В своих первых научных работах при изучении процессов брожения и теплообразования в живых организмах Гельмгольц приходит к формулировке закона сохранения энергии. В его книге «О сохранении силы» (1847) он формулирует закон сохранения энергии строже и детальнее, чем Роберт Майер в 1842 году, и тем самым вносит существенный вклад в признание этого оспариваемого тогда закона. Позже Гельмгольц формулирует законы сохранения энергии в химических процессах и вводит в 1881 году понятие свободной энергии — энергии, которую необходимо сообщить телу для приведения его в термодинамическое равновесие с окружающей средой (F=U-TS, где U есть внутренняя энергия, S — энтропия, T — температура).
С 1842 по 1852 занимается изучением роста нервных волокон. Параллельно Гельмгольц активно изучает физиологию зрения и слуха. Также Гельмгольц создает концепцию «бессознательных умозаключений», согласно которой актуальное восприятие определяется уже имеющимися у индивида «привычными способами», за счёт чего сохраняется постоянство видимого мира, при этом существенную роль играют мышечные ощущения и движения. Он разрабатывает математическую теорию для объяснения оттенков звука с помощью обертонов.
Гельмгольц способствует признанию теории трёхцветового зрения Томаса Юнга, изобретает в 1850 году офтальмоскоп для изучения глазного дна, в 1851 году — офтальмометр для определения радиуса кривизны глазной роговицы. Сотрудниками и учениками Гельмгольца были В. Вундт, И. М. Сеченов и Д. А. Лачинов.
Установлением законов поведения вихрей для невязких жидкостей Гельмгольц закладывает основы гидродинамики. Математическими исследованиями таких явлений как атмосферные вихри, грозы и глетчеры Гельмгольц закладывает основы научной метеорологии. Ряд технических изобретений Гельмгольца носит его имя. Катушка Гельмгольца состоит из двух соосных соленоидов, удалённых на расстояние их радиуса и служит для создания открытого однородного магнитного поля. Резонатор Гельмгольца представляет собой полый шар с узким отверстием и служит для анализа акустических сигналов, а также при создании низкочастотных звуковых колонок для усиления низких частот или наоборот — для подавления нежелательных частот в помещениях.
Много работ посвятил Гельмгольц обоснованию всеобщности принципа наименьшего действия.
