Первичные радикалы. 
Свободные радикалы и антиоксиданты

Первичное образование супероксида фагоцитами

Основным источником первичных радикалов в нашем организме служат клетки-фагоциты, т. е. гранулоциты и моноциты крови, а также тканевые макрофаги. Для борьбы с бактериями эти клетки образуют супероксидные радикалы НАДФН + 2О₂ НАДФ⁺ + 2(*О₂^-),.

которые затем превращаются в перекись водорода и гипохлорит.

2(*О₂) Н₂О₂ + О₂

Н2О2 + Cl^- H₂O + ClO^-

Образование всех этих веществ, называемых активными формами кислорода, может изучаться путем регистрации хемилюминесценции в присутствии люминола или люцигенина. Люцигенин более специфичен, хемилюминесценция в его присутствии определяется концентрацией супероксидных радикалов. Хемилюминесценция люминола наблюдается, только если наряду с супероксидными радикалами в среде образуются радикалы гидроксила. Гипохлорит также вызывает хемилюминесценцию при наличии люминола в среде, которая может многократно усиливаться, если наряду с гипохлоритом в системе имеется перекись водорода [1].

Рис. 1. Хемилюминесценция клеток крови в присутствии люминола после действия на кровь электрических импульсов разного напряжения (цифры около кривых, Вольты).

На рисунке 1 в качестве примера показана хемилюминесценция клеток крови при действии на кровь кратковременных электрических импульсов, вызывающих увеличение проницаемости клеточных мембран и стимуляцию выделения клетками активных форм кислорода. Такие же «хемилюминесцентные ответы» можно получить, если добавить к лейкоцитам крови суспензию бактерий, изолированные оболочки дрожжевых клеток, кристаллы кварца или сульфата бария, а также определенные химические соединения; все эти агенты получили собирательное название «стимулов». Стимулированная ХЛ клеток в присутствии люминола — ценный показатель функционального состояния фагоцитов крови и тканей, их способности производить при необходимости активные формы кислорода, т. е. выполнять свою защитную функцию [26]. Эта способность обычно усиливается при возникновении в организме очагов воспаления (например, после инфаркта миокарда) и в ряде других случаев. Наоборот, при длительном недостатке кислорода, связанном с общим ослаблением организма, активность фагоцитов и ХЛ-ответы снижаются [25,26,50]. Некоторые результаты таких исследований даны в качестве примера на рис. 2 и 3.

Объяснения в тексте.

Рис. 3. Хемилюминесценция цельной крови, осажденной на сульфате бария

Объяснения в тексте.

Можно видеть, что при затяжных хронических заболеваниях свечение клеток снижалось, тогда как при возникновении или обострении воспалительного процесса у больных происходило резкое увеличение активности клеток-фагоцитов. Так встречает организм инфекционную опасность — усиливается способность фагоцитов выделять активные формы кислорода для борьбы с чужеродными микроорганизмами.

Механизм активации фагоцитов при возникновении в организме очагов воспаления включает в себя как изменение свойств этих клеток в условиях целого организма, так и активацию уже готовых клеток, которую можно назвать «предстимуляцией» (priming).

В последние время механизмы регуляции активности фагоцитов привлекают все большее внимание в частности потому, что эти клетки не только борются с микробами, но и участвуют в регуляции кровяного давления, выделяя окись азота.

Оказалось, что важную роль в увеличении потенции клеток играет внутриклеточный кальций. При инкубации клеток с кальциевым ионофором происходит их предстимуляция (priming), т. е. 2−3 кратное увеличение продукции активных форм кислорода в ответ на добавление стимула. Г. И. Клебановым и сотрудниками в нашей лаборатории было показано, что предстимуляцию вызывают продукты перекисного окисления липидов [34]. Позднее в наших исследованиях было показано, что увеличение потенции фагоцитов может быть вызвано также в результате облучения клеток светом гелий-неонового лазера, причем как в присутствии, так и в отсутствии экзогенных фотосенсибилизаторов [47]. В последнем случае эффект был существенно разным у разных групп больных людей. Недавно было показано, что это строго коррелирует с количеством гематопорфирина в плазме крови больных: чем больше гематопорфирина, тем выше была эффективность лазерного облучения. Эти наблюдения позволили дать объяснение известному терапевтическому действию лазерного облучения крови, которое проявляется в расслаблении стенок кровеносных сосудов (вазодилатации) и повышении антибактериальных свойств крови. Наше объяснение состоит в том, что под действием лазерного облучения происходит фотосенсибилизированное гематопорфирином перекисное окисление липидов в плазме крови и мембранах клеток и образующиеся продукты липопероксидации вызывают priming фагоцитов крови. Клетки начинают выделять больше активных форм кислорода, что усиливает их антибактериальное действие и образование окиси азота, что вызывает вазодилатацию. радикал биохимический электронный метаболизм.

Метаболизм супероксидного радикала

Дальнейшие превращения супероксидного радикала могут пойти по разному пути (см. рис. 4). В норме (на рисунке эти процессы выделены пунктирной рамкой) супероксид под действием фермента супероксид-дисмутазы (СОД) превращается в перекись водорода (2), которая используется в частности для синтеза гипохлорита (3) или же разлагается нерадикальным путем под действием двух других защитных ферментов: каталазы и глутатион-пероксидазы (4). При недостаточной активности супероксиддисмутазы возможны другие, нежелательные реакции супероксида. Взаимодействуя с окисью азота, супероксид образует весьма токсическое соединение — пероксинитрит (5), который может повреждать клетки эндотелия и нарушать регуляцию кровяного давления. В присутствии ионов негемового железа супероксид восстанавливает трехвалентное железо (6) до двухвалентного (7), которое весьма токсично, т. к. разлагает перекиси липидов (8), перекись водорода (9) и гипохлорит (10) с образованием весьма активных вторичных радикалов липидов и гидроксила, к чему мы вернемся позже. Все это указывает на важнейшую роль супероксиддисмутазы в качестве антирадикального защитного фермента.

Инактивация и фотореактивация СОД

К сожалению, этот фермент может инактивироваться в очагах патологии. В работе, проведенной совместно с О. А. Азизовой и Е. А. Горбатенковой, нами было показано, что Cu-Mn-СОД довольно быстро инактивируется при сравнительно небольшом снижении рН (до рН 5.9−6.0). Нами было обнаружено интересное явление фотореактивации этого фермента под действием интенсивного (лазерного) облучения [5,46]. Исследования, проведенные на СОД и медных комплексах гистидина методами спектрофотометрии и ЭПР позволили предположить следующую схему действия низких рН и света на СОД [4,46].

При низких значениях рН происходит протонирование гистидина 61, входящего в активный центр фермента, в результате чего разрывается связь азота имидазольного кольца с ионом цинка и фермент инактивируется (там же). Повышение рН или освещение приводят к депротонированию гистидинового остатка и восстановлению ферментативной активности. По-видимому, фотореактивация СОД может внести вклад в хорошо известное терапевтическое действие лазерного облучения крови и ран [33].

Реакции окиси азота

В последнее время большое внимание привлекает еще один первичный радикал — окись азота, синтезируемая клетками эндотелия и принимающая участие в регуляции тонуса стенок кровеносных сосудов и кровяного давления. По-видимому, один из естественных путей удаления избытка этого высокоактивного соединения — это его связывания гемоглобином и последующее окисление. NO-комплексы гемоглобина удобно изучать методом ЭПР, поскольку они обладают характерными сигналами при температуре жидкого азота. В исследованиях, проведенных А. Н. Осиповым и Г. Е. Борисенко в нашей лаборатории методом низкотемпературной ЭПР-спектроскопии и спиновых ловушек, было обнаружено, что NO-комплексы гемоглобина обладают светочувствительностью и распадаются с выделением окиси азота [39]. Заманчиво предположить, что механизм фоторелаксации (расслабление стенок кровеносных сосудов под действием сильного света) и терапевтического действия лазерного облучения крови (которое тоже отчасти связано с сосудорасширяющим действием облучения) также связано с фотохимическим освобождением окиси азота из комплексов с гемсодержащими белками.