Разработка метода селективного концентрирования возбудителя туберкулёза на магноиммуносорбенте с последующей постановкой количественного иммунофлуоресцентного анализа

В последние годы при выявлении МТБ широко применяют люминесцентную микроскопию. Этот метод значительно увеличивает диагностическую эффективность микроскопических исследований. Быстрота обнаружения МТБ, простота флюорохромирования делает его доступным для практических лабораторий. Преимущество метода люминесцентной микроскопии состоит в том, что она позволяет просматривать в короткий срок больше полей зрения, чем при обычной микроскопии с иммерсионной системой, при этом удаётся быстрее и в большем количестве выявлять МТБ. Люминесцентная микроскопия с применением аурамина позволяет увеличить процент находок на 8% по сравнению с методом флотации и на 17% по сравнению с прямой бактериоскопией мазка (Приказ МЗ РФ № 558, 1978). Метод бактериоскопии мазка с окраской люминесцентными красителями, в частности аурамином, основан на способности липидов микобактерий воспринимать люминесцентные красители и затем светиться при облучении их ультрафиолетовыми лучами. Этим методом можно исследовать любой материал, кроме мочи, в котором могут присутствовать трудно дифференцируемые при такой окраске сапрофиты (Приказ МЗ РФ № 558, 1978).

Другим важным преимуществом метода люминесцентной микроскопии является способность обнаруживать изменённые микобактерии, утратившие под влиянием ряда факторов, в частности интенсивной химиотерапии, свойство кислотоустойчивости и невыявляющиеся в связи с этим при окраске по методу Циля-Нильсена (Методические указания МЗ РФ «Микробиологические исследования при выявлении, диагностике и лечении туберкулёза», 2001).

При окраске микобактерий аурамином возможны ложноположительные результаты в результате некачественного обесцвечивания мазка с сохранением некоторыми сапрофитными бактериями оранжевой окраски. Микроскопические исследования (окраска по Цилю-Нильсену и аурамином) не позволяют дифференцировать микобактерии комплекса МусоЬас^егшт tuberculosis от нетуберкулёзных (атипичных микобактерий) микобактериозов. Используя эти методы, можно только сделать заключение о наличии или отсутствии кислотоустойчивых микобакте-рий (приказ МЗ РФ № 109. Приложение № 11, 2003).

При внутривидовой дифференциации бактерий наиболее перспективными являются методы диагностики, основанные на образовании комплекса антиген-антитело, особенно в связи с возможностью использования в иммунофлуоресцен-ции твёрдых носителей (Стоев К.Г. с соавт., 1981; Подзолкова Г. Г. с соавт., 1989 и т. д.).

Нами апробирован данный метод с применением магноиммуносорбентов для обнаружения антигенов возбудителя туберкулёза и определены оптимальные параметры постановки КИФА, чувствительность и специфичность метода.

Эксперименты проводили с чистыми культурами туберкулёзного микроба. Из культур готовили взвеси с концентрациями от 1×101 до 1×109 м. к/мл. Во флаконы вносили по 1 мл взвеси соответствующей концентрации микобактерий и по 0,2 мл 10% суспензии туберкулёзного магноиммуносорбента. Смесь инкубировали в течение 15, 30, 60 мин при температурах (22±4) 0С и (37±1) °С, затем гранулы МИС отмывали 0,9% раствором хлорида натрия рН 7,2, используя для сепарации постоянный магнит, удерживающий МИС на внутренней стенке флаконов. В дальнейшем к МИС добавляли 200 мкл раствора иммуноглобулинов G туберкулёзных флуоресцирующих (полученных нами при конъюгации иммуноглобулинов из адсорбированной туберкулёзной сыворотки путём фракционированния капри-ловой кислотой (Steibuch G., Andran R., 1969) с ФИТЦ (C21H11NO5S) по методу Х. Шторц (Stortz, 1987) и инкубировали 15, 30, 60 мин при (22±4) 0С и (37±1) 0С. Сорбент отмывали вышеуказанным способом 2−3 раза забуференным физиологическим раствором и 1 раз дистиллированной водой. Контролем служили гранулы МИС, не контактировавшие с исследуемым материалом и окрашенные флуоресцирующими иммуноглобулинами. Исследуемые опытные и контрольные взвеси в объеме 20 мкл наносили на предметное стекло и микроскопировали. Прибором, регистрирующим уровень свечения магнитных гранул, служил люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ Р-8, оборудованный фотометрической насадкой ФМЭЛ-14. К насадке подсоединяли источник тока УБПВ-1 и вольтметр цифровой универсальный В7−76. Рабочее напряжение составляло 800 — 900 В, увеличение объектива х40 и окуляра х10. Применялись возбуждающие светофильтры БС-8−2, СЗС-7−2, ФС-1−6. Диаметр зонда фотометрической насадки составил 0,5 мм. После обнаружения в поле зрения гранул сорбента закрывали полевую диафрагму и снимали цифровые показания уровня свечения 10−15 гранул на вольтметре. Определяли среднеарифметические значения величины флуоресценции опытных (рис. 15), контрольных гранул и пространства между ними — фона.

Интенсивность флуоресценции магноиммуносорбента (М) представляла собой разницу между среднеарифметическими показателями уровня свечения гранул и фона: (М)= М гранул — М фона. За положительные принимались ре-зультаты, при которых уровень флуоресценции опытных гранул в 2 и более раз превышал аналогичный показатель контрольных (Владимцева И.В. с соавт, 1989).

Для оценки способности туберкулёзных МИС концентрировать на своей поверхности специфический антиген приготавливали пробы водопроводной во-ды объёмом 500 мл, куда вносили МТБ в количестве 101, 102, 103, 104, 105 м.к. В дальнейшем эти пробы пропускали через МИС, находящиеся в специальной «ловушке» и удерживающиеся в ней магнитным полем.

Общая схема постановки КИФА представлена на рисунке 16.

МТБ во всех случаях были выявлены при наличии в пробах 1×10 м.к. и выше. Аналогично контролировали специфичность диагностической системы, используя гетерологичные штаммы (таблица 14). В результате установлено отсутствие перекрёстных реакций.

В процессе отработки различных условий проведения анализа установлено, что чувствительность КИФА была одинаковой при исследуемых температурных режимах сорбции антигена на МИС- (22+4) 0С и (37±1) 0С, а для контакта сорбента с антигеном и окрашивания образовавшегося комплекса флуоресцирующими иммуноглобулинами было достаточно 15−30 мин инкубации.

Из таблицы следует, что отношение уровней флюоресценции опытных МИС в 2 раза выше по сравнению с контрольными, не контактирующими с ан-тигеном, а также с сорбентами, обработанными гетерологичными штаммами. Данная диагностическая система позволяет выявлять возбудитель туберкулёза в концентрации 0,5×10 — 1×10 м.к./пробе.

При проведении статистической обработки по методу Е. П. Тамбовцева с соавт.(1969) в серии опытов чувствительность КИФА t равна 0,82×10 м.к./мл (+7,9%;-7,3%).

Нами приготовлено 5 серий тест — систем МИС для диагностики возбудителя туберкулёза в КИФА, в которые входят 3 амп. по 2 мл. туберкулёзных МИС -10% взвесь; положительный контроль — обеззараженные клетки мико-бактерий туберкулёза, 1×10 9 м.к./мл, 1 ампула — 1 мл; иммуноглобулины туберкулёзные флуоресцирующие сухие — рабочее разведение 1:16 — 1:64 — 1 амп-0,5 мл.

При проведении технико-экономического обоснования применения сочетанных методов МИС с КИФА установлены явные преимущества данного метода перед традиционной иммунофлюоресцентной реакцией (таблица 15).

Таким образом, нами разработана биотехнология изготовления туберкулёзных МИС, на их основе сконструированы диагностические тест — системы для проведения сочетанного метода детекции возбудителя туберкулёза в КИФА и оптимизированы параметры постановки этой реакции. Данный метод обеспечивает селективное концентрирование МТБ на сорбенте, обладает высокой чувствительностью (0,5×10 — 1×10 м.к./в пробе), в 1000 раз превышающую чувствительность общепринятой РИФ, специфичностью и отличается быстротой постановки реакции (1−1,5 ч). При этом реакция учитывается не только визуально, но и инструментально в условных единицах по показаниям вольтметра.