Пробоподготовка при исследовании биожидкостей

Наиболее сложным объектом в ХТА является биологический материал и, главным образом, материал животного происхождения: внутренние органы, ткани трупа человека, кровь, пищевые продукты.

Современные методы анализа позволяют идентифицировать вещество с высокой скоростью и точностью. Однако инструментальному методу анализа предшествует проботодготовка — отделение мешающих проведению анализа компонентов и концентрирование определяемых веществ. Именно этот этап является наиболее трудоемким и содержит главные источники ошибок анализа. Пробоподготовку следует выполнять очень аккуратно и последовательно с учетом дальнейшего метода идентификации и количественного определения яда.

Химико-токсикологический анализ с использованием высокочувствильных методов на современных, часто очень дорогостоящих приборах: ВЭЖХ, ГЖХ, атомно — адсорбционном и плазменном спектрофотометрах, ионном хроматографе и т. д. — требует очень тщательной пробоподготовки. Плохо подготовленные образцы приводят не только к искажению истинного значения яда, но могут вывести из строя сам прибор. Выбор оптимального способа подготовки пробы в каждом конкретном случае определяется методом анализа и характером анализируемых веществ. Современные методы пробоподготовки учитывают эти подходы.

При диагностике отравлений в судебно — химических исследованиях преимущественно анализируют кровь, мочу, ткани различных органов. В крови и моче содержание определяемых токсических веществ и их метаболитов может быть ниже предела обнаружения. В этих биожидкостях присутствуют фоновые эндогенные соединения: белки, жиры, пептиды, аминокислоты, углеводы, стероиды, пигменты. Яд должен быть отделен от белков и липидов, с которыми он может быть прочно связан по лигандорецепторному механизму. Изолирование токсиканта обычно приводит к увеличению его концентрации в пробе. Следовательно, под термином «изолирование» следует понимать процесс выделения токсиканта из биоматериала, его очистку от эндогенных веществ и концентрирование в анализируемой пробе.

При поступлении биоматериала на анализ его подвергают визуальному осмотру.

Визуальный осмотр. При исследовании внутренних органов трупа важно установить, какие именно органы доставлены на анализ.

Необходимо установить факт консервирования и природу консерванта. При транспортировке объекта на большие расстояния допускается консервирование только чистым этиловым спиртом. Если консервация проведена этанолом то перед минерализацией пробы серной или азотной кислотой необходимо его удалить. Чаще всего о консервации сообщают в акте судебномедицинского исследования или других сопроводительных документах. При этом проба консерванта прилагается. Консервация формалином, глицерином, фенолом и другими веществами рассматривается как «преступная» халатность. Такое вещество, как формалин, само является ядом и входит в круг химического исследования. Кроме того, он затрудняет обнаружение метилового спирта, аналитические реакции которого основаны на превращение его в формальдегид, способствует уничтожению ряда химических веществ.

В ходе визуального осмотра отмечают цвет содержимого желудка. Пурпурный или розовый цвет содержимиго может быть связан с отравлением перманганата калия. В случае отравления солями меди наблюдается окрашивание содержимого желудка пострадавшего в зеленый или голубой цвет. При отравлении солями никеля — в зеленый, а солями кобальта — в розовый цвет. Окрашивание содержимого желудка в желтый цвет позволяет предположить отравление азотной или пикриновой кислотой.

При отравлении может наблюдаться изменение окрашивания или запаха мочи. Красно-коричневый цвет моча имеет при отравлении производными пиразола, фенотиазина. Фенол и метиленовая синь меняют цвет мочи на зелено-синий, а фенацетин, рибофлавин — на желтый.

Пробоподготовка мочи. После визуального осмотра мочи проводят предварительные испытания с отдельными порциями пробы. В случае отрицательного результата исследование на невыявленные группы токсикантов не проводят.

Часть анализируемой мочи смешивают с органическими растворителями при разных значениях pH среды.

Еще одну порцию мочи нагревают в течение 30 минут с концентрированной соляной кислотой для гидролиза химических веществ, вызвавших отравление. Затем пробу охлаждают, подщелачивают и проводят экстракцию соответствующими органическими растворителями.

Полученные экстракты раздельно испаряют на часовых стеклах, затем сухие остатки рассматривают визуально и под микроскопом. Каждый из остатков исследуют методом тонкослойной хроматографии, в том числе в системах.

К точно фиксированному объему биожидкости (обычно около 500 мкл) добавляют отмеренное (около 10% по объему) количество раствора образца сравнения в D2O известной концентрации. Чаще всего в качестве такого образца используют 3-триметил-[2,2,3,3−2Н4]-пропионат натрия.

На основе интенсивностей по стандартной методике рассчитываются концентрации всех соединений. Положение сигналов основных компонентов сильно зависит от pH образца и температуры регистрации Поэтому, чтоб такие измерения можно было сравнивать между собой, оба эти параметра должны быть строго стандартизированы. В вязи с этим перед регистрацией к образцу добавляют стандартное количество фосфатного буферного раствора.