1.

Анион ЭДТА^4- содержит 10 активных центров, способных осуществлять координацию лиганда ионами металлов: 2 атома азота и 8 атомов кислорода. В твердой фазе в качестве донорных атомов могут выступать все 10 центров. Однако, геометрия лиганда такова, что с одним атомом металла он может образовывать не более 6 связей: 2 с атомами азота и 4 с атомами кислорода разных ацетатных фрагментов ЭДТА. При этом образуется 5 пятичленных металлоциклов: один этилендиаминный (Е-цикл) и четыре глицинатных (Glyциклы). Центральный Е-цикл и два Gly-цикла лежат приблизительно в одной плоскости, называемой «экваториальной» плоскостью координационного октаэдра. Эти два Gly-цикла обозначаются как G-циклы. Средние плоскости двух других глицинатных циклов располагаются почти перпендикулярно к экваториальной плоскости и обозначаются как R-циклы.

1.2. Бактериальная деградация ЭДТА.

ЭДТА характеризуется очень слабой биологической разрушаемостью.

На рисунке 2 приведена предполагаемая схема деградации ЭДТА, которая была изучена у ЭДТА — разрушающего штамма DSM-9103. Деградация ЭДТА осуществляется монооксигеназной системой. В бактериальных клетках оксигеназные системы выполняют пластическую функцию, окисляя углеродсодержащие вещества, обеспечивают поступление углерода в клетки.

В. Идеализированная октаэдрическая структура комплекса металл-ЭДТА.

Физиологическая роль оксигеназ сводится к конкретной задаче увеличения водорастворимости, полярности окисляемой молекулы [8, 9].

ЭДТА-монооксигеназа состоит из двух субъединиц. Субъединица В является оксидоредуктазой, которая переносит восстановительные эквиваленты от NADH₂ на FMN, а субъединица, А трансформирует комплекс металл-хелатирующий агент при поглощении молекулярного кислорода, то есть выполняет роль собственно оксигеназы.

В результате двух последовательных отщеплений ацетильных концов образуется N, N¹-EDDA. Метаболизм N, N¹-EDDA до конца не изучен, предполагается, что он выглядит как показано на рис. 3. То есть молекула N, N¹-EDDA теряет еще один ацетильный остаток. О метаболизме EDMA ничего не известно, здесь возможно два варианта: либо отщепляется последняя ацетильная группа и остается этилендиамин, либо происходит разрыв в молекуле этилендиамина с образованием глицина и аминоацетальдегида или аммиака и иминоацетальдегидацетата.

1.2.1. Бактерии, разрушающие ЭДТА.

ЭДТА характеризуется высокой устойчивостью; микроорганизмы, способные разрушать это соединение, встречаются в природе очень редко. В настоящее время известно лишь четыре штамма ЭДТА-разрушающих бактерий, выделенные в чистую культуру:

1. Штамм, относящийся к роду Agrobacterium, способный разрушать комплекс Fe (III)-ЭДТА [11];

2. Штамм BNC-1, граммотрицательная бактерия, способный деградировать комплексы ЭДТА с Mg²⁺, Ca²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ [12];

3. Штамм DSM-9103 граммотрицательная бактерия относится к подклассу б-Proteobacteria [4], способный деградировать комплексы Mg²⁺-, Ca²⁺-, Mn²⁺-ЭДТА и частично хелаты с Co, Cu, Zn, Pb.;

4. Штамм LPM-410 идентифицирован как Pseudomonas sp.

Характеристика штамма LPM-4.

Штамм LPM-4 был выделен в лаборатории физиологии микроорганизмов ИБФМ РАН к.б.н. Чистяковой Т. И. из активного ила Пущинских очистных сооружений методом накопительной культуры. Клетки неподвижны, колонии на твердой питательной среде с ЭДТА через неделю роста 0,1−0,3 см в диаметре, круглые, перламутровые с синеватым блеском. Аэроб, не обладающий запахом.

Клетки штамма имеют палочковидную форму (0,1−0,2Ч0,5−0,6 мкм). На среде с ЭДТА клетки могут быть одиночными или парными. Это типичная граммотрицательная бактерия (рис. 4), о чем говорит достаточно толстая клеточная стенка с волнистыми краями. Клетка содержит электронно-плотные включения (при потреблении ЭДТА), которые, как показали исследования на других штаммах, содержат Ca²⁺, Mg²⁺ и PO₄^3-.

Штамм LPM-4 уникален по потребностям в питательных веществах. Установлено, что штамм способен расти только на средах, содержащих ЭДТА, и не растет на средах, содержащих глюкозу, этанол, органические кислоты в качестве единственного источника углерода и энергии и неорганические (сульфат аммония, нитрат калия) или органические (мочевина, пептон, гидролизат казеина, аминопептид, дрожжевой экстракт) источники азота.

Данный штамм обладает положительной реакцией на наличие оксидазы и каталазы. Температурный оптимум для роста штамма 32−34?С. Оптимум рН=7. На жидкой питательной среде с ЭДТА идет защелачивание среды в процессе роста клеток.

Клетки штамма способны разрушать различные комплексы ЭДТА с металлами. Суспензия отмытых клеток штамма разрушала ЭДТА и комплексы Ba²⁺-, Mg²⁺-, Ca²⁺-, Mn²⁺-ЭДТА с постоянной скоростью в диапозоне от 0,310 до 486 ммоль ЭДТА/(г· ч), удельная скорость разрушения Zn-ЭДТА достигала наибольшего значения (0,137 ммоль ЭДТА/(г· ч)) в течение первых 10 часов инкубации, а затем снижалась.

Установлено, что штамм LPM-4 способен совместно метаболизировать ЭДТА и глюкозу. Этот процесс можно назвать кометаболизмом.

1.3. Понятие о кометаболизме.

Кометаболизм — это особый случай утилизации смешанных субстратов. Кометаболизм впервые наблюдал Фостер в 1962 году у бактерий, утилизирующих углеводороды. Эти бактерии могут расти на метане, как на единственном источнике углерода, то есть они являются метанотрофами. Однако, они не могут утилизировать такие алканы, как этан или пропан, в качестве единственного источника углерода. Когда бактерии росли на смеси метана, этана и пропана, клетки использовали метан, а также этан и пропан, которые окислялись до продуктов, таких как ацетальдегид, уксусная кислота, пропионовая кислота и ацетон соответственно.

Фостер предложил термин соокисление для описания подобного типа трансформации субстратов. Позднее другие исследователи наблюдали подобное явление с другими типами микробной трансформации; они включают не только окисление, но также и гидролиз, дегалогенирование и так далее, то есть термин «кометаболизм» было предложено использовать в более широком смысле.

В 1982 году Дальтон и Стирлинг предложили следующее определение кометаболизма. Кометаболизм — трансформация неростового субстрата в присутствии ростового субстрата или иного метаболизируемого соединения. Под неростовыми субстратами понимают такие, которые не обеспечивают деление клеток. Ростовой субстрат выполняет несколько функций. Во-первых, поставляет энергию для бактериального роста и процессов поддержания метаболизма нерастущих клеток. Во-вторых, поставляет восстановительные эквиваленты, которые позволяют деградировать неростовые субстраты. В-третьих, ростовые субстраты индуцируют синтез катаболических ферментов, которые обнаруживают загрязняющие соединения (поллютанты) и катализируют их трансформацию. Метаболизм неростовых субстратов не поставляет никакой энергии или восстановительных эквивалентов для микроорганизмов.

Структура трансформируемого (соокисляемого) соединения часто не имеет никакой аналогии с ростовым субстратом. В этом случае связь между процессами окисления ростового и трансформируемого (неростового) субстратов реализуется на уровне интермедиатов катаболизма источника углерода. Под этим подразумевают, что при окислении ростового субстрата генерируется энергия, необходимая для функционирования ферментов, осуществляющих окисление неростовых субстратов.

На основе разных механизмов трансформации неростового субстрата, а также в зависимости от того, является косубстрат ростовым или неростовым, условно можно выделить четыре типа кометаболизма.

Первый тип — трансформация неростового субстрата до продукта при использовании в качестве косубстрата ростового субстрата.

Второй тип — трансформация неростового субстрата без использования ростового субстрата. Неростовой субстрат используется не как источник углерода, а только как источник энергии, необходимой для осуществления реакций кометаболизма. В обоих рассмотренных случаях трансформация ростового субстрата должна обеспечивать энергией метаболизм другого субстрата, и этот процесс осуществляется только до определенного продукта, который дальше не ассимилируется клетками.

К третьему типу кометаболизма относятся процессы ассимиляции неростовых субстратов, что сопряжено с использованием ростовых субстратов, в результате чего соединения углерода включаются в компоненты клетки. Сначала подобные процессы были описаны как миксотрофия, однако поскольку один из субстратов не является ростовым, этот термин в данном случае является некорректным. Включение углерода неростовых субстратов или продуктов их трансформации в конструктивный метаболизм, который приводит к увеличению биомассы, предложено называть дополнительным метаболизмом. Поскольку данные процессы осуществляются только при ассимиляции ростового субстрата, их можно отнести к кометаболизму. В этом случае продукты трансформации неростовых субстратов являются компонентами клеток.

Четвертый тип кометаболизма — синтаболизм — способность микроорганизмов расти на смеси двух или больше неростовых субстратов. Синтаболизм был выявлен у облигатных метанотрофов. Показано, что в определенных условиях они способны расти при наличии двух субстратов одновременно, каждый из которых сам по себе не является ростовым. В основе синтаболизма лежит способность метанотрофных бактерий сооокислять (вследствие неспецифичности метанмонооксигеназы) С₂Н₆ или СО. Установлено, что для прохождения реакции монооксигенирования С₂Н₆ необходима энергия, источником которой может служить окисленные производные метана или этана (метанол, формиат, этанол). Соответствующие эксперименты показали, что метанотрофы способны расти на этане (неростовой субстрат) в присутствии названных выше дополнительных неростовых субстратов.

Конечные продукты трансформации могут использоваться другими микроорганизмами в сообществе. Конечные продукты кометаболизма сложно прогнозировать, но несколько типов эффектов можно представить: если косубстрат исходно токсичен, то в результате кометаболизма будет происходить его детоксикация. Конечные продукты кометаболизма будут поставлять питательные вещества для каких-нибудь других микроорганизмов и это может привести к большему биологическому разнообразию. Конечные продукты могут быть токсичными для данных продуцентов или других микроорганизмов и результатом этого может быть эффект ингибирования. Конечные продукты кометаболизма могут быть устойчивыми и это может быть результатом увеличения устойчивости конечных продуктов.

В целом, процессы кометаболизма изучены недостаточно. Дальнейшее исследование их механизмов имеет не только практическую ценность, но и большое теоретическое значение, поскольку может раскрыть закономерности взаимодействия микроорганизмов с несколькими субстратами.

Кометаболизм — важный инструмент при изучении процессов микробиологического разложения ароматических и циклических соединений. Многие виды Pseudomonas, Nocardia, Corynebacterium, Alcaligenes, Mycobacterium, Micrococcus, Cellulomonas, Streptococcus, Flavobacterium, а также микромицетов кометаболизируют ароматические циклические и полициклические углеводороды, высшие полициклические ароматические углеводороды, их алкилзамещенные и другие производные. У одних и тех же микроорганизмов могут функционировать различные механизмы расщепления ароматического кольца, что обусловлено как строением молекулы неростового субстрата, так и условиями культивирования.

Так, Nocardia sp. DSM 43 251 осуществляет кометаболизм фенола, изомеров крезола и оксианизола, 3,4-диметилфенола, галогенфенолов, 4-(метилтио)-фенола в присутствии косубстратов — сахарозы, этанола, фумарата. Фенол и монохлорзамещенные производные метаболизируются через путь 1,2-расщепления катехола (катехол-1,2-диоксигеназа); замещенные производные фенола в пара-положении (метоксиили метилтиогруппа) — через путь 2,3- расщепления.

Некоторые нокардии соокисляют n-ксилол и образуют или n-толуиловую кислоту и дигидрокси-п-толуиловую кислоты, или б, б'-диметилмуконовую кислоту в зависимости от рН среды. п-Ксилол трансформируется видами Nocardia двумя путями. Регуляция осуществляется за счет изменения специфичности оксигеназы при изменении рН. При рН 8 функционирует метильная группа оксигеназной системы и образуется п-толуиловая кислота и дигидрокси-п-толуиловая кислоты. При рН 6 метильная группа оксигеназы не функционирует, что приводит к образованию метилзамещенных муконовых кислот путем прямого дигидроксилирования и разрыва бензольного кольца. Иногда п-ксилол окисляется до п-оксиметилбензойной кислоты. Соокисление метили этилзамещенных нафталинов клетками Nocardia и Streptomyces, выращенными на гексадекане, приводит к окислению только одного метильного или этильного заместителя до соответствующей карбоновой кислоты. При этом имеет значение стерическое положение метильной группы.

Изучено соокисление циклоалканов. Культура граммотрицательных бактерий при росте на 2-метилбутане соокисляла циклоалканы и циклические моноалкены. Только при соокислении циклопропана происходил разрыв кольца. Соокисление С₅-С₈— циклопарафинов приводило к накоплению соответствующих эпоксидов, спиртов и кетонов.

Приведенные примеры кометаболизма циклических соединений свидетельствуют о том, что типы реакций превращения этих неростовых субстратов достаточно хорошо изучены. Чаще всего способность кометаболизировать неростовые субстраты объясняется неспецифичностью некоторых ферментов. Если структурно неростовой субстрат подобен ростовому, то чаще всего реакции окисления двух субстратов катализируются одними и теми же ферментами, однако процессы трансформации ростового и неростового субстратов не всегда аналогичны. Например, клетки Arthrobacter продуцируют 2-, 3- и 4-гексадеканон из нгексадекана при росте на дрожжевом экстракте, при этом обнаружены и соответствующие 2-, 3- и 4-спирты. Глюкоза стимулирует процесс кометаболизма гексадекана. Образование этих продуктов окисления, которые далее не трансформируются, свидетельствует о том, что начальные реакции окисления гексадекана являются результатом неспецифичности ферментов, функции которых не заключаются в окислении углеводородов.

Классический пример кометаболизма: окисление этана метаноокисляющими бактериями: образующийся при начальной довольно неспецифической монооксигеназной реакции этанол не метаболизируется далее метилотрофами и может только служить субстратом для других бактерий в данном местообитании. В результате активность окисления этана метаноокисляющей популяцией не увеличивается, пока присутствует метан как дополнительный субстрат.

Еще один пример, при разложении древесины легко гидролизуемая целлюлоза (косубстрат) служит источником энергии и электронов для образования Н₂О₂, с участием которого расщепляется устойчивый к деградации лигнин.

Такие микроорганизмы, как Bacillus cereus SNK 12, Paenibacillus polymyxa SNK 2, Azotobacter chroococcum ANK ЙЙ, Ochrobactrum intermedium ANK Й cпособны к деградации азобензола в условиях кометаболизма. При этом В. cereus SNK 12 в качестве более доступного источника углерода использует глюкозу, а О. intermedium — хризоидин и метиловый оранжевый.

Другой пример: кометаболизм флуорена культурами Rhodococcus rhodochrous и Pseudomonas fluorescens. Исследована зависимость интенсивности трансформации флуорена бактериями Rhodococcus rhodochrous 172 при росте на сахарозе и Pseudomonas fluorescens 26K при росте на глицерине от концентрации ростового субстрата и фазы роста культур.

Исследования численности и функционирования различных групп бактериобентоса водохранилища вблизи г. Череповца выявили явление кометаболизма. При наличии легкоусвояемых соединений органических веществ, бактериальные сообщества подвергают соокислению трудноминерализуемые соединения сточных вод, таких как полихлорированные бифенилы, полиароматические углеводороды, нефтепродукты, металлы, фенолы, соединения азота, серы и др. вещества.

При исследовании кометеболизма винилхлорида и этена у Pseudomonas aeruginosa strain DL1 было обнаружено, что при длительном культивировании (более 40 суток) неростовой субстрат винилхлорид становится ростовым.

1.4. Периодическое культивирование.

При внесении бактерий в питательную среду они обычно растут до тех пор, пока содержание какого-нибудь из необходимых им компонентов среды не достигает минимума, после чего рост прекращается. Если на протяжении этого времени не добавлять питательных веществ и не удалять конечных продуктов обмена, то получим периодическую культуру (популяцию клеток в ограниченном жизненном пространстве). Кривая роста бактериальной культуры показана на рис. 1.5. Кривой роста называется кривая, описывающая зависимость логарифма числа живых клеток от времени. Кривая роста позволяет различить несколько фаз роста, сменяющих друг друга в определенной последовательности.

Лаг-фаза (начальная фаза). Эта фаза охватывает промежуток времени между инокуляцией и достижением максимальной скорости деления. Если инокулят взят из старой культуры (в стационарной фазе роста), то клеткам приходится сначала адаптироваться к новым условиям путем синтеза РНК, образования рибосом и синтеза ферментов. Если источники энергии и углерода в новой среде отличаются от тех, какие были в предшествующей культуре, то адаптация к новым условиям может быть связана с синтезом новых ферментов, которые ранее были не нужны и поэтому не синтезировались. Образование новых ферментов индуцируется новым субстратом. Хорошим примером влияния субстрата на синтез ферментов служит диауксия.

Экспоненциальная фаза характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток. Эта скорость зависит от вида бактерий и от среды. Величина клеток у многих бактерий остается постоянной. Но нередко клетки периодической культуры претерпевают изменения, так как постепенно изменяется среда: уменьшается концентрация субстрата, увеличивается плотность клеточной суспензии и накапливаются продукты обмена. В связи с тем, что в экспоненциальной фазе скорость деления клеток относительно постоянна, эта фаза наиболее удобна для определения скорости деления (и скорости роста). Изучая влияние факторов среды (рН, температура), а также пригодность различных субстратов, следят за увеличением числа клеток или за мутностью (экстинкцией) клеточной суспензии во время экспоненциального роста.

Стационарная фаза наступает тогда, когда число клеток перестает увеличиваться. Скорость роста зависит от концентрации субстрата — при снижении этой концентрации, еще до полного использования субстрата, скорость роста начинает снижаться. Поэтому переход от экспоненциальной фазы к стационарной происходит постепенно. Скорость роста может уменьшаться также из-за большой плотности бактериальной популяции, из-за низкого парциального давления или накопления токсичных продуктов обмена. Все эти факторы вызывают переход к стационарной фазе.

Фаза отмирания и причина гибели бактериальных клеток в нормальных питательных средах изучены недостаточно. Число живых клеток может уменьшаться экспоненциально. Иногда клетки лизируются под действием собственных ферментов (автолиз) (рис. 5).

1.5. Периодическое культивирование с подпиткой (fed batch culture).

Термин «периодическая культура с добавлением источников питания» ввели Иошида и др. для обозначения периодической культуры, в которую непрерывно добавляется питательная cреда.

Простое периодическое культивирование характеризуется ростом клеток без подачи дополнительных порций субстрата после посева культуры. Лимит субстрата или образование токсичных компонентов могут привести к снижению продуктивности процесса. Для предотвращения негативных последствий лимита субстрата применяется техника культивирования с подпиткой, при этом субстрат или другие необходимые компоненты добавляются либо непрерывно, либо по сигналу от какого-либо датчика.

Периодическая культура с добавлением источников питания развивалась эмпирически для некоторых производственных ферментационных процессов, таких, как получение пенициллина, пекарских дрожжей и удаление отходов путем ферментации.

Для оптимизации выхода продуктов, выделяемых в среду, важно усилить биосинтетическую способность клеток бактерий, а метод культивирования с подпиткой позволяет продлить вторую фазу роста и повысить выход внеклеточных метаболитов. Ограничение скорости поглощения субстрата скоростью его доставки оказывается способом преодоления «катаболитной репрессии» образования продукта. При производстве пекарских дрожжей потребление кислорода регулируется скоростью добавления сахара.

Метод периодических культур с подпиткой использовали при культивировании рекомбинантного штамма Escherichia coli для получения аналога человеческого коллагена. Культура с подпиткой оказалась наиболее эффективным путём для достижения высокой плотности клеток и высокой продуктивности.

В периодическом режиме с подпиткой концентрированным субстратом исследовалась деструкция фенола при совершенствовании процесса обезвреживания токсичных стоков ксенобиотиков с использованием гибридной системы очистки с совмещением процесса химического и биологического окисления по месту и времени.

Периодическая культура с добавлением источников питания, кроме того, моделирует некоторые природные микробные системы, как, например, инфекцию мочевых путей. Теория такой культуры показывает, что она должна иметь важное и уникальное применение в управлении ферментационными процессами.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1 Условия культивирования.

Штамм LPM-4 стерильно пересевали на скошенные косяки ЭДТА-содержащего агара и выдерживали в термостате 5 суток. Для получения инокулята осуществляли смыв культуры с косяков, засевали в жидкую среду с ЭДТА и культивировали 3−4 суток. После чего инокулят в количестве 10 мл переносили в стерильные 750-мл колбы с 200 мл стерильной жидкой среды и культивировали в течение 10 суток на качалке при 150 — 200 об/мин при температуре 28є- 30єС.

Опыт включал два этапа. Эксперимент первого этапа состоял из 8 вариантов (рис. 6), а эксперимент второго этапа — из 10 вариантов (рис. 7).

Рис. 6. Схема эксперимента первого этапа опытов.

Рис. 7. Схема эксперимента второго этапа опытов.

2.2. Методика приготовления питательных сред.

При культивировании штамма использовали среды с ЭДТА.

Твердая питательная среда используется для получения свежей культуры штамма.

Жидкую питательную среду применяли для получения посевного материала и для периодического культивирования. Твердую питательную среду готовили, как жидкую, с добавлением 3% агара.

Приготовление жидкой питательной среды.

1) MgSO₄*7 H₂0 10 мл/л.

2) CaCl₂*2 H₂O 20 мл/л.

3) KH₂PO₄ + NaH₂PO₄*12 H₂O 10 мл/л.

4) EDTA 10 мл/л.

5) Микроэлементы 1 мл/л.

(доводили до рН= 4,2) + 5,6 г/л ЭДТА:

FeCl₂*4 H₂O 1,5 г/л.

H₃BO₃ 0,06 г/л.

MnCL₂*6 H₂O 0,1 г/л.

CaCl₂*6 H₂0 0,12 г/л.

ZnCl₂ 0,07 г/л.

NiCl₂*6 H₂0 0,025 г/л.

CuCl₂*2 H₂O 0,015г/л.

Na₂MoCl₄ 0,025 г/л.

6) Витамины.

Пиридоксин 20 мг.

Тиамин 10 мг Рибофлавин 10 мг Никотиновая кислота 10 мг Р — аминобензойная кислота 10 мг Липоевая кислота 10 мг Никотинамид 10 мг Витамин В₁₂ 10 мг Биотин 4 мг Фолиевая кислота 4 мг Растворяли все компоненты в 200 мл воды, стерилизовали при 0,5 атм. 30 минут и добавляли в жидкую питательную среду в количестве 1мл/л.

Компоненты питательных сред взвешивали на технических и аналитических электронных весах и растворяли в дистиллированной воде. Опыт по приготовлению питательных сред показал, что ее удобно готовить из заранее стерилизованных концентрированных растворов.

2.3. Методы анализа..

Пробы из колб отбирали один раз в сутки и проводили измерения рН, биомассы, концентрации глюкозы, ЭДТА и аммония.

Биомассу определяли спектрофотометрически на приборе Specol 221 (Germany) при 546 нм, после подкисления анализируемой пробы 5% раствором НNO₃ до рН=2,0 для растворения солей, выпадающих в осадок в процессе культивирования. Содержание биомассы рассчитывали на основании оптической плотности клеточной суспензии используя раннее построенную калибровочную кривую.

Концентрацию ЭДТА определяли высокоэффективной жидкостной хроматографией на хроматографе HPLC (Waters. Great Britan), оснащенном колонкой Nukleosil 100 (Machery und Nagel, Germany) при 285 нм. В качестве элюента использовали раствор, содержащий Fe (NO₃)₃* 9H₂O 0,5 г/л, бромид тетрабутиламмония 0,4 г/л, HNO₃ (65%) 0,8 мл, рН 2,1. Концентрацию ЭДТА рассчитывали, используя калибровочную кривую.

Концентрацию глюкозы определяли энзиматически с использованием реактива Глюкоза ФС «ДДС» («Диакон»). Принцип метода: глюкозооксидаза катализирует окисление в-D-глюкозы кислородом воздуха с образованием эквимолярных количеств глюколактона и перекиси водорода. Пероксидаза катализирует окисление хромогенных субстратов перекисью водорода в присутствии фенола с образованием окрашенного соединения, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы в пробе и измеряется фотометрически при длине волны 500 нм. Состав реагента: буферно-ферментный раствор, который содержащит калий фосфорнокислый -250 ммоль/л, фенол — 5 ммоль/л, 4-аминоантипирин — 0,5 ммоль/л, глюкозооксидазу — 10 000 Е/л, пероксидазу — 1000 Е/л. Пробы центрифугировали при 8 000 об/мин в течение 6 минут. Затем отбирали 20 мкл надосадочной жидкости и добавляли 2 мл реагента. Пробы перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Затем измеряли оптическую плотность при 500 нм. Содержание глюкозы определяли по калибровочному графику.

Содержание ионов аммония определяли потенциометрическим методом с помощью ионселективного электрода «Эком-NH₄». Метод анализа заключается в измерении величины равновесного потенциала ионселективного электрода, погруженного в раствор анализируемого иона. Потенциал измеряют относительно электрода сравнения, с помощью иономера Экотест — 120 (ИЭЛРАН НПП ЭКОНИКС). Погружали в раствор электрод «Эком-NH₄» и электрод сравнения и измеряли значение равновесного потенциала.

2.3.1. Вычисление энергетического выхода роста штамма LPM-4.

Энергетический выход роста штамма LPM-4 вычисляли на основании теории материально-энергетического баланса роста микроорганизмов. Согласно этой теории доступными называются электроны, которые акцептируются свободным кислородом при окислении органического материала с образованием углекислого газа и воды.

Содержание доступных электронов (ДЭ) в органических соединениях удобно выражать в расчёте на один атом углерода, то есть как степень восстановлености углерода (г).

Для соединения СН_рО_nN_q величина степени восстановленности углерода вычисляется по формуле:

=4+p2n3q.

Цифра 4 означает число ДЭ углеродного атома, к ней прибавляются ДЭ водорода, число которых равно числу p, приходящихся на один атом углерода. Из этой суммы вычитаются электроны энергетически обесцененные кислородом. Их число равно удвоенному числу атомов кислорода n, приходящихся на один атом углерода, так как у кислорода валентность равна 2. Из полученной разницы вычитается утроенное число атомов азота q, так как валентность азота равна 3, а энергетическое состояние электронов, связанных с азотом, не меняется в процессе роста.

Приведём уравнение количественной связи энергетического баланса с показателем материального баланса, как выход по субстрату Y_s .

Энергетический выход (з) характеризует долю энергии субстрата, перешедшую в биомассу.

= _{в в}/ _{s s} Y_s ,.

где _в восстановленность углерода в биомассе ;

_s восстановленность углерода в субстрате ;

у_s — доля (по массе) углерода в органическом субстрате;

у_в — доля (по массе) углерода в биомассе;

_{в в}/ _{s s} отношение энергосодержания равных по весу количеств биомассы и субстрата;

_{в в} = 2, для бактерий не синтезирующих липиды;

Y_s выход клеток по массе, г/г;

Выход клеток по массе Y:

Y_x/s = Х / S ,.

где Хконцентрация биомассы, г/л;

Sколичество потребленного субстрата, г/л.

Выход клеток по массе из ЭДТА (Y_ЭДТА) рассчитывали как отношение биомассы, образованной из ЭДТА, к количеству потребленной ЭДТА. А выход клеток по массе из глюкозы рассчитывали как отношение биомассы, образованной из глюкозы, к количеству потребленной глюкозы.

Теоретический предел для энергетического выхода роста =1, так как в биомассе не может быть больше энергии, чем в использованном субстрате.

Расчет величины з для ЭДТА:

С₁₀Н₁₆О₈N₂.

г= (4*10 +16- 2*8- 3*2) / 10= 3,4.

М_(ЭДТА)= 292.

М_{(углерода)} = 120.

292 — 100%.

120 — д д = 0,410.

гд= 3,4* 0,410= 1,4.

= _s (г_bд_b / г _sд_s) = _s (2/1,4).

Расчет з для глюкозы:

С₆Н₁₂О₆ СН₂О.

г= 4+2−2= 4.

М_{(глюкоза)} =180.

М_{(углерода)} = 72.

180 — 100%.

72 — д.

д= 0,4.

гд= 4* 0,4= 1,6.

з = Х_s (2/1,6).

2.3.2. Вычисление удельной скорости роста штамма LPM-4.

Удельная скорость роста :

= (ln x₂/x₁)/(t₂-t₁) ,.

где х₂ — концентрация биомассы в конечный момент времени, мг/л;

x₁ — концентрация биомассы в начальный момент времени, мг/л;

(t₂-t₁) — промежуток времени, в течение которого возросла биомасса, ч.

Глава 3. Результаты и их обсуждение.

Известно, что бактериальный штамм LPM-4 характеризуется уникальной потребностью в ЭДТА для роста клеток и не растет на средах в отсутствие ЭДТА. Совместную ассимиляцию ЭДТА и глюкозы штаммом LPM-4 можно рассматривать как процесс кометаболизма, при котором ЭДТА является ростовым субстратом, а глюкоза косубстратом, ее метаболизм зависит от присутствия ЭДТА.

Опыт проводили в два этапа:

1) Исследование влияния степени деградации ЭДТА на ассимиляцию глюкозы бактериальным штаммом LPM-4;

2) Исследование способности штамма LPM-4 к ассимиляции ЭДТА и глюкозы в процессе длительного культивирования с добавлением субстрата.

3.1. Исследование влияния степени деградации ЭДТА на ассимиляцию глюкозы бактериальным штаммом LPM-4.

Бактерии выращивали на ЭДТА-содержащей среде с добавлением глюкозы в различные периоды культивирования: до посева или на 1, 2, 3, 4, 5, и 6 сутки роста клеток (рис. 6).

3.1.1 Динамика роста и потребления глюкозы и ЭДТА бактериальным штаммом LPM-4.

Данные об изменении плотности биомассы, рН, концентрации ЭДТА и аммония в различных вариантах сред представлены в таблицах 1−8.

Во всех вариантах опыта деградация ЭДТА отмечалась уже на 1 сутки роста и заканчивалась на 3 сутки, независимо от присутствия глюкозы в среде. Таким образом, можно сделать заключение, что присутствие косубстрата (глюкозы) не оказывало влияния на деградацию ростового субстрата (ЭДТА).

При внесении глюкозы в среду до посева бактерий (вариант 2) потребление глюкозы началось только на 3 сутки роста, после полной деградации ЭДТА, и закончилось на 8 сутки роста (приложение 2, рис. 3.1.1.1). Можно предположить, что энергия, образующаяся в процессе деградации ЭДТА, используется клетками для индукции ферментов метаболизма глюкозы или для ее транспорта. Потребление глюкозы сопровождалось увеличением плотности биомассы в два раза по сравнению с контролем.

При внесении глюкозы в среду на 1 сутки роста бактерий (вариант 3) динамика ее ассимиляции была такой же, как в варианте 2. Потребление глюкозы началось после исчерпания ЭДТА из среды (3 сутки), закончилось на 8 сутки культивирования и привело к двукратному увеличению плотности биомассы (приложение 3, рис. 3.1.1.2).

Иная картина ассимиляции глюкозы наблюдалась при ее внесении в среду на 2 сутки роста бактерий, когда остаточная концентрация ЭДТА снизилась в 1,7 раза (вариант 4). Потребление глюкозы началось только на 4 сутки, затем наблюдалась длительная лаг фаза, когда концентрация глюкозы в среде не изменялась; интенсивная ассимиляция глюкозы происходила с 6 до 10 суток культивирования (приложение 4, рис. 3.1.1.3).

При внесении глюкозы в среду на 3 сутки роста клеток, когда деградация ЭДТА закончилась (вариант 5), глюкоза не потреблялась в течение 6 суток и только с 9 суток началась ее интенсивная ассимиляция (приложение 5, рис. 3.1.1.4). Таким образом, при внесении косубстрата в период, когда закончен метаболизм ростового субстрата, индукция ассимиляции косубстрата требует длительной лаг фазы, вероятно, из-за недостатка энергии.

При внесении глюкозы в среду на 46 сутки культивирования (варианты 6, 7 и 8), т. е. через 1, 2 и 3 суток после полного потребления ЭДТА, не обнаружено ее ассимиляции (приложение 6−8, рис. 3.1.1.53.1.1.7).

3.1.2. Динамика накопления биомассы и удельная скорость роста штамма LPM-4.

На рис. 3.1.2.1. представлена динамика накопления биомассы и удельная скорость роста штамма LPM-4 при культивировании на среде с ЭДТА. Как видно из рисунка, максимальная удельная скорость достигается на 2 сутки и составляет 0,042 ч^-1.

В случае, когда добавляли глюкозу в среду до посева (рис. 3.1.2.2), максимальная удельная скорость была выше, чем в контроле, и составляла 0,057 ч^-1 (2 сутки). При добавлении глюкозы в среду на 1 и 3 сутки роста бактерий (рис. 3.1.2.3. 3.1.2.5.) наблюдалось два (а при добавлении глюкозы на 2 сутки — три) пика удельных скоростей. Первый пик характеризует рост за счет потребления ЭДТА. В варианте 3 (рис. 3.1.2.3.) он составляет 0,055ч^-1 (2 сутки), в варианте 4 (рис. 3.1.2.4.) -0,049 ч^-1, а в варианте 5 (рис. 3.1.2.5.) — 0,042 ч —¹. Второй пик удельной скорости роста — за счет потребления глюкозы — был значительно ниже, чем за счет потребления ЭДТА. Максимальная удельная скорость роста за счет потребления глюкозы в третьем варианте составила 0,007 ч^-1, в четвертом -0,006ч^-1 и 0,016 ч^-1, а в пятом -0,022 ч^-1. Таким образом, добавление в среду глюкозы на 13 сутки приводит к повторному увеличению скорости роста бактерий, но в значительно меньшей степени, чем при начальной ассимиляции ЭДТА.

Наибольшее значение удельной скорости роста характерно для варианта, когда глюкоза добавлялась в среду до посева бактерий. Следовательно, время добавления косубстрата в среду значительно влияет на скорость роста бактерий.

3.1.3. Накопление аммония в процессе роста штамма LPM-4.

Анализируя рис. 3.1.3., можно сделать вывод, что концентрация аммония в среде увеличивается по мере деградации ЭДТА, поскольку ионы аммония — продукты деградации ЭДТА. Во всех вариантах концентрация аммония достигает максимального значения и остается на постоянном уровне в течение нескольких дней. Снижение концентрации аммония при длительном культивировании бактерий объясняется, по-видимому, тем, что клетки потребляют его .

При добавлении глюкозы снижение концентрации ионов аммония начинается раньше, чем в контроле. Интересен тот факт, что накопление аммония в процессе роста штамма LPM-4 на средах с добавлением глюкозы до посева и на 1 сутки роста бактерий происходит сходным образом, причем концентрация аммония в опытах значительно меньше таковой в контроле. Концентрация аммония в опыте на среде с добавлением глюкозы на 2 и 3 сутки роста также ниже контроля. Вероятно, это связано с тем, что аммоний используется для роста клеток в присутствии глюкозы.

3.1.4. Показатели роста штамма LPM-4 при кометаболизме ЭДТА и глюкозы.

В таблице 3.1.4. представлены сравнительные результаты показателей роста штамма LPM-4 на различных вариантах сред. На средах с глюкозой суммарная биомасса включает биомассу, образованную как за счет потребления ЭДТА, так и за счет потребления глюкозы. Поскольку концентрация ЭДТА во всех вариантах сред была одинаковой (0,873 г/л), можно предположить, что количество биомассы, образованной из ЭДТА на средах с глюкозой, было таким же, как в контроле (0,196 г/л). Следовательно, если вычесть из суммарной биомассы количество биомассы, образованной из ЭДТА, мы получим количество биомассы, образованной из глюкозы.

Из таблицы видно, что наибольший выход клеток по массе из глюкозы достигается на среде с добавлением глюкозы на 3 сутки роста бактерий. Поскольку ЭДТА и глюкоза характеризуются различным энергосодержанием, правильнее сравнивать выход из этих субстратов не по массе, а по энергии. С этой целью рассчитывали энергетический выход клеток. Наибольший выход биомассы по энергии из глюкозы характерен для опыта на среде с добавлением глюкозы на 3 сутки роста бактерий.

Таким образом показано, что бактериальный штамм LPM-4, облигатный деструктор ЭДТА, не может использовать глюкозу в качестве единственного источника углерода и энергии, но способен метаболизировать ее в присутствии ЭДТА. Установлено, что ЭДТА индуцирует ассимиляцию глюкозы и является источником азота для роста клеток на глюкозе. Индукция ассимиляции неростового субстрата у штамма LPM-4 требует продолжительной лаг-фазы и сопряжена с деградацией ЭДТА. Явление совместного метаболизма ЭДТА и глюкозы можно назвать кометаболизмом.

Кометаболизм — трансформация неростового субстрата в присутствии ростового субстрата или иного метаболизируемого соединения. В данном Таблица 3.1.4.

Показатели роста штамма LPM-4 при ассимиляции ЭДТА и глюкозы.

случае ростовым субстратом является ЭДТА, а неростовым — глюкоза. Из четырех известных типов кометаболизма штамм LPM-4 способен к третьему типу кометаболизма, когда процессы ассимиляции неростовых субстратов сопряжены с использованием ростовых субстратов, в результате чего соединения углерода включаются в компоненты клетки.

Не обнаружено ассимиляции глюкозы при ее внесении в среду через 13 сут после потребления ЭДТА.

3.2 Исследование способности штамма LPM-4 к ассимиляции ЭДТА и глюкозы в процессе длительного культивирования с добавлением субстрата.

В предыдущем разделе было показано, что ассимиляция глюкозы бактериальным штаммом LPM-4 индуцируется в процессе деградации ЭДТА, а кометаболизм ЭДТА и глюкозы у штамма LPM-4 не оказывает влияния на деградацию ЭДТА.

В данном разделе целью работы было исследование:

1) сохраняется ли способность клеток к деградации ЭДТА при дополнительном внесении ЭДТА в среду;

2) сохраняется ли ЭДТА-индуцированная способность клеток ассимилировать глюкозу в процессе длительного культивирования с добавлением глюкозы;

3) сохраняется ли способность штамма LPM-4 к переключению метаболизма от ассимиляции глюкозы к ассимиляции ЭДТА в процессе длительного культивирования в присутствии глюкозы.

Схема эксперимента представлена на рисунке 2.1.2.

В первой серии опытов бактерии выращивали на среде с ЭДТА (вариант 1); затем дополнительно вносили ЭДТА на 4 сутки (вариант 2) и на 6 сутки (вариант 3) роста бактерий.

Во второй серии опытов бактерии выращивали на среде, содержащей ЭДТА и глюкозу (вариант 4) и дополнительно вносили глюкозу на 9 сут (вариант 6), 13 сут (вариант 8) и 21 сут (вариант 10).

В третьей серии опытов бактерии выращивали на среде с ЭДТА с подпиткой глюкозой; после потребления глюкозы вносили ЭДТА на 9 сут (вариант 5), 13 сут (вариант 7) и на 21 сут (вариант 9).

3.2.1. Исследование ассимиляции ЭДТА штамма LPM-4 в процессе культивирования с добавлением ЭДТА.

Описание: Культуру выращивали на среде с ЭДТА (вариант 1 — контроль). Ассимиляция ЭДТА происходила достаточно быстро и закончилась на четвертые сутки роста (рис. 3.2.1.1, приложение 9), при этом наблюдался рост биомассы до 0,190 г/л. На четвертые сутки роста культуры добавили ЭДТА (вариант 2). При этом культура потребила ЭДТА очень быстро, на следующие сутки присутствовали лишь следы этого соединения, а прирост биомассы составил 0,244 г/л. На шестые сутки роста культуры, то есть через сутки после потребления ЭДТА, еще раз добавили ЭДТА (вариант 3). В данном случае потребление ЭДТА проходило медленно, и ассимиляция его закончилась только на 12 сутки роста; биомасса начала расти только на 10 сутки и достигла максимального значения 0,661 г/л на 12 сутки. После потребления ЭДТА наступила стационарная фаза и дальнейшего роста клеток уже не происходило. Прирост биомассы в варианте 3 составил 0,287 г/л, что гораздо выше, чем в предыдущих вариантах.

Задержка потребления ЭДТА и роста бактерий в варианте 3 возможно объясняется тем, что в течение 1-суточного голодания по ЭДТА произошло снижение активности фермента, ответственного за деградацию ЭДТА.