Вклад отдельных генетических механизмов в эволюцию прокариот

Выше мы рассмотрели организацию генетического аппарата прокариот, осуществляющего передачу генетической информации от одного поколения к следующему, т. е. по «вертикали», обратив внимание на такие его черты, как стабильность и точность функционирования. Однако стабильность генетического аппарата не абсолютна и при всей надежности изменения являются его неотъемлемым свойством. Для прокариот характерна большая способность к генетическим изменениям, являющимся результатом мутаций, а также развития путей «горизонтального» переноса генов между бактериальными клетками.

Закономерности и вклад различных процессов в эволюцию прокариот проще представить, если рассматривать их применительно к некой достаточно генетически однородной популяции организмов. Генетический состав такой популяции называется генофондом и по отношению к ней эволюцию можно определить как изменения в генофонде, происходящие в результате действия определенных генетических механизмов и отбора.

Новые наследственные признаки возникают в генофонде в результате генных мутаций. Последние создают фонд наследственных изменений, служащих исходным материалом (сырьем) для эволюции. Вероятно, мутации являются и самым первым видом наследственной изменчивости, возникшим одновременно с началом функционирования ДНК как информационной молекулы, поскольку для них не нужно никаких дополнительных структур и механизмов. Способность к мутированию заложена в химическом строении молекулы ДНК, а проявление мутационных изменений идет по тем же каналам, что и обычная генетическая информация клетки. Возможно, в течение длительного времени мутационные изменения были единственной формой изменчивости. На протяжении миллионов лет мутации в сочетании с естественным отбором сыграли решающую роль в появлении тех видов бактерий, которые известны сейчас.

Скорость эволюции определялась частотой возникновения мутаций. Можно только предполагать, что в начале биологической эволюции частота мутаций была значительно выше, чем в настоящее время, а соотношение «полезных» для организма мутаций к «вредным» сдвинуто в сторону первых. В пользу повышенной частоты мутирования на раннем этапе эволюции говорит тот факт, что в тот период значительно интенсивнее было действие на прокариотную клетку коротковолнового излучения при отсутствии у нее защитных приспособлений в виде соответствующих репарационных механизмов.

Следующее важное приобретение — сформирование механизмов обмена генетическим материалом, принадлежащим разным особям, «по горизонтали», и возникновение на базе этого особей с рекомбинантным геномом. При генетических рекомбинациях новых генов в генофонде, как правило, не появляется. В этом их принципиальное отличие от мутаций. Значение генетических рекомбинаций в том, что в результате этого обеспечивается возможность объединения разных генов и создание разных вариантов генных сочетаний в геноме прокариотной клетки. Поскольку отбор действует на всю совокупность признаков организма, генетическая рекомбинация поставляет дополнительный материал для действия отбора, ускоряя таким образом процесс эволюции.

Особенность организации генетической информации в мире прокариот — рассредоточение большого ее объема в нехромосомных элементах. Из этого следуют две существенно различающиеся возможности «горизонтального» обмена генетической информацией: первая связана с хромосомной, вторая — нехромосомной ДНК. Из трех основных процессов, приводящих у прокариот к обмену хромосомной ДНК, наиболее совершенным является процесс конъюгации, так как он обеспечивает возможность более полного обмена генетическим материалом двух клеток. (При благоприятных условиях возможно вхождение в реципиентную клетку всей донорной ДНК.) Однако эффективность механизмов генетической рекомбинации в этих процессах высока для близкородственных прокариотных организмов. Обмен участками хромосомной ДНК у бактерий в большинстве случаев ограничен пределами одного вида. Возможность «горизонтальной» передачи генетической информации на большие таксономические расстояния реализуется при переносе нехромосомных молекул ДНК, способных к автономной репликации.

1. Организация прокариотической клетки. Размножение прокариот Прокариоты — это организмы, в клетках которых отсутствует оформленное ядро. Функции ядра выполняет нуклеоид (то есть «подобный ядру»); в отличие от ядра, нуклеоид не имеет собственной оболочки. Одним из представителей эубактерий является кишечная палочка (Escherichia coli). Кишечная палочка составляет значительную часть содержимого толстого кишечника человека, а также кишечника других животных. Эти бактерии вырабатывают некоторые витамины и препятствуют развитию патогенных бактерий. Однако некоторые формы кишечной палочки вызывают воспаления кишечника — энтериты. Кишечная палочка встречается и вне организма человека: в воде и почве. Кишечная палочка широко используется в биотехнологии. Общая характеристика прокариот Тело прокариот, как правило, состоит из одной клетки. Размеры прокариотических клеток изменяются от 0,1−0,15 мкм (микоплазмы) до 30 мкм и более. Большинство бактерий имеет размеры 0,2−10 мкм. Однако при неполном расхождении делящихся клеток возникают нитчатые, колониальные и полинуклеоидные формы (бактероиды). В прокариотических клетках отсутствуют постоянные двумембранные и одномембранные органоиды: пластиды и митохондрии, эндоплазматическая сеть, аппарат Гольджи и их производные. Их функции выполняют мезосомы — складки плазматической мембраны. В цитоплазме фотоавтотрофных прокариот имеются разнообразные мембранные структуры, на которых протекают реакции фотосинтеза. Иногда их называют бактериальными хроматофорами. Специфическим веществом клеточной стенки прокариот является муреин, однако у некоторых прокариот муреин отсутствует. Поверх клеточной стенки часто имеется слизистая капсула. Пространство между мембраной и клеточной стенкой служит резервуаром протонов при фотосинтезе и аэробном дыхании. У подвижных бактерий имеются жгутики, основой которых служит белки флагеллины. В естественных условиях мутанты, лишенные клеточной стенки, нежизнеспособны. Поэтому такие мутанты широко используются в биотехнологии, поскольку не могут существовать вне лабораторных условий (это один из аспектов генетической безопасности). Специфика строения прокариотической клетки позволяет выделить прокариот в отдельное надцарство (или доминион) живой природы. Изучено около 3 тысяч видов прокариотических организмов: эубактерии, архебактерии, спирохеты, риккетсии, микоплазмы, миксобактерии, актиномицеты, цианобактерии, а также организмы с неопределенным систематическим положением. Это виды, которые культивируются в лабораторных условиях. Однако существуют прокариоты, которые не выделены в виде чистых культур. Поэтому истинное их видовое разнообразие может достигать 10…100 тысяч видов, а, может быть, и намного больше. Для оценки уровня биоразнообразия прокариот используются методы метагеномики. Метагеномика — раздел систематики микроорганизмов, основанный на выделении фрагментов ДНК не отдельных биологических видов, а микробоценозов (сообществ микроорганизмов). Экология прокариот определяется типами обмена веществ. Свободноживущие гетеротрофные прокариоты (сапротрофы) должны полностью обеспечивать себя всеми необходимыми веществами. Такие организмы называются прототрофными. Однако вследствие мутаций (включая делеции протяженных участков ДНК; у кишечной палочки возможна потеря 15% генома) возникают ауксотрофные биотипы. Например, ауксотрофы по лейцину не могут самостоятельно синтезировать лейцин, а ауксотрофы по биотину не могут синтезировать биотин. Двойные и множественные ауксотрофы нуждаются в поступлении двух и более необходимых органических веществ извне. В естественных условиях мутанты-ауксотрофы могут существовать только при наличии недостающих веществ во внешней среде (например, при переходе к комменсализму или паразитизму). Ауксотрофы широко используются в биотехнологии, поскольку не могут существовать вне лабораторных условий (это один из аспектов генетической безопасности). В природных условиях прокариоты образуют популяции (генетические неоднородные множества организмов одного вида) и сообщества из разных видов (микробоценозы). Тогда возможно явление протокооперации: мутант-ауксотроф может восполнять дефицит необходимых веществ за счет взаимодействия с прототрофами по данному веществу. Размножение прокариот Бесполое (вегетативное) размножение прокариот происходит путем деления клеток, которое называется дроблением. У некоторых прокариот (актиномицеты) бесполое размножение происходит с помощью спор (конидий).

При размножении бактерий в искусственных условиях (в ограниченном объеме питательной среды) в развитии культуры выделяется 4 периода, или фазы. 1 фаза — лаг-фаза. Численность бактерий увеличивается очень медленно (иногда даже снижается). Бактерии как бы осваивают новую среду. 2 фаза — фаза экспоненциального роста. Численность бактерий увеличивается лавинообразно, в геометрической прогрессии. 3 фаза — стационарная фаза. Численность бактерий стабилизируется. 4 фаза — фаза отмирания. Численность бактерий начинает уменьшаться и вскоре активных бактерий не остается. Наличие стационарной фазы и фазы отмирания связано с уменьшением концентрации питательных веществ и накоплением вредных продуктов обмена. У некоторых видов известен половой процесс (конъюгация). При конъюгации одна из клеток передает генетическую информацию другой клетке. При этом увеличения числа особей не происходит. Перенос генетической информации может происходить с помощью вирусов (трансдукция) или путем прямого переноса ДНК через мембрану (трансформация).

2. Геномика прокариот (на примере кишечной палочки Escherichia coli) Основу генома кишечной палочки составляют кольцевые молекулы ДНК: прокариотические хромосомы и плазмиды. Множество молекул ДНК образует две взаимосвязанные подсистемы: хромосомную и плазмидную. Хромосомная подсистема прокариотического генома Основу хромосомной подсистемы прокариотического генома составляет прокариотическая (бактериальная) хромосома (генофор), входящая в состав нуклеоида — ядерноподобной структуры. Нуклеоид по морфологии напоминает соцветие цветной капусты и занимает примерно 30% объема цитоплазмы. Бактериальная хромосома представляет собой кольцевую двуспиральную правозакрученную молекулу ДНК, которая свернута во вторичную спираль. Вторичная структура хромосомы поддерживается с помощью гистоноподобных (основных) белков и РНК. Точка прикрепления бактериальной хромосомы к мезосоме (складке плазмалеммы) является точкой начала репликации ДНК (эта точка носит название сайта OriC). Бактериальная хромосома удваивается перед делением клетки. Репликация ДНК идет в две стороны от сайта OriC и завершается в точке TerC. Молекулы ДНК, способные себя воспроизводить путем репликации, называются репликоны. В прокариотических хромосомах число сайтов OriC может быть увеличено, например, у сенной палочки Bacillus subtilis их не менее двух. Длина прокариотической хромосомы составляет несколько миллионов нуклеотидных пар (мпн); например, минимальная длина ДНК прокариотической хромосомы E. coli штамма MG1655 составляет 4 639 221 пн (физическая длина около 1,5 мм). У разных прокариот размер генома изменяется от до 0,5 до 6 мпн: Примерно 11% ДНК прокариотической хромосомы E. coli представлено «некодирующими» (нетранскрибируемыми) последовательностями. Остальные 89% ДНК транскрибируются или могут транскрибироваться с образованием РНК. Примерно 75% транскрипционных единиц ДНК (участок ДНК от промотора до терминатора) содержит 1 ген (обычно это гены «домашнего хозяйства», то есть гены, необходимые для поддержания жизнедеятельности клетки), остальные 25% представляют собой опероны (геном E. coli содержит 600…700 оперонов). У типичных прокариот (например, у кишечной палочки) в неделящейся клетке имеется одна бактериальная хромосома. Поэтому прокариоты в целом являются гаплоидами (гаплобионтами). У гаплоидов каждый ген представлен одним аллелем, поэтому в целом к прокариотам неприменимы понятия «доминантности» и «рецессивности»: любой аллель проявляется в фенотипе, если данный ген экспрессируется (наблюдается моноаллельное наследование). В лаг-фазе в клетке имеется одна бактериальная хромосома, но в фазе экспоненциального роста ДНК реплицируется быстрее, чем происходит деление клетки; тогда число бактериальных хромосом на клетку увеличивается до 2…4…8. Такое состояние генетического аппарата называется полигаплоидностью. При делении клетки сестринские копии бактериальной хромосомы равномерно распределяются по дочерним клеткам с помощью мезосомы. Механизм сегрегации хромосомной подсистемы прокариотического генома обеспечивает полное сохранение объема и качества генетической информации, содержащейся в бактериальной хромосоме. В результате происходит прямое наследование признаков Например, если в популяции нормальных прокариот (прототрофных, «дикого типа») в одной из клеток возникает мутация, определяющая неспособность синтезировать аминокислоту лейцин, то все потомство (клон, штамм) этой клетки не может существовать на среде, лишенной лейцина (сохраняет ауксотрофность по лейцину). Из генетически гетерогенной популяции прокариот возможно выделение штаммов (клонов, генетически однородных чистых линий), сохраняющих гаплотип бактериальной хромосомы исходной клетки. В чистых линиях прокариот рекомбинация не происходит. Поэтому невозможно появление новых гаплотипов, новых сочетаний признаков. Например, существуют устойчивые двойные ауксотрофы по биотину и метионину. В некоторых случаях один и тот же ген прокариотической хромосомы может быть представлен двумя копиями. Такие клетки (гетерогеноты) могут нести доминантные и рецессивные аллели одного гена. Тогда наблюдается диаллельное наследование, например, нормальный аллель прототрофности по лейцину доминирует над мутантным аллелем ауксотрофности. Плазмидная подсистема прокариотического генома Кроме бактериальной хромосомы в состав генома прокариот входят плазмиды — кольцевые молекулы ДНК длиной в тысячи п.н. Плазмиды такого размера содержат несколько десятков генов. Обычно это «гены роскоши», обеспечивающие устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам, кодирующие специфические токсины, а также гены конъюгации и обмена генетическим материалом с другими особями. Известны также мелкие плазмиды длиной 2…3 тпн, кодирующие не более 2 белков. У многих бактерий открыты мегаплазмиды длиной порядка миллиона пн, то есть немногим меньше бактериальной хромосомы. Существуют плазмиды, представленные одной копией — они реплицируются синхронно с ДНК бактериальной хромосомы. Другие плазмиды могут быть представлены многими копиями, и их репликация происходит независимо от репликации бактериальной хромосомы. Репликация свободных плазмид часто протекает по принципу «катящегося кольца» — с одной кольцевой матрицы ДНК считывается «бесконечная» копия. Репликация плазмид может быть синхронизирована с репликацией бактериальной хромосомы, но может быть и независимой. Соответственно, распределение плазмид по дочерним клеткам может быть точным или статистическим. Точная сегрегация характерна для крупных малокопийных плазмид, а статистическая сегрегация — для мелких мультикопийных. В последнем случае одна дочерняя клетка получает избыточную (дублированную) генетическую информацию, а другая клетка может вообще утратить некоторые плазмидные гены Единство хромосомной и плазмидной подсистем прокариотического генома.

Некоторые плазмиды могут находиться в автономном и в интегрированном состоянии. В последнем случае плазмида включается в состав бактериальной хромосомы в определенных точках attB. Таким образом, одна и та же плазмида может включаться в состав хромосомы и может вырезаться из нее. Это обеспечивает обмен генетической информацией между разными подсистемами прокариотического генома: хромосомной и плазмидной.

3. Вирусы. Геномика вирусов. Разнообразие форм и жизненных циклов вирусов. Рекомбинация в разных группах вирусов Вирусы — это особая форма жизни, объединяющая организмы с неклеточным строением. Вирусы способны существовать в двух формах: вне клеток (свободные вирусы, или вирионы) и внутри клеток. Вирионы состоят из нуклеиновых кислот, заключенных в белковую оболочку — капсид. Вирионы не проявляют свойств биологических систем: у них отсутствует обмен веществ, и они неспособны к самовоспроизведению. В состав капсида входит строго определенное количество повторяющихся белковых субъединиц — капсомеров. Например, у вируса полиомиелита в состав капсида входит 60 капсомеров, у аденовируса — 252, у вируса табачной мозаики — 2000. Размеры вирусов колеблются от 20 до 350 нм. По морфологии различают следующие формы вирусов: сферическую, палочковидную, кубоидальную, сперматозоидную. По характеру симметрии капсида различают вирусы со спиральным, кубическим (икосаэдрическим) и комбинированным типом симметрии. Степень сложности вириона может быть различной. У простых вирусов в состав вириона входит только нуклеиновая кислота и белки, которые связаны в единую нуклеопротеиновую структуру — нуклеокапсид. У сложных вирусов имеется дополнительная липопротеиновая оболочка — суперкапсид. В состав сложных вирионов могут входить углеводы и некоторые ферменты. Однако вирусы никогда не содержат метаболических систем, обеспечивающих обмен веществ. Для собственного воспроизведения вирусы должны проникнуть в клетку. Сначала происходит адсорбция (фиксация) вирионов на поверхности клетки, а затем внутрь клетки проникает или весь вирион или только вирусная нуклеиновая кислота. В большинстве случаев вирусы проникают в клетку путем виропексиса (этот механизм проникновения вирусов в клетку сходен с фагоцитозом). После проникновения в клетку вирусы вступают в вегетативно-репродуктивную фазу, то есть приобретают способность к обмену веществ и воспроизведению, причем, метаболизм вирусов неразрывно связан с метаболизмом клетки-хозяина. Таким образом, вирусы являются облигатными (обязательными) внутриклеточными паразитами. По типам клеток-хозяев различают: вирусы бактерий (бактериофаги), растений, животных и человека. В ряде случаев нуклеиновые кислоты вирусов встраиваются (интегрируются) в состав хромосом хозяина. В интегрированном состоянии вирус называется провирусом. Провирусы неотличимы от генетического материала хозяина и воспроизводится вместе с ним. В интегрированном (вирогенном) состоянии вирусы могут находиться долгое время. Но в ряде случаев (при изменении физиологического состояния клетки, например, при облучении) начинается репродукция вируса. С помощью ферментов и пластических веществ клетки идет репликация вирусных нуклеиновых кислот и вирусных белков. Путем самосборки из этих молекул формируется множество вирионов, которые покидают клетку. При этом клетка может погибнуть или сохраниться. Значение вирусов. Вирусы — возбудители многих инфекционных заболеваний растений, животных и человека. В то же время, вирусы — возбудители заболеваний у нежелательных для человека организмов («враги наших врагов»). Вирусы широко используются как объекты молекулярно-генетических исследований. В генной инженерии вирусы применяются для переноса генетического материала. Происхождение вирусов. Существует ряд теорий происхождения вирусов. Согласно одной из теорий, вирусы — крайне упрощенные прокариотические организмы, утратившие цитоплазму. Противоположные теории рассматривают вирусы как часть генетического материала клетки, вынесенного за ее пределы. Значение вирусов в первую очередь связывается с их патогенностью — способностью вызывать заболевания. Различают острые вирусные заболевания (например, грипп), хронические и латентные (скрытые). Борьба с вирусными заболеваниями человека и животных ведется с использованием неспецифических препаратов (например, интерферона), специфических сывороток и препаратов, подавляющих репродукцию вирусов. Для профилактики вирусных заболеваний применяют различные вакцины. Антибактериальные препараты (сульфаниламиды, антибиотики) на вирусы не действуют. Геномика вирусов Геном вирусов может быть представлен различными типами ДНК или РНК. На этом основании различают: ДНК-содержащие вирусы, геном которых представлен различными типами ДНК, и РНК-содержащие вирусы, геном которых представлен различными типами РНК. Нуклеиновые кислоты (ДНК или РНК) представляют собой вирусные хромосомы ДНК-содержащие вирусы 1 тип: геном представлен кольцевой двухцепочечной ДНК длиной около 5 тпн. Представители: — обезьяний вирус SV 40 — мелкий эукариотический вирус (кодирует 5 белков), используется в генной инженерии как вектор переноса генов. — вирусы бородавок человека. 2 тип: геном представлен кольцевой одноцепочечной ДНК длиной около 5 тпн, которая может быть как кодирующей (+), так и антикодирующей (-). Представители: — мелкие бактериофаги типа М13; не разрушают клетку; плюс-цепь кодирует 8 белков — вирус золотистой мозаики фасоли. 3 тип: геном представлен линейной двухцепочечной ДНК длиной 30−150 тпн. Представители: — крупные бактериофаги (типа Т4, в капсиде 130 белков); - бактериофаги средних размеров (типа «лямбда», в капсиде 38 белков); - аденовирусы млекопитающих и человека; средних размеров; - вирусы оспы, герпеса и им подобные; вирионы крупные, есть липопротеиновая оболочка. 4 тип: геном представлен линейной одноцепочечной ДНК длиной около 5 тпн, которая может быть как кодирующей (+), так и антикодирующей (-). Представители: — спутники аденовирусов человека 5 тип: геном представлен двухцепочечной ДНК длиной 3−8 тпн, которая замкнута в кольцо из перекрывающихся сегментов. Представители: — вирус гепатита В; кодирует 5 белков; имеется суперкапсид, включающий вирусные и клеточные белки; - вирус мозаики цветной капусты. РНК-содержащие вирусы 1 тип: геном представлен линейной двухцепочечной РНК длиной около 10 тн, которая может быть сплошной или фрагментированной. Представители: — мелкие бактериофаги; - вирусы полиэдроза насекомых; - реовирусы птиц, млекопитающих и человека (РНК фрагментированная) 2 тип: геном представлен одноцепочечной плюс-РНК, которая может быть сразу использована для трансляции белков. Представители: — вирус табачной мозаики; - арбовирусы (вирусы клещевого энцефалита, желтой лихорадки); - вирус бешенства; - некоторые бактериофаги 3 тип: геном представлен одноцепочечной минус-РНК, которая используется для синтеза плюс-цепи РНК. Представители: — вирусы гриппа (А, В, С); - вирус кори; - вирус чумы; - вирус паротита (свинки); - вирус чумы плотоядных животных (чумки) 4 тип: ретровирусы — геном представлен одноцепочечной плюс-РНК, которая используется для синтеза ДНК и её интеграции в хромосомы хозяина. Представитель: — вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) Жизненные (вегетативно-репродуктивные) циклы и особенности рекомбинации у некоторых бактериофагов Вегетативно-репродуктивный цикл и особенности рекомбинации у вирулентных фагов (на примере фага Т4) Фаги фиксируются на поверхности бактериальных клеток и впрыскивают свою ДНК в цитоплазму. Происходит репликация фаговой ДНК и синтез фаговых белков. После достижения определенной концентрации компонентов фагов происходит самосборка новых фагов. После окончания сборки фаговых частиц происходит лизис клетки, поэтому такой жизненный цикл называется литическим. Клетка может быть заражена одновременно двумя и более штаммами вируса, различающимися по некоторым признакам, например, по устойчивости к повышенной или пониженной температуре. Тогда в зараженной клетке синтезируется два типа вирусной ДНК. Эти два типа вирусной ДНК способны к рекомбинации с образованием новых типов ДНК: AB + ab > Ab + aB. При самосборке вирионов из общего пула ДНК образуется четыре типа фагов: исходные: — чувствительные к повышенной температуре — чувствительные к пониженной температуре и рекомбинантные — чувствительные к любым изменениям температуры — устойчивые к любым изменениям температуры. В результате рекомбинации происходит изменение наследственно обусловленных свойств фагов. Вегетативно-репродуктивный цикл и особенности рекомбинации у умеренных фагов (на примере фага «лямбда») Умеренные фаги имеют два цикла развития: — литический (как у вирулентных фагов) и — лизогенный, при котором ДНК фага интегрируется в прокариотический геном Лизогенный цикл умеренных фагов включает: — фиксацию вирионов на поверхности бактериальной клетки; введение вирусной ДНК в клетку бактерии; - встраивание (интеграцию) вирусной ДНК в прокариотический геном; - размножение вирусной ДНК в составе прокариотического генома; - при определенных условиях фаг активируется: синтезируется свободная вирусная ДНК и происходит синтез вирусных белков, а затем самосборка вирионов; - вирионы выходят во внешнюю среду и заражают новые бактериальные клетки. При вырезании фаговой ДНК из прокариотического генома фаг ведет себя подобно плазмиде. В некоторых случаях происходит рекомбинация фаговой и прокариотической ДНК: обмен генами фага и бактерии. Тогда фаг будет содержать часть генов прокариотической клетки. Фаг, содержащий рекомбинантную ДНК, включающую часть генов прокариотической клетки, способен инфицировать новые клетки, но не способен к интеграции в прокариотическую ДНК. Для интеграции прокариотических генов в геном другой клетки необходим фаг-помощник «дикого типа». Умеренные фаги, несущие прокариотическую ДНК, способны осуществлять трансдукцию — перенос генетической информации от одного прокариотического штамма к другому. 4. Рекомбинация у прокариот. Трансформация, конъюгация, трансдукция Рекомбинация — совокупность процессов, связанных с замещением участка исходной нуклеиновой кислоты на гомологичный (сходный) участок. При этом степень гомологии может быть различной: от полной идентичности исходной и новой нуклеотидных последовательностей до заметных расхождений, приводящих к изменению фенотипа. В результате рекомбинации образуются новые сочетания аллелей, например: AB + ab > Ab + aB. У прокариот существует три способа включения в геном чужеродной ДНК: трансформация, конъюгация и трансдукция. Трансформация Трансформацией называется перенос чистой ДНК из одних клеток в другие. Трансформация была открыта бактериологом Ф. Гриффитсом в 1928 г. в опытах с пневмококками. У пневмококков известно два типа штаммов: Sи R-формы. S-форма характеризуется наличием полисахаридной капсулы, благодаря чему при искусственном культивировании она образует гладкие блестящие колонии; эта форма патогенна для мышей. R-форма не имеет капсулы, при искусственном культивировании она образует шероховатые колонии; эта форма непатогенна для мышей. Но если мышам одновременно ввести убитые S-клетки и живые R-клетки, то мыши погибают. Следовательно, генетические свойства одного штамма влияют на генетические свойства другого штамма. В 1944 г. О. Эвери, К. МакЛеод и М. МакКарти доказали, что изменение наследственных свойств клеток связано с переносом ДНК. Способность клетки к трансформации возможна при особом ее состоянии, которое называется компетентностью. У компетентных клеток изменяется состав клеточной стенки и плазмалеммы: стенка становится пористой, плазмалемма образует многочисленные впячивания, а на внешней поверхности появляются особые антигены — факторы компетентности (в частности, специфические белки с низкой молекулярной массой). В природных условиях внеклеточная чистая ДНК образуется при гибели (лизисе) прокариот. Как правило, трансформация происходит в пределах одного вида прокариот, но при наличии гомологичных генов наблюдается и межвидовая трансформация. Процесс трансформации включает следующие стадии: 1. Присоединение трансформирующей двунитевой ДНК к рецепторам на поверхности клетки-реципиента. 2. Превращение двунитевой ДНК в однонитевую. 3. Проникновение однонитевой ДНК в клетку. 4. Интеграция трансформирующей ДНК в хромосому реципиента и рекомбинация генетического материала. Длина трансформирующей ДНК должна быть от 500 до 200 тысяч пн. Энергия, выделяющаяся при деградации одной из нитей ДНК, используется для активного транспорта оставшейся нити вовнутрь клетки. Первые три стадии трансформации не зависят от нуклеотидного состава ДНК. Однако процесс интеграции трансформирующей ДНК в хромосому реципиента более вероятен при высокой гомологичности этой ДНК по отношению к ДНК реципиента. Процесс трансформации изображен на схеме. Каждый отрезок прямой соответствует одной цепи ДНК. Трансформирующая ДНК обозначена черным цветом, а ДНК клетки-реципиента — серым цветом. На первой стадии трансформирующая ДНК присоединяется к рецепторным сайтам на поверхности клетки-реципиента. На втором этапе двунитевая ДНК на поверхности клетки превращается в однонитевую за счет расщепления одной из нитей бактериальными нуклеазами. На третьем этапе оставшаяся нить ДНК транспортируется через мембрану в цитоплазму. При этом используется энергия, выделившаяся при деградации комплементарной цепи. При репликации бактериальной хромосомы трансформирующая нить ДНК присоединяется к гомологичному (частично комплементарному) участку ДНК клетки-реципиента. При этом из-за отсутствия полной комплементарности образуется гетеродуплекс («молекулярная гетерозигота») — участок двунитевой ДНК, на котором не во всех нуклеотидных парах азотистые основания связаны водородными связями. Остальная часть ДНК реплицируется нормальным образом. После окончания репликации ДНК клетка-реципиент делится с образованием двух клеток: частично трансформированной клетки с хромосомой, включающей гетеродуплексный участок ДНК, и нетрансформированной клетки. При репликации ДНК в частично трансформированной клетке на обеих цепях ДНК происходит достраивание комплементарных цепей. Одна цепь сохраняет исходные последовательности нуклеотидов, а другая становится полностью трансформированной. После деления частично трансформированной клетки образуется одна нетрансформированная клетка и одна полностью трансформированная, у которой исходная последовательность нуклеотидов замещена на последовательность нуклеотидов трансформирующей ДНК. Таким образом, при трансформации происходит замещение генов реципиента на гомологичные нуклеотидные последовательности. Чем выше степень гомологии, тем успешнее протекает трансформация. Частота трансформации у прокариот зависит от свойств трансформирующей ДНК, от ее концентрации, от состояния клетки-реципиента, от вида бактерий. Максимальная частота трансформированных клеток не превышает 1 на 100 клеток. Трансформация известна и для эукариот. Однако на поверхности эукариотических клеток отсутствуют рецепторные сайты, и трансформирующую ДНК вводят в клетки искусственно. Например, в яйцеклетки животных ДНК вводят путем прямой микроинъекции, а в яйцеклетки растений — путем микроинъекции в пыльцевую трубку. Широко используются методы биобаллистики (биолистики), позволяющие вводить любые фрагменты ДНК в культуры тканей растении. Конъюгация Конъюгацией у прокариот называется прямой контакт двух разнокачественных клеток, сопровождаемый хотя бы частичным переносом генетического материала от клетки-донора к клетк… …