Определение ферментов-антиоксидантов, содержащихся в корне хрена, выращенного в Астраханской области в летне-осенний период

Известно, что спасителями наших клеток являются антиоксиданты — группа биологически активных соединений, содержащихся в пище и нейтрализующих в организме свободные радикалы — нестабильные атомы и соединения, которые образуются в ходе нормального обмена веществ и присутствуют в окружающей среде, но, накапливаясь сверх меры, становятся опасными. Также антиоксиданты замедляют процесс старения, снижают риск возникновения у человека рака, сердечнососудистых заболеваний, мышечной дистрофии и др. Однако курение, стрессы, экология только способствуют уменьшению антиоксидантов.

Метаболизм кислорода в аэробных клетках сопровождается постоянным образованием токсичных реакционноспособных свободно — радикальных продуктов. В результате эволюции, у аэробов возникли защитные механизмы, к которым относятся специализированные ферментные и неферментные антиоксидантные системы. Главную роль в защите от кислородных интермедиантов играют ферменты, способные обезвреживать супероксидные радикалы и перекисные соединения в клетках, например: супероксиддисмутаза (СОД) (разрушает супероксидные анион-радикалы до перекиси водорода), каталаза (восстанавливает перекись водорода до кислорода и воды) и пероксидаза (также восстанавливающая перекись водорода до воды, но с участием органических восстановителей) [1].

Угроза для клеток со стороны активных радикалов устраняется действием ряда ферментов, эффективно [2,3,4] обезвреживающих эти соединения. Первую линию защиты от свободных радикалов составляют антиоксидантные ферменты супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза. Супероксиддисмутазы (металлоферменты) катализируют реакцию:

О2 + О2+ 2Н> Н2О2 + О2.

Они находятся во всех клетках, потребляющих кислород. Скорость реакции чрезвычайно высока и лимитируется только скоростью диффузии O2?. Каталитический цикл этих ферментов включает восстановление и окисление иона металла на активном центре фермента. В организме имеется три формы СОД, содержащие медь, цинк (одна находится в цитозоле, другая экстрацеллюлярная — в эндотелии) и магний (находится в матриксе митохондрий) [4]. Супероксиддисмутаза осуществляет инактивацию радикалов кислорода, которые могут возникнуть в ходе биологических реакций переноса электронов или при воздействии металлов с переменной валентностью, ионизирующего, ультрафиолетового излучения, ультразвука, гипербарической оксигенации, различных заболеваниях.

Почти во всех животных клетках и органах определяется каталазная активность. Особенно богаты каталазой клетки печени, почек, эритроциты. Она предотвращает накопление в клетке перекиси водорода, образуемой при аэробном окислении восстановленных флавопротеидов и из O2?..

H2O2 + H2O2 >O2+ 2H2О Каталаза может разложить 44 000 молекул H2О2 в секунду (относится к числу ферментов с наиболее высоким числом оборотов). Для расщепления большого количества перекиси водорода требуется малое количество фермента. Как и в случае супероксиддисмутазы, скорость реакции определяется диффузией и не требует энергии для активации. Каталаза преимущественно находится в пероксисомах [4], внеклеточно каталаза находится в незначительных концентрациях. Наибольшая активность каталазы в организме характерна для печени. К алиментарным факторам, понижающим каталазную активность, относят недостаточность витаминов группы В, фолиевой кислоты, биотина, пантотеновой кислоты, рибофлавина, витамина А. Снижение активности каталазы наблюдается при избытке метионина, тирозина, цистина, меди, цинка. В эритроцитах при высокой скорости образования перекиси водорода (1010−109 моль H2О2 на 1 мг гемоглобина в 1 мин) преобладает активность глутатионпероксидазы, а при низкой скорости образования H2О2 (109−107) — защитное действие оказывает в основном каталаза.

В печени, почках, нейтрофильных лейкоцитах обнаруживается пероксидазная активность.

H2O2 + H2O2 > 2H2О + RO2.

Миелопероксидаза в нейтрофилах окисляет ионы галогенов до свободного галогена, являющегося эффективным бактерицидным агентом. В эритроцитах, печени, хрусталике глаза имеется глутатионпероксидаза, которая содержит селен и специфично окисляет восстановленный глутатион. Как каталаза, так и пероксидаза могут утилизировать как субстраты органические гидроперекиси (например, гидроперекись этила, надуксусную кислоту). Полагают, что в животных тканях каталаза действует, как пероксидаза.

В настоящее время культуры растительных клеток являются объектом биотехнологии для получения целевых продуктов, поэтому целесообразность изучения ферментов-антиоксидантов становится очевидным. Кроме того, в последние годы ферменты антиоксидантной системы представляют большой интерес для практической медицины.

Корень и препараты из хрена обладают противовоспалительными, мочегонными, раздражающими, витаминными, отхаркивающими, сокогонными, фитонцидными, противоцинготными, болеутоляющими, противомикробными и противогрибковыми свойствами. Имеются также сведения о противоопухолевом действии указанных препаратов. И все это благодаря содержанию различных ферментов-антиоксидантов.

В связи с этим изучению ферментов-антиоксидантов, содержащихся в корне хрена, посвящено достаточное количество работ.

В корне хрена присутствует гликозид синигрин (C10H16CNS2O9), который под действием ферментного комплекса мизорина распадается на аллиловое горчичное масло, глюкозу и кислую серно-калиевую соль; а также белковое антибиотическое вещество лизоцим, углеводы (глюкоза, галактоза, арабиноза, ксилоза, сахароза, пентозаны, галактуроновая кислота, полисахариды), азотистые и зольные вещества; жиры; сапонины; флавоноиды. Своеобразный вкус и запах хрена обусловлены наличием эфирных масел, в состав которых входят аллилгорчичное масло.

Содержащийся в хрене лизоцим, фермент класса гидролаз, разрушает стенки бактериальных клеток, в результате чего происходит их растворение. Лизоцим подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий, оказывает противовоспалительное действие и стимулирует неспецифическую резистентность организма [5].

Другим важнейшим составляющим хрена является фермент пероксидаза, принадлежащий к классу оксидоредуктаз, катализирующий окисление органических и неорганических соединений в присутствии перекиси водорода, которая действует как акцептор водорода, превращаясь в воду в ходе данной химической реакции. Пероксидаза, воздействуя на оболочку имеющихся в организме клеток вируса, разрушает ее, что приводит к гибели указанных клеток. Результатом является эффективное повышение неспецифической резистентности. Культивируемые в настоящее время в России сорта хрена содержат до 15 г пероксидазы на 1000 кг исходного сырья, что обеспечивает высокую эффективность содержащей его препарат биологически активной пищевой добавки.

Химический состав частей растения представлен в табл. 1.

Таблица 1.

Химический состав частей растения.

Содержание основных веществ на 100 г продукта, %.

Не смотря на большой спектр ферментов, содержащихся в корне хрена, наибольший интерес вызывает пероксидаза.

Пероксидаза — один из наиболее распространенных ферментов, содержащийся в растениях, микробах, тканях животных. Этот фермент катализирует окисление широкого спектра органических соединений пероксидом водорода с образованием токсичных пероксидов, удаляющихся из живых организмов. Пероксидаза представляет собой гликопротеид, состоящий из полипептидной цепи, формирующей двухдоменную глобулу, и гемовой простетической группы с атомом железа, располагающейся между доменами [6].

Введение

пероксидазы хрена в пищевой рацион весьма полезно. Это обусловлено в частности (и особенно) наличием гема в структуре фермента. Хотя в литературе прямые сведения об использовании пероксидазы хрена как биологически-активной добавки встречаются редко, очевидно, что потребление пероксидаз растений человеком происходит достаточно активно.

Пероксидазы растений принадлежат к классу гем-содержащих оксидоредуктаз и используют пероксид водорода в качестве донора электронов. Пероксидаза хрена является одним из наиболее изученных ферментов этого класса [7].

В настоящее время существуют различные методы определения пероксидазы и ферментов-антиоксидантов: фотометрический, колориметрический, волюмометрический, электрохимический, флуоресцентный, хемилюминесцентный и ряд более специфических.

Известно, что в водной вытяжке из корней хрена содержится значительное количество антиоксидантов, таких как пероксидаза, каталаза, витамин С, в-каротин, флавоноиды.

Содержание ферментов-антиоксидактов в корне хрена непостоянно и зависит от климатических условий, времени посадки и времени сбора урожая.

Нами было изучено содержание антиоксидантов с использованием метода А. Н. Баха и А. И. Опарина в корне хрена, выращенного в Астраханской области в летне-осенний период [8].

Содержание ферментов-антиоксидантов в корневище хрена непостоянно и зависит от климатических условий, времени посадки и времени сбора урожая.

Порядок выполнения работы. 2 г корневища хрена растирали с кварцевым песком в ступке, постепенно добавляя 2−3 см3 воды. Для уменьшения кислой реакции добавляли на кончике шпателя карбонат кальция до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносили в мерную колбу и доводили объем раствора водой до 100 см³. Через 30 мин в коническую колбу емкостью 200 см³ вносили 25 см³ 0,1 н. раствора пероксида водорода и добавляли туда же 20 см³ вытяжки хрена, а еще через 30 мин действие фермента прекращали прибавлением 5 см³ 10%-ного раствора серной кислоты и титровали смесь 0,1 н. раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение примерно 1 мин розового окрашивания). Фиксировали количество миллилитров раствора перманганата калия, пошедшего на титрование оставшегося пероксида водорода. Одновременно ставили контроль с инактивированным нагреванием в кипящей водяной бане в течение 6 мин 20 см³ вытяжки хрена. К этому раствору после охлаждения добавляли 25 см³ 0,1 н. пероксида водорода. Смесь оставляли на 30 мин, после чего добавляли 5 см³ 10%-ного раствора серной кислоты и титровали смесь 0,1 н. раствором перманганата калия. Фиксировали количество миллилитров перманганата калия, пошедшего на титрование оставшегося количества пероксида водорода. По разности между опытным и контрольным титрованием находили количество перманганата, эквивалентное количеству разложенного ферментом пероксида водорода.

Расчет количества пероксида водорода, разложенного ферментом, вели в соответствии с уравнением реакции:

5Н2О2+2KMnO4+3H2SO4 = 2MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O.

Согласно этому уравнению, 1 см³ 0,1 н. раствора перманганата калия соответствует 1,7 мг пероксида водорода. Это хорошо иллюстрируется следующим примером. Из 2 г хрена приготовлена водная вытяжка объемом 100 см³. На титрование опытной пробы (20 см3 вытяжки хрена) затрачено 9,5 см³, контрольной — 18,6 см³ 0,1 н. раствора перманганата калия. Количество разложенного пероксида водорода в пробе эквивалентно 18,6 — 9,5 = 9,1 см³ 0,1 н. раствора перманганата калия и, следовательно, равно 9,1×0,17=15,47 мг пероксида водорода.

В 2 г корневища хрена содержится количество ферментов — антиокси-дантов, способное за 30 мин разложить (1,547· 100)/ (20· 1)= 77,35 мг пероксида водорода, а за 1 мин — 2,56 мг. Так как 1мкмоль пероксида водорода составляет 0,034 мг, то в 2 г хрена содержится 76 Е ферментов — антиоксидантов (или 38 Е в 1 г хрена).

Результаты данной работы станут основой для создания и изучения нового энтеросорбента с антиоксидантными функциями.

Энтеросорбент получают адсорбцией на крахмале антиоксидантов, таких как пероксидаза, каталаза и аскорбиновая кислота, из водных вытяжек растительного материала.

Меныцикова Е. Б., Зенков Н. К. Антиоксиданты и ингибиторы радикальных окислительных процессов // Успехи совр. Биологии, 1993. Т. 113. № 4. С.442−455 .

Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии: в 3 томах. Т.2. // М., Мир, 1981. С. 617.

Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии: В 3-х томах. Т.3. Пер. с англ. // М., Мир, 1981. С. 726.

.Ленинджер А. Основы биохимии: В 3-х т. Т.2. // М., Мир, 1985. С. 368.

Halliwell B., Gutteridge J. M. C. Lipid peroxidation, oxygen radicals, cell damage, and antioxidant therapy // Lancet, 1984. Р.1396−1398.

Шеремет С. А. Способ получения биологически активной дабавки. Патент на изобретение № 2 452 242. Заявл. 2 011 106 642/13, 22.02.2011. 10.06.2012 Бюл. № 16.

Преснова Г. В., Рубцова М. Ю., Егоров А. М. Электрохимические биосенсоры на основе пероксидазы хрена // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д. И. Менделеева), 2008, m. LII, № 2. С. 61.

Александрова Е. Ю., Орлова М. А., Нейман П. Л. Изучение пероксидазной активности в экстрактах из корневища и корней хрена и ее стабильности к различным воздействиям // Вест. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 2006. Т. 47. № 5. С. 350.

Филлипович Ю.Б., Егорова Т. А., Севастьянова Г. А. Практикум по общей химии // М.: Просвещение, 1975. С. 318.