Атомно-силовая микроскопия механических свойств различных наносистем

Атомно-силовой микроскоп (АСМ) с самого своего появления [1] стал важнейшим научно-исследовательским инструментом в физике поверхности. Большая востребованность инструмента объясняется широким спектром АСМ методик исследования разнообразных локальных свойств поверхности образца с нанометровым пространственным разрешением [2]. Кроме того, изучать объекты можно в разных контролируемых условиях: вакууме, обычной атмосфере, жидкости. Такой выбор не доступен для растровой электронной микроскопии, конкурирующей с АСМ по разрешению.

АСМ, по сути своей, может позволять точный контроль силового взаимодействия зонда с образцом и, потому уникальным образом прекрасно подходит для исследования механических свойств нанои микрообъектов. Реализация измерений, однако, не тривиальна и зависит от формы и размеров объектов.

Для количественно точных исследований механических свойств одномерных объектов наиболее популярна так называемая «трех-точечная» АСМ методика, в которой исследуются подвешенные нанообъекты [36, 37]. Методика успешно применялась при измерении модуля Юнга серебряных [38], золотых нанопроводов [51], полупроводниковых нановискеров на основе GaAs [52], полипирролловых [37] и углеродных нанотрубок [36]. Несмотря на то, что в этих работах отмечался большой разброс значений модуля Юнга материала в нанообъектах, систематическое изучение и анализ факторов разброса не проводился. Он может, например, быть связан с погрешностью методов калибровки жесткости кантилеверного датчика силы, с ошибкой в определении геометрических параметров нанообъектов, с условиями закрепления подвешенных нанообъектов.

При определении с помощью АСМ механических свойств двухи трехмерных наносистем, к которым можно отнести полимерные пленки субмикронной толщины и биологические объекты, важную роль играет информация о форме и размерах кончика зонда, от которой прямо зависит количественный уровень данных. Для повышения точности и надежности измерений, необходимы не стандартные коммерчески доступные зонды нанометровой остроты, а АСМ зонды с гарантированной калиброванной формой и возможностью выбрать оптимальный размер кончика. Например, для адекватной реализации измерений механических свойств методом АСМ индентирования, размеры кончика должны быть сопоставимы с толщиной исследуемых пленок, то есть лежать в субмикронном диапазоне. Принципиальная возможность работы в жидких средах с нанометровым пространственным разрешением делает АСМ уникальным прибором для биологических исследований [74, 75]. Из биологических образцов выделяются живые клетки, так как их изучение, без сомнения, чрезвычайно интересная задача современной науки. Особенно актуальны исследования по точной характеризации индивидуальных механических свойств, которые могут служить важнейшими индикаторами злокачественного перерождения и трансформации клетки [71]. Например, возможное изменение морфологии рельефа и механических свойств кровяных клеток, вызванное применением лекарственных препаратов, может нарушить естественный кровоток в организме человека. Как и в случае двумерных объектов, при АСМ исследовании трехмерных биологических клеток возникают трудности количественной характеризации мембранных и субмембранных структур нанометровых размеров, отвечающих за важные химико-биологические процессы, и определяющих рельеф и механические свойства клетки. Дополнительно возникает проблема сохранения целостности мягкого живого объекта. Использование доступных на рынке микроколлоидных АСМ зондов сохраняет ее целостность, но тестирование нанометровых клеточных структур становится невозможным из-за существенного ухудшения разрешения прибора до уровня школьного оптического микроскопа. Применение же стандартных острых зондов обычно приводит к разрушению клеток [89].

Суммируя, отметим, что АСМ исследования механических свойств материалов все еще недостаточно надежны и количественны, и состояние дел в этой области требует совершенствования. С другой стороны существуют актуальные задачи, для решения которых требуется точная информация о механических свойствах нанообъектов. Например, при изучении механизмов гидротермального синтеза наноструктур [125], интересно исследовать методами АСМ индивидуальные свойства нанокристаллических продуктов, образующихся на различных стадиях синтеза. Традиционные методы определения структуры, состава, упругих постоянных решетки наноматериалов (рентгеноструктурный анализ, Рамановская спектроскопия) могут, если исследование оказывается возможным, дать только интегральную информацию. Проведение количественных АСМ исследований очень уместно при определении влияния различных дорогих микродобавок на механические свойства мягких полимерных пленок, с характерным модулем Юнга несколько мегапаскалей, когда стандартные испытания не применимы. Как было отмечено выше, чрезвычайно заманчивы неразрушающие тактильные исследования живых клеток, которые можно реализовать в АСМ. В свете сказанного проведение исследований по теме «Атомно-силовая микроскопия механических свойств различных наносистем» представляется в достаточной степени актуальным.

Цель данной работы заключалась в разработке количественного подхода в АСМ измерениях механических свойств нанои микросистем, создании необходимого инструментария, применении развитого подхода для исследования механических свойств хризотиловых нанотрубок, ультратонких полисилоксановых покрытий, живых клеток эукариот.

Решались следующие задачи:

• Реализация «трех-точечного» метода измерений жесткости подвешенных нанообъектов на примере природных и синтезированных нанотрубках хризотила. Сравнительные исследования изгибной жёсткости этих нанотрубок. Анализ основных факторов, влияющих на точность измерений. Определение значений модуля Юнга у природных и синтетических нанотрубок хризотила.

• Разработка надежного и воспроизводимого способа создания специализированных сферических зондов субмикронного калиброванного радиуса кривизны для АСМ. Исследование износоустойчивости изготовленных зондов.

• Количественные исследования ультратонких пленок полисилоксановых блок-сополимеров с помощью изготовленных специальных калиброванных сферических АСМ зондов субмикронного радиуса кривизны. Изучение роли микродобавок фуллеренов в упруго-прочностных свойствах пленок.

• Апробирование изготовленных специализированных сферических АСМ зондов в сравнительном исследовании топографии и механических свойств живых биологических клеток L41 и А549.

• Исследование влияние холестерина на механические свойства живых кровяных клеток К562 с помощью специализированных сферических АСМ зондов.

Научная новизна работы заключается в следующем:

• «Трех-точечный» АСМ метод подвешенного нанообъекта впервые применен для измерения изгибной жесткости и модуля Юнга природных и синтезированных нанотрубок хризотила, осажденных на трековую лавсановую мембрану. Обнаружено более чем трехкратное возрастание среднего модуля Юнга синтетического хризотила по сравнению с природным.

• Предложен и разработан новый способ создания специализированных сферических зондов субмикронного калиброванного радиуса кривизны для количественных АСМ исследований.

• Выявлено улучшение упругости тонких (субмикронных) поверхностных слоев блок-сополимера при введении в его объем вместе со сшивающим агентом микродобавок фуллеренов.

• Специализированные сферические АСМ зонды субмикронного калиброванного радиуса кривизны применены для исследования рельефа и механических свойств живых клеток L41 и А549.

• Проведены первые прямые количественные АСМ измерения механических свойств кровяных клеток К562 в зависимости от уровня мембранного холестерина клеток.

Практическая значимость диссертационной работы выражена следующим образом:

• Произведен анализ основных факторов, определяющих точность измерения механических характеристик в «трех-точечном» методе подвешенного одномерного нанообъекта цилиндрической геометрии (наностержня).

• Разработана технология, позволяющая изготовлять сферические АСМ зонды субмикронного калиброванного радиуса кривизны, которые могут быть использованы для количественных исследований механических свойств мягких объектов. Изготовленные зонды успешно применены для диагностики механических свойств ультратонких пленок полисилоксановых блок-сополимеров и биологических клеток А549, L41 и К562.

• Разработанная технология позволяет закреплять на кончике АСМ зонда частицы, диаметр которых лежит в диапазоне 50−1000 нм. Потенциально, используя данную технологию, можно создавать зонды для локальной нанометровой диагностики магнитных свойств (частицы из магнитных материалов), для регистрации отдельных спинов с помощью эффекта оптического детектирования магнитного резонанса (частицы наноалмазов с азотными вакансиями), для усиления оптического сигнала в конфокальном микроскопе интегрированном с АСМ с помощью эффекта гигантского усиления комбинационного рассеяния света (золотые или серебряные частицы).

• Результаты данной работы использованы как фундамент для налаживания мелкосерийного производство специализированных АСМ зондов субмикронного калиброванного радиуса кривизны. В сотрудничестве с фирмами НТ СПб и НТ-МДТ осуществлены поставки более 500 зондов пользователям АСМ.

Работа состоит из введения, пяти глав, заключения и списка литературы.

В первой главе представлен литературный обзор, отражающий современное состояние дел по измерению механических свойств мягких объектов с помощью АСМ. В данной главе достаточно подробно описаны возможные способы измерения механических свойств нанои микрообъектов, преимущества АСМ перед другими методами, а также трудности и проблемы возникающие при АСМ измерениях механических характеристик. Глава завершается постановкой задач для диссертационной работы.

Во второй главе приведено подробное описание способа изготовления специализированных сферических АСМ зондов субмикронного калиброванного радиуса кривизны. Показаны результаты испытаний изготовленных зондов на износоустойчивость. Также описан процесс оптимизации разработанной технологии для использования ее в мелкосерийном производстве. В заключении описываются основные преимущества использования калиброванных сферических субмикронных АСМ зондов.

В третьей главе представлены результаты измерений механических свойств синтезированных и природных нанотрубок хризотила с помощью «трех-точечного» АСМ метода подвешенного нанообъекта. В начале главы рассмотрены вопросы важности и актуальности исследования механических свойств хризотиловых нанотрубок. Далее следует развернутое описание реализации метода «трех-точечных» измерений, осуществленного в данной работе. Производится сравнительный анализ механических свойств природных и синтезированных нанотрубок хризотила, также приведены результаты исследования вариаций механических свойств нанотрубок при введении в них различных наполнителей. Произведен анализ ошибки определяемых механических параметров с помощью АСМ для одномерных объектов цилиндрической геометрии (нанотрубок). Детально проанализированы факторы, влияющие на точность измерения механических характеристик в «трех-точечном» методе подвешенных нанообъектов.

Четвертая глава посвящена результатам исследования рельефа и механических свойств ультратонких блок-сополимерных пленок. В начале главы внимание отведено возможным применениям блок-сополимеров и вопросу мотивации АСМ исследований этих материалов. Представлены данные по механическим свойствам полисилоксановых блок-сополимерных пленок, полученные с помощью изготовленных специализированных сферических зондов АСМ субмикронного калиброванного радиуса кривизны. Приводятся результаты наблюдения улучшения упругости тонких (субмикронных) поверхностных слоев блок-сополимера при введении в его объем дополнительно к сшивающему агенту добавок фуллеренов.

Пятая глава содержит оригинальные результаты АСМ исследования живых биологических клеток. В начале кратко описана важность изучения механических свойств субмембранных структур биологических клеток. Далее демонстрируется, что применение специализированных сферических зондов АСМ субмикронного калиброванного радиуса кривизны позволяет проводить неразрушающие количественные исследования рельефа индивидуальных клеток, а также механических свойств мембранных и субмембранных структур клетки. В частности, в главе представлены результаты исследования топологии рельефа и механических свойств клеток L41 и А549. В конце приведены данные АСМ наблюдений по влиянию уровня холестерина на механические свойства кровяных клеток К562.

В заключении диссертации подводится итог работы, а также основные полученные результаты, отражающие в себе защищаемые положения.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1) Предложен способ создания износостойких и антикоррозийных АСМ зондов калиброванной геометрии и радиуса кривизны. Такие специализированные зонды позволяют проводить неразрушающие количественные АСМ исследования рельефа и механических свойств объектов малой жесткости (модуль Юнга в диапазоне 1 кПа-100 МПа), с субмикронным пространственным разрешением, и, в частности, диагностику живых биологических клеток в естественной для них жидкой среде.

2) В «трех-точечном» АСМ методе измерения жесткости подвешенных одномерных нанообъектов цилиндрической формы основной вклад в погрешность определения модуля Юнга материала дают ошибки определения диаметра нанотрубки и калибровки жесткости кантилевера.

3) Большая, по сравнению с природными (минеральными) нанотрубками, дефектность и неоднородность нанотрубок хризотила, синтезированных в гитротермальных условиях, приводит к увеличению модуля Юнга материала нанотрубки.

4) Значительное улучшение упругости тонких (субмикронных) поверхностных слоев блок-сополимера (лестничный фенилсилсеквиоксанполидиметилсилоксан) достигается при введении в его объем дополнительно к сшивающему агенту винилоксиму более 0.01% фуллеренов. Такая концентрация соответствует нахождению в характерной ячейке межблочной доменной структуры полимера нескольких молекул фуллеренов.

5) Значительный дефицит (10−20% от нормы) уровня мембранного холестерина живых клеток К562 приводит к увеличению упругого модуля поверхностных слоев клетки в 1.5 раза, что связанно со снижением активности механочувствительных каналов и последующей перестройкой актиновых структур кортикального цитоскелета.

Результаты и положения, изложенные в данной работе, были представлены на следующих конференциях лично автором:

1. Няпшаев И. А., Анкудинов A.B., Спешилова А. Б., Улин В. П. Электрохимическая обработка зондов АСМ // Труды XIII международного симпозиума Нанофизика и Наноэлектроника. — Нижний Новгород 16−20 марта 2009. — С. 294. Стендовый доклад.

2. Няпшаев H.A., Анкудинов A.B. Атомно-силовая микроскопия мягких объектов с помощью наноколлоидного зонда // Тезисы конференции (школы-семинара) по физике и астрономии для молодых ученых Санкт-Петербурга и Северо-запада «Физика СПб». — Санкт Петербург 29−30 октября 2009, С. 90. Стендовый доклад.

3. Няпшаев И. А., Анкудинов А. В. Сканирующая зондовая микроскопия индивидуальных асбестовых нанотрубок с различными наполнителями // Труды международной зимней школы по физике полупроводников. — Санкт-Петербург 2010. Устный доклад.

4. Няпшаев И. А., Анкудинов A.B. Атомно-силовая микроскопия живых клеток // Труды XXIII российской конференции по электронной микроскопии. -Черноголовка 2010. — С. 157. Устный доклад.

5. Няпшаев H.A., Анкудинов A.B. Применение наноколлоидных зондов для атомно-силовой микроскопии живых клеток // Труды международной школы-конференции молодых учёных и специалистов «Современные проблемы физики». — Минск 2010. Устный доклад.

6. Няпшаев H.A., Анкудинов A.B. Адаптация атомно-силовой микроскопии для исследований мягких объектов // Конференция по физике и астрономии «Физика СПб». — Санкт-Петербург 2010. Стендовый доклад.

7. Няпшаев И. А., Анкудинов A.B., Возняковский А. П., Феклистов A.A., Стовпяга A.B. Атомно-силовая микроскопия структуры и механических свойств ультратонких пленок полимерных композитов // Труды XV международного симпозиума Нанофизика и Наноэлектроника. — Нижний Новгород 14−18 марта 2011. — С. 568−569. Стендовый доклад.

8. И. А. Няпшаев, A.B. Анкудинов, Точные измерения механических свойств биологических объектов с помощью атомно-силового микроскопа, Труды 2-ой Уральской школы «Современные Нанотехнологии. Сканирующая Зондовая Микроскопия», Екатеринбург 19−22 апреля 2011. Устный доклад.

9. Няпшаев H.A., Анкудинов A.B., Возняковский А. П. Исследование наноструктуры и механических свойств ультратонких пленок полимерных композитов // Тезисы конференции по физике и астрономии для молодых ученых Санкт-Петербурга и Северо-запада «Физика СПб». — Санкт Петербург 26−27 октября 2011. — С. 90−91. Устный доклад.

10. Няпшаев И. А. Точные измерения механических свойств нанои микрообъектов с помощью атомно-силового микроскопа // Труды международной зимней школы по физике полупроводников. — Санкт-Петербург 24−27 февраля 2012. — С. 1. Приглашенный доклад.

По теме диссертации опубликованы 4 статьи перечня ВАК:

1. Няпшаев И. А., Щербин Б. О., Анкудинов A.B., Кумзеров Ю. А., Неведомский В. Н., Красилин A.A., Альмяшева О. В., Гусаров В. В. Механические свойства наносвитков на основе Mg3Si205(0H)4 // Наносистемы: Физика, химия, математика. — 2011. — 2(2). — С. 45−57.

2. Няпшаев И. А., Анкудинов A.B., Возняковский А. П. Атомно-силовая микроскопия супрамолекулярной организации и прочностных свойств ультратонких пленок полисилоксановых блоксополимеров // ФТТ. — 2011. — 53. -С. 1783−1790.

3. Ankudinov A. V., Nyapshaev I. A., Voznyakovskii A. P. Nanocarbons-induced hardening of ultrathin polysiloxane block copolymer films // Fullerenes, Nanotubes and Carbon Nanostructures. — 2012. — 20. — P. 487⁹⁵.

4. Няпшаев И. А., Анкудинов A.B., Стовпяга A.B., Трофимова Е. Ю., Еропкин М. Ю. Диагностика живых клеток в атомно-силовом микроскопе, используя субмикронный сферический зонд калиброванного радиуса кривизны //ЖТФ.-2012.-82(10).-С. 109−116.

На технологию способа изготовления специализированных сферических зондов субмикронного калиброванного радиуса кривизны для АСМ написан и получен патент: регистрационный номер 2 010 134 186 «Способ изготовления коллоидного зондового датчика для атомно-силового микроскопа», дата приоритета 17.08.2010.

Все АСМ результаты получены на отечественном оборудовании фирмы НТ-МДТ, сканирующей зондовой лаборатории NTEGRA AURA. рис.За. Также угол, а может отличаться при работе на воздухе (на приборах НТ-ДМТ угол а=20°) и в жидкости (на приборах НТ-ДМТ угол а=10°).

Опишем подробней процесс сканирования поверхности зондом АСМ. При взаимодействии с поверхностью упругая консоль зонда изгибается, величина изгиба определяет силу давления иглы зонда на образец. Чтобы контролировать величину изгиба, а соответственно и силу взаимодействия, в АСМ используется система контроля положения зонда (или система детектирования). Чаще всего в качестве такой системы контроля применяется метод оптического пучка, впервые упоминавшиеся в работах [12, 13]. На современных приборах в этом методе используется полупроводниковая пара лазер — фотодиод, см. рис. 2 обозначения 5 и 6. Лазерный луч направляется на консоль зонда, см. рис. 2, одна из сторон которой покрыта золотом для улучшения отражающих характеристикдалее отраженный луч попадает и регистрируется в четырехсекционном фотодиоде. Таким образом, любые отклонения консоли (или колебания) полностью повторяются смещением отраженного лазерного пятна в фотодиоде. Описанная оптическая система детектирования в современных микроскопах позволяет регистрировать отклонения и колебания консоли с точностью до нескольких пикометров (на уровне тепловых шумов) [14, 15, 16], такая чувствительность является характерной, весьма положительной и полезной чертой АСМ.

В АСМ очень точно и напрямую измеряется отклонение консоли зонда (или изменение ее резонансных характеристик, спектра). Причиной отклонения консоли могут являться разные типы взаимодействия зонда с поверхностью: капиллярные и Ван-дер-ваальсовые силы (при непосредственном контакте с поверхностью или вблизи ее), электростатическое взаимодействие (удобно регистрировать, если игла зонда металлизирована) и магнитное (игла должна быть покрыта магнитным материалом). Методик АСМ, соответствующим разным типам взаимодействия, на данный момент насчитывается около 20. В данной работе будут рассматриваться только те методики АСМ, с помощью отрицательных значений DFL, «клювик» на графике, см. рис. 5). Такой «клювик» характерен для измерений в атмосферных условиях, так как зонд при приближении к поверхности начинает немного изгибаться под действием капиллярных и Ван-дер-Ваальсовых сил притяжения. Минимальное значение DFL (нижний угол «клювика») соответствует точке касания кончика АСМ зонда поверхностиболее подробный анализ силовых кривых приведен в работах [21, 22]. Вполне очевидно, что при работе в жидкости «клювик» сил адгезии на силовых кривых практически не наблюдается, так как капиллярные силы отсутствуют. Силовые кривые можно измерять как при подводе зонда к поверхности и дальнейшего индентирования образца, так и в процессе отвода зонда от поверхности. Кривые, снятые при подходе принято называть нагрузочными, при отводе зонда — разгрузочными.

В полуконтактном режиме работы консоль АСМ зонда совершает вынужденные колебания вблизи своей резонансной частоты, зонд при этом «постукивает» по поверхности. В литературе также можно встретить следующие названия: режим амплитудной модуляции, резонансный (или осциллирующий) режим, режим прерывистого контакта, tapping mode. Впервые осциллирующий режим работы АСМ был продемонстрирован Martin и др. в работе [23] с очень маленькими рабочими амплитудами менее 1 нм. В 1993 году Zhong и др. [24], чтобы избежать залипания кончика зонда в пленке воды на поверхности срезов полимерного стекловолокна, предложили модификацию осциллирующего режима, назвав ее «tapping mode», используя значительно большие значения амплитуд колебания зонда (до 100 нм). Сигналом обратной связи в полуконтактном режиме служит амплитуда колебаний консоли, которая при сканировании поддерживается постоянной, вертикально перемещая для этого сканер с образцом (или держатель с зондом). Вертикальные перемещения образца при этом и соответствуют высоте рельефа поверхности. В зависимости от амплитуды колебаний вблизи поверхности образца, зонда АСМ может находиться как под действием сил притяжения, так и отталкивания [25, 26]. Аналогично контактному методу, амплитуда колебаний зонда (сигнал Mag штриховая линия (1) пересекает зависимость Mag (z) на рис. 6, кончик пирамиды зонда начинает стучать по поверхности с амплитудой, значение которой меньше А0. Чем ближе зонд приближается к поверхности, тем меньше становиться амплитуда его колебаний, вплоть до того, что значение амплитуды может быть равным 0 (область левее штриховой линии (3) на рис. 6). Для осуществления работы в полуконтактном режиме выбирается рабочая амплитуда взаимодействия с поверхностью, А, в пределах области между (1) и (3) штриховой линей, см. рис. 6 (обычно, А выбирается в пределах 0.6-А0−0.9-А0). Постоянное значение амплитуды, А будет поддерживаться системой обратной связи во время сканирования в полуконтактном режиме. Для того чтобы перевести значения Mag из нА в нм, нужно посчитать коэффициент соотношения z/Mag (тангенс угла наклона кривой Mag (z)), например, на рис. 6 коэффициент z/Mag=4 [нм/нА]. Умножив коэффициент z/Mag на величину Mag в нА, получаем значения амплитуды в нм.

По сравнению с контактным режимом вычислить силу взаимодействия зонда с поверхностью в полуконтакном режиме значительно сложнее. При рабочих колебаниях консоли зонда его кончик касается по поверхности не более 1/10 части от всего периода колебаний. Силу, которая действует на поверхность в момент касания зонда, называют пиковой силой (peak force) или силой удара. На данный момент не существует аналитической модели, которая может количественно описать силу удара в полуконтактном режиме. Связано это с техническими особенностями режима амплитудной модуляции, самая главная из них заключается в неконтролируемом смещении резонансной частоты возбуждения зонда [27, 28]. В данной работе в качестве параметра систематизации данных, полученных в полуконтактном режиме работы АСМ, принималась средняя за период сила постукивания зонда по поверхности (Fts), выражение для которой было предложено Garcia в работе [27]. Среднюю силу (Fts) можно вычислить по формуле:

Fts> = (1) где kc — жесткость зонда, Q — добротность колебаний зонда вблизи поверхности образца,? — параметр рассогласования, ^ = А/А0, А0 — свободная амплитуда колебаний зонда вблизи поверхности образца, А — рабочая амплитуда взаимодействия (постукивания).

Оба описанных выше режима (контактный и полуконтактный) обладают рядом преимуществ и недостатков. В контактном режиме за счет постоянного контакта зонда с поверхностью можно напрямую и точно измерять силы трения, адгезии и силу прижима зонда к поверхности. Помимо этого, в контактном режиме без особых проблем можно работать в жидкости, но при этом мягкие объекты (например, биологические клетки) подвергаются сильному воздействию (в основном из-за наличия латерального трения), которое может привести к разрушению образца. В полуконтактном режиме, как уже говорилось выше, есть проблема точного анализа силового воздействия зонда на поверхность. Недавно, в работе [29] были проведены прямые измерения силы удара, но для этого необходимо использовать специальные Т-образные АСМ зонды и специальное аппаратное обеспечение, что опять же не дает тривиального решения вопроса о количественном анализе силового взаимодействия в полуконтаткной моде. Проведенные в [29] измерения показали, что сила удара в полуконтактном режиме сравнима по значению с силой прижима в контактном режиме. Но, по сравнению с последним, в первом режиме зонд большую часть времени (9/10 от всего периода колебаний) находится вне контакта с поверхностью. Именно поэтому в полуконактном режиме значительно уменьшается сила латерального трения. Эти два связанных между собой фактора (уменьшение силы трения и времени взаимодействия) минимизируют разрушающее воздействие зонда и позволяют исследовать рельеф поверхности мягких объектов. В отличие от контактного режима, работа в жидкости в полуконтактном режиме намного сложнее. Из-за наличия вязкого трения добротность колебаний резко уменьшается, падает чувствительность, что сводит на нет все преимущества от использования резонанса.

Подводя итог, следует сказать, что грамотная комбинация различных режимов АСМ позволяет исследовать широкий диапазон объектов различной природы. К тому же, кроме описанных трех основных режимов работы АСМ имеются их некоторые разновидности, которые будут рассмотрены ниже, в § 1.3. Также там будут рассмотрены особенности и проблемы измерений методами АСМ механических свойств объектов.

§ 1.3 Особенности измерений механических характеристик объектов с помощью АСМ.

Механические свойства объекта — это его реакция на внешние приложенные нагрузки (определение из большой советской физической энциклопедии [30]). Из основных механических характеристик выделяют: упругую и остаточную деформацию, модуль Юнга, коэффициент жесткости материала, модуль сдвига, твердость, коэффициент вязкости, коэффициент Пуассона, относительное удлинение образца. Существует множество методик определения механических параметров объекта, например, статическое сжатие и растяжение, испытания на кручение и изгиб, ударная вязкость, индентация. Все эти методы и соответствующие приборы на их основе в основном реализованы для исследования твердых макроскопических объектов из металлов и прочих материалов. Для исследования механических свойств объектов с малой жесткостью (биологические клетки и ткани, тонкие полимерные пленки, нанонити и наотрубки) и микро-, наноразмеров очень хорошо подходит АСМ. Как уже говорилось выше, точный контроль силового взаимодействия, высокая чувствительность и разрешение потенциально делают АСМ замечательным инструментом для изучения механических свойств таких объектов. Но все же, огромную теоретическую точность АСМ не всегда удается реализовать при измерении механических свойств различных объектов. В особенности это относится к объектам с малой жесткостью. Препятствия, которые мешают проводить количественный анализ механических свойств объекта с помощью АСМ, будут описаны ниже.

АСМ напрямую может измерять следующие механические характеристики: так называемую локальную контактную жесткость и деформацию (упругую и неупругую (остаточную)) объекта. Используя эти измеренные величины, с помощью модельных расчетов можно вычислить локальный модуль Юнга образца, а также другие параметры, например, твердость. Далее в тексте под термином механические (упруго-прочностные) свойства и характеристики будут пониматься именно эти перечисленные величины. В зависимости от формы и размеров объекта, то есть его размерности, меняются подходы для измерения механических характеристик с помощью АСМ.

АСМ измерения механических характеристик одномерных объектов.

Для одномерных (1D) объектов, таких как нанотрубки и вискеры (нанопровода) измерение механических свойств осуществляется вынужденным изгибом или прогибом объекта точно известной силой, приложенной с помощью АСМ. Основная метода заключается в том, что исследуемый объект располагается над каким-нибудь достаточно глубоким отверстием в поверхности подложки. В этом случае одна часть объекта нависает над отверстием (в виде мостика или консоли), другая лежит на поверхности подложки. К провисающей части объекта прикладывают внешнее воздействие с помощью АСМ, откуда и идет название «метод подвешенного нанообъекта». Например, в работе [31] исследовались механические свойства одностенных углеродных нанотрубок, расположенных над специально изготовленными Si траншеями, см. рис. 7. Сначала трубки осаждались на Si подложку, затем под ними протравливалась широкая (более 1 мкм) траншея. С помощью АСМ подвешенную нанотрубку деформировали в латеральной плоскости (параллельно подложке). Так как отношение длины мостика к диаметру было очень большим, авторы считали, что трубка ведет себя как упругая струна и, исходя из этого, вычисляли латеральную силу, действующую на зонд со стороны нанотрубки. Величина деформации нанотрубки определялась с помощью латеральных отклонений зонда АСМ и подгоночных параметров модели струны. Данная методика очень сложна в технологической реализации, к тому нетривиальное определение величины деформации (в такой геометрии эксперимента необходимо учитывать не только кручение консоли зонда, но и ее плоский изгиб) приводят к большим неточностям в оценках модуля Юнга. контактная жесткость с которой должна значительно превосходить жесткость АСМ зонда), например на Si. Силовые кривые, измеренные в середине нанотрубок, расположенных над порами, включают в себя как деформацию нанообъекта, так и изгиб зонда, см. рис. 1 lb, 12b. Если из этих силовых кривых вычесть «опорные», то получатся зависимости силы прижима от величины деформации нанотрубки, наклон которых будет характеризовать контактную локальную жесткость нанообъекта. Контактную локальную жесткость, ks, также можно выразить аналитически, используя следующее выражение: ks= kc’S^i' <2> где где S — тангенс наклона F (z) на участке нанотрубки, располагающейся над поройS0 — тангенс наклона F (z) на твердой подложке (или на участке нанотрубки над твердой подложкой, при условии что деформация нанотрубки при этом отсутствует) — кс — жесткость зонда.

Модуль Юнга нанотрубок кольцевого сечения можно рассчитать по значению изгибной контактной жесткости ks в середине наномостика или на конце консоли (если нанотрубка свободно располагается над порой одним концом, другим лежит на подложке) и соотношению из теории упругости [33]:

Еs = а ¦ - ' й, (3).

Зя D4 w где, а =1 для наномостика и, а =64 для консолиL — длина лежащей над порой части нанотрубкиD — внешний диаметр нанотрубки.

Измерения изгибной жесткости и модуля Юнга «трех-точечным» АСМ методом, в работах [36, 37], с помощью пористых подложек при атмосферных условиях являются оптимальными по простоте реализации. Использование АСМ как единственного инструмента дает возможность не использовать вакуумные условия и, как следствие, дополнительного закрепления нанотрубок пьезобалки можно сломать или повредить кантилевер. При использовании калиброванного кантилевера тоже возникают проблемы: во-первых, нужно найти калиброванный АСМ зонд, а во-вторых, измерения жесткости таким способом требует точного размещения калибруемого зонда на кончике калиброванного кантилевера. Метод маятника, помимо своей сложности, дает большие погрешности в определении кс, около 50%.

Третью группу составляют динамические методы. Эти методы являются непрямыми, так как для измерения кс используется информация о резонансной частоте кантилевера и его геометрических размерах. Таковыми являются: резонансный метод добавочной массы (метод Кливленда) [48], метод тепловых шумов [49] и метод Сад ера [50]. Метод Кливленда, как и статический метод добавочной массы, требует большой аккуратности, так как приходится закреплять сферы диаметром в десятки мкм на пирамиду зонда, то есть данный метод трудно реализуем. Метод тепловых шумов и метод Сад ера достаточно оперативны и просты в реализации, поэтому используются на большинстве коммерческих АСМ. В методе тепловых шумов кс определяется математически по измеренной амплитуде тепловых шумов (используя равенство средней энергии колебаний кантилевера и средней тепловой энергии). Метод Сад ера использует сложный математический аппарат, основанный на резонансном отклике кантилевера в вязкой среде, для определения кс измеряются добротность и резонансная частота кантилевера. Хоть эти методы и являются основными на большинстве микроскопах крупных фирм производителей АСМ, они дают погрешность в измерении кс в пределах 15−30% [128−130].

В вопросе точности измерения модуля упругости и контактной локальной жесткости, огромную роль играет величина значения кс. Вполне очевидно, что при больших значениях кс (>>ks) АСМ не будет «чувствовать» отклонения консоли, деформироваться будет только объект, а при kc «к5 отклоняться будет только консоль. Логично, что некий оптимум будет при равных значениях кс и ks. На данный момент пользователем АСМ представлен огромный выбор зондов с коэффициентами жесткости от 0.01 до 300 Н/м. Но непосредственный анализ оптимального диапазона значений кс для адекватных и точных измерений механических свойств образцов в рассматриваемых работах не встречается.

Подведем итог по измерениям механических свойств 1D объектов с помощью АСМ. В АСМ достаточно просто исследовать индивидуальные нанотрубки с помощью так называемой «трех-точечной» методики. Данная методика успешно применялась для тестирования механических свойств серебряных, золотых нанопроводов [51], полупроводниковых нановискеров на основе GaAs [52], полипирролловых и углеродных нанотрубок. Измеренные значения модуля Юнга в этих работах варьировались на уровне 10−500 ГПа, что сравнимо со значениями модуля Юнга у твердых материалов, но величины изгибной жесткости (0.5−1.5 Н/м) были характерны для мягких объектов (из-за того что нанотрубки располагались над достаточно большими по диаметру порами). Именно поэтому нанотрубки классифицировались в этой работе как объекты малой жесткости. Важно отметить то, что для хризотиловых асбестовых нанотрубок нет тривиальных измерений, основанных на «трехточечной» методике. Также во многих работах по измерению механических свойств нанобъектов с помощью АСМ не рассматривается погрешность методов калибровки кантилевера и вклад ошибки, связанный с шероховатостью подложки в определении внешнего диаметра нанотрубок при реализации «трехточечных» измерений.

АСМ измерения механических характеристик двухмерных объектов.

Рассмотрим особенности измерения механических свойств двухмерных объектов (2D) с помощью АСМ. В качестве таковых мы в нашей работе рассматриваем тонкие полимерные пленки толщиной от 100 до 1000 нм, с характерным модулем Юнга около 10 мПа. Измерение механических характеристик таких пленок стандартными промышленными методами практически невозможно. При диагностике упруго-прочностных свойств.

Рис. 15. Схематическое изображение упругого двух сфер. На рисунке обозначены: Одиаметр контакта, Яо — радиус сферы-индентора до контакта, Я — радиус сферы-образца до контакта, 85 — деформация сферы-образца при контакте, 5(- деформация сферы-индентора при контакте, 5 — общая деформация, равная 5с+58.

Пусть сферический индентор с радиусом Яо имеет упругий контакт с другой сферой радиусом И., назовем ее сферой-образцом. При этом образуется область контакта диаметром О и две сферы испытывают упругую деформацию, б5 и 8(, соответственно, см. рис. 15. Приведенный контактный модуль Юнга, Е*, тогда можно выразить следующим образом [60]: где Е (- модуль Юнга сферы-индентора, — модуль Юнга сферы-образца, -коэффициент Пуассона сферы-индентора, v — коэффициент Пуассона сферы-образца.

Модель Герца описывает силу взаимодействия двух сфер следующим образом:

4) 1X1 где Я — приведенный радиус, равный — =—Ь —. к к.

В качестве поправки вместо контакта двух сфер, рассматривается контактное взаимодействие сфера-плоскость, тогда Я^оо и При исследовании полимерных материалов модуль Юнга кремниевого (или алмазного) зонда-индентора Е[ во много больше модуля Юнга мягкого образца Е5. При таком условии 85=8 (то есть деформация сферического индентора.

1 3 /1—у2 отсутствует) и выражение (4) примет вид: — = -(-1, при этом коэффициент е* 4 е5 /.

Пуассона для большинства мягких материалов у~0.5. Учитывая это, формула (5) для силы взаимодействия сферы с плоским образцом, Б, будет выглядеть следующим образом:

Г)3 д г3 ре* • —— = - ¦ Е——-сб).

8Я0 3 5 8(1—У2)И0 4 '.

Согласно модели Герца, диаметр контакта Э можно выразить через радиус Я0 и глубину индентации 5 (8,=5): 0=2- ^/5 ¦ И о и тогда выражение (6) примет вид:

7).

3 5 (1-У2) 4 '.

Для нахождения контактной локальной жесткости к8 выражение (7) дифференцируется по 5: к = Е-2-Е т 35 ~ Z (1-у2) (8).

Далее, снятая экспериментально, зависимость сила-деформация Б (б) аппроксимируется теоретической зависимостью (7), обычно методом наименьших квадратов, подгоночным параметром при этом является модуль Юнга образца Е3. Значение Е3, при котором теоретическая и экспериментальная кривые максимально совпадают, считается локальным модулем Юнга мягкого полимерного материала. Модель Герца достаточно проста и хорошо зарекомендовала себя как методом определения локального модуля Юнга поверхности. Она справедлива только для контактного взаимодействия сферического зонда с поверхностью. Ее применения для описания взаимодействия пирамидальных зондов с образцом приводит к ошибкам и неточностям в определении механических параметров. Теория Герца строго описывает только упругое взаимодействие, существуют различные приближения для данной теории, которые рассматривают дополнительные типы взаимодействий: приближение Дерягина-Муллера-Топорова (ДМТ), приближение ВигпЬат-Сокоп-РоПоск, приближение .1о1т80п-Кепс1а11−8регНг^ и механика Маи^з, см. подробное описание в [15]. Но большинство этих приближений трудно реализуемы для расчетов на практике. Только приближение ДМТ часто применяют при диагностике механических свойств полимерных пленок. В этом приближении помимо упругого взаимодействия учитываются поверхностные силы адгезии, то есть из правой части выражения (7) вычитается слагаемое Радн^я-о-Яо, где о — коэффициент поверхностного натяжения, Яо — радиус сферы — индентора [61, 62, 15]. РА0Н также измеряется экспериментально из силовых зависимостей Р (г), см. «клювик» на зависимости на рис. 5.

Рассмотрим вопрос точность измерения механических свойств 2D объектов. Точность определения контактной жесткости, от которой также зависит величина силы взаимодействия Б, описывалась выше для Ш объектов. А точность определения локального модуля Юнга полностью определяется геометрическими размерами и формой кончика АСМ зонда. Так как стандартные АСМ зонды (правильной и не правильной геометрии) не обладают сферической симметрией, теория Герца, в таком случае, справедлива только для малых индентаций (продавливаний), до 100 нм, при которых кончик иглы можно, с существенной погрешностью, аппроксимировать сферой. Действительно, значения радиуса закругления кончика стандартного АСМ зонда могут иметь огромный разброс от 10 до 50 нм, а иногда и до 100 нм, так.

Y (вдоль консоли зонда) на Ztg (a). Это неконтролируемое проскальзывание (так называемый «эффект плуга») помимо вносимой ошибки может еще и повреждать мягкие объекты.

Метод АСМ индентации с одновременной регистрацией нагрузочно-разгрузочных силовых зависимостей или режим силовой спектроскопии не единственный АСМ метод по диагностике механических свойств поверхности. Режим атомно-силовой акустической микроскопии (АСАМ) [69, 70] также применяется для определения модуля Юнга и контактной жесткости образцов. В режиме АСАМ зонд сканирует поверхность в контакте, при этом образец или сам зонд вынуждено возбуждаются на высоких частотах 1−10 МГц. Если исследуемая поверхность не однородна по жесткости, то в областях, где наблюдается ее градиент, будут изменяться частотные характеристики кантилевера. Измеряя частотный спектр зонда и амплитуду акустического контакта, можно рассчитать контактную жесткость, а зная радиус закругления зонда и используя модель Герца, можно определить модуль Юнга. АСАМ позволяет получать карты распределения контактной жесткости на поверхности, но, так как зонд находится в жестком контакте с образцом и присутствует латеральное трение, данная методика может быть разрушительна для мягких объектов, таких как полимеры и биологические объекты.

АСМ измерения механических характеристик трехмерных объектов.

Исследование биологических образцов, а особенно живых клеток эукариот, которые являются трехмерными объектами (3D) чрезвычайно важная и интересная задача современной науки. Особенно актуальны исследования индивидуальных механических свойств, так как они могут являться одним из важнейших индикаторов злокачественного перерождения и трансформации клеток [71]. АСМ позволяет проводить измерения в жидкости, в том числе в физиологическом растворе, что очень важно для сохранности живых клеток. Но даже при получении рельефа топографии живых клеток с помощью АСМ возникают определенные трудности. Пионерами в АСМ исследованиях живых клеток были группы Пауля Хансмы из Калифорнийского университета в Санта-Барбаре [72] и Нобелевского лауреата Герда Биннига из IBM в Мюнхене [73]. Последующее развитие исследований отражено, например, в обзорах [74, 75]. Современная картина в области, однако, все еще далека от состояния рутинных методов. Опишем основные сложности и проблемы, возникающие при АСМ исследованиях биологических объектов в условиях близких к естественным. Первая трудность заключается в закреплении биологического объекта. Так как изучение в АСМ рельефа биообъекта, подвешенного в растворе, не удается, требуется закрепить образец на подложке. Улучшенную адгезию клеток к поверхности дает обработка подложек полилизином [76], что является одним из самых простых способов. Также живые клетки можно ограничить в движении, поместив в поры трековой мембраны [77, 78]. Очень элегантен вариант зафиксировать индивидуальную клетку на кончике микропипетки [79], но этот способ сложнее в реализации, чем описанные выше, а также может привести к разрушению клетки. Вариантов закрепления живых клеток существует достаточно большое множество, но одного универсального нет, так как клетки разных типов и видов могут вести себя по-разному. Например, клетки кожного эпителиального слоя, в большинстве случаев не требуют дополнительного закрепления, поскольку сами имеют тенденцию удерживаться на поверхности.

Второй важной проблемой является разрушающее воздействие стандартных острых зондов АСМ. Минимальная сила, с которой АСМ может работать в жидкости, зависит от двух факторов: теплового шумового фона и вязкого трения среды. Силу тепловых колебаний кантилевера можно оценить, используя равенство тепловой и механической энергии колебаний, см. [80],.

FN=-y/kc • kBT, где kc — жесткость кантилевера, kB — постоянная Больцмана, Табсолютная комнатная температура среды. Для минимизации силового воздействия используют АСМ зонды пониженной жесткости (0.01−0.03 Н/м) [5,.

7]. Учитывая минимальное значение кс=0.01 Н/м и квТ=410″ Н/м, получаем Fn~20 пН. Описание силы вязкого трения достаточно громоздко, так как требует использования сложного математического аппарата, минимальные оценки, которые были приведены в работе [81], лежат в пределах Fv=50−100 пН, на самом деле, в большинстве случаев Fy имеет значительно большие значения. То есть минимальная сила, FMIN=FN+FV, с которой может работать АСМ в жидкости должна быть не меньше 70 пН (в лучшем случае исходя из минимальной оценки Fv), иначе АСМ сканирование будет не информативным, так как сигнал будет меньше уровня шума. Давление, которое оказывает стандартный зонд на клетку, Р = Fmin/tuR2, где FMIN=70 пН, R — радиус закругления зонда, равный, приблизительно, 10 нм, тогда Р-200 кПа. Для живых клеток эукариот, характерный модуль Юнга которых может иметь значения от нескольких кПа до нескольких десятков кПа [82], такое огромное давление может оказаться разрушительным.

Чтобы исключить разрушающее воздействие АСМ для исследования клеток используют специально затупленные зонды, один из примеров которых приведен на рис. 17. Тем не менее, АСМ измерение довольно сильно возмущает форму клетки [83]. Было показано, что в рельефе АСМ изображений живых клеток (кардиомиоцитов [84], глиальных клеток [85], фиброболастов [86]) отображаются особенности распределений актиновых или тубулиновых полимерных сетей, которые могут играть роль своеобразного каркаса (цитоскелета) клетки, ее двигательного аппарата, или, например, системы коммуникаций между органеллами [87]. В работе [88] отмечалось, что глиальные клетки XR1 после АСМ исследования остаются жизнеспособными, но происходит накопление фрагментов мембраны на зондирующем острие и даже кантилевере. Такое сильное возмущающее, а иногда и разрушающее, воздействие происходит потому, что АСМ исследования рельефа клеток в основном производятся в контактном режиме. В этом случае даже при использовании зондов пониженной жесткости, присутствует латеральное трение, зачастую губительное для живых клеток [89]. Использование же полуконтактных методик в жидкости сильно осложнено. В физиологическом растворе эффективная масса кантилевера резко увеличивается, что приводит к уменьшению его резонансной частоты, примерно в 3−4 раза. Существенный сдвиг резонансной частоты, приводит к тому, что использование зондов пониженной жесткости (резонансная частота которых на воздухе составляет 315 кГц), становится не возможным. Приходится выбирать АСМ зонды с более высокими резонансными частотами, и, как следствие, более жесткие. Также в полуконтактном режиме работы АСМ в жидкости резко падает добротность колебаний (в 50−100 раз по сравнению с колебаниями на воздухе), а это понижает чувствительность метода. Еще одной проблемой полуконтактного режима, как уже говорилось выше, является отсутствие количественной модели сил взаимодействия, к тому же колебания зонда в жидкости могут приводить к нежелательным возмущениям среды и проявлению различных нелинейных динамических эффектов [81]. Тем не менее, несмотря на все сложности, несомненным плюсом полуконтактного режима является факт уменьшения латерального трения, что меньше возмущает клетку во время сканирования.

Чтобы объединить преимущества и исключить недостатки обоих режимов, были разработаны своеобразные комбинации этих методов, которые значительно облегчают исследователю измерения рельефа топографии живых клеток. В так называемом «jumping mode» режиме АСМ (JM-AFM, иногда в литературе его называют «pulsed-force mode») [90, 91] зонд совершает цикл «подход-отход» в каждой точке поля сканированиянаиболее важно, что перемещение зонда в латеральной плоскости XY происходит только после отхода зонда от поверхности. Сигналом обратной связи, как и в контактном режиме, служит величина отклонения консоли (DFL). В JM-AFM фактически отсутствуют силы латерального трения, что позволяет уменьшить возмущающее и разрушающие воздействия АСМ. Пример применения JM-AFM приведен на рис. 18а, [89]. Авторы исследовали биологическую фиолетовую мембрану (Purple Membrane) в физиологическом растворе. Оптимизированная по времени измерений разновидность JM-AFM была предложена недавно в работе [92] и диссертации Быкова И. В. [93], автор назвал ее режимом поточечной методики. Время измерений рельефа в поточечной методике меньше, чем в 1М-АРМ за счет оптимизации процесса регистрирования силовых кривых подхода-отхода, но общий принцип остается таким же.

Рис. 18, а) АСМ изображение Purple Membrane на подложке из слюды в жидкости, полученное с помощью JM-AFM в работе [89]. Ь) АСМ изображение живой клетки глиобластомы полученное с помощью PeakForce QNM, скопирована с официального сайта фирмы Bruker [94]. с) АСМ изображение раковой клетки (PAN cell) в жидкости полученное с помощью поточечной методики в работе [93].

Пример применения поточечной методики приведен на рис. 18с, в котором исследовалась раковая клетка PAN. Поточечная методика реализована на приборах фирмы НТ-МДТ. Еще одна современная модификация этих методов, так называемая количественная наномеханика пиковой силы «peak force quantitative nanomechanical» (PeakForce QNM™), была предложена и реализована фирмой Veeco (сейчас принадлежит фирме Bruker) [94]. Идея PeakForce QNM аналогична JM-AFM и поточечной методике НТ-МДТ, только подход и отход зонда к образцу осуществляется не по пилообразной траектории, а по плавной параболической кривой, что позволяет совершать более аккуратные измерения рельефа, тем самым меньше возмущать биологический объект. На рис. 18Ь показаны результаты АСМ исследований живой клетки глиобластомы, полученные с помощью PeakForce QNM.

Время сканирования во всех этих режимах, зависит от времени (частоты) цикла «подход-отход». Частота «подхода-отхода» имеет верхнее ограничение, так как должна быть существенно меньше резонансных частот используемых кантилеверов, во избежание эффектов динамического возбуждения и шумов системы.

Независимо от выбора и использования режима (силовой спектроскопии, JM-AFM, поточечной методики или PeakForce QNM), проблемы точности измерений механических свойств живых клеток абсолютно аналогичны ситуации с полимерными 2D материалами. Для количественного анализа необходимы зонды со сферической калиброванной формой кончика. Для решения этого вопроса используются микроколлоидные зонды, см. рис. 16. Калиброванная форма и размеры микроколлоидных зондов позволяют производить анализ и исследование рельефа механических свойств живых клеток, см. например, работы [95, 96]. В работе [67] для измерения модуля Юнга части внутреннего сосуда крысы использовался зонд с прикрепленной сферой диаметром 5 мкм, см. рис. 19а. Исследования проводились в жидкости в режиме силовой спектроскопии, в ходе исследований было показано, что модуль Юнга сосуда увеличивается при добавлении в среду хлоргексидина.

2 мкм микроколлоидный ACM зонд будет взаимодействовать с ядрами эукариот или даже с подложкой [161]. То есть, в таком случае при определении модуля Юнга цитоскелета и субмембранных структур клетки мы будем иметь «паразитный» вклад внутриклеточных ядер, что будет вносить нежелательную неопределенность в измерения. К тому же на таких больших диапазонах индентации применимость модели Герца не гарантируется.

Особенный интерес для изучения представляют кровяные клетки. Так как изменение их упруго-механических свойств сильно влияет на кровоток в сосудах и капиллярах организма человека. Изменение механических свойств клеток может быть вызвано реакцией на применение различных лекарств, препаратов или изменением параметров окружающей среды [71, 97]. В работе [98] с помощью АСМ изучали влияние химиотерапии на модуль Юнга раковых клеток крови 9 различных линий, см. подробней в [98]. Лимфобластные и миелоидные клетки лейкемии обрабатывались раствором дексаметазона, измерения механических свойств проводились стандартным АСМ зондом до и после обработки клеток. Для измерения механических свойств использовался режим силовой спектроскопии, при этом АСМ зонд располагался над клеткой с помощью оптического микроскопа (рис.20В), а клетки закреплялись на специальной полидиметилсилоксановой подложке с отверстиями, которая была помещена в микрофлюидную ячейку, см. рис. 20А. После обработки раковые клетки умирали и становились жестче на несколько порядков, см. рис. 20С. В выводах данной работы отмечено, что, хотя химиотерапия и сокращает число раковых клеток, жесткие мертвые клетки могут нарушить естественный кровоток организма и привести к значительным осложнениям. что для адекватных измерений значение измеряемой локальной жесткости должно быть близко к значению жесткости используемого зонда, для таких измерений авторы должны были бы использовать зонд с кс~10″ 6 Н/м. АСМ зондов с такими значениями кс не существует. В рассматриваемой работе авторы использовали два типа зондов с кс=0.09 и кс=0.019 Н/м, соответственно. При таких жесткостях консоль зонда не «почувствует» объекты с модулем Юнга 100 Па (или с ks~ 10″ 6 Н/м). Возможно, полученные значения Es связаны с ошибкой, которая могла возникнуть из расчетов, проводимых по модели Герца, хотя авторы использовали стандартный зонд с некалиброванной и несимметричной формой кончика, см. выше наше рассмотрение точности измерений модуля Юнга для 2D и 3D объектов. И скорее всего радиус закругления зондов, в данной работе, был существенно больше 10 нм, так как иначе силовые зависимости не были бы получены. Также на вычисляемые значения мог повлиять неверный выбор точки контакта зонда с клеткой, так как в жидких условиях, точка контакта не так однозначна на силовых кривых, как в атмосфере, см. рис. 5. И авторы могли считать крутизну силовых зависимостей, связанную с изгибом зонда при движении сквозь вязкую среду, как начало деформации клетки.

Не смотря на рассмотренный выше случай, большое количество работ, тем не менее, свидетельствует о необходимости изучать механических свойств клеток с помощью АСМ. Из кровяных культур наиболее часто подвергаются различным исследованиям клетки миелоидной лейкемии человека К562, которые очень популярны как клетки-мишени. В последнее время особый интерес вызывают исследования влияния уровня холестерина на субмембранные клеточные структуры, см. например, работы [99], так как холестерин является основным элементом липидного бислоя и вариации его уровня концентрации могут приводить к изменению механических свойств клеток. В свою очередь, изменение механических свойств может приводить к злокачественным трансформациям клетки. Количественных прямых измерений механических свойств клеток К562 с различным уровнем холестерина, возможных только с АСМ, на данный момент не проводилось. Связано это в первую очередь с отсутствием необходимого инструментария для таких измерений. Субмембранные структуры клетки, в том числе холестериновые микродомены, можно выявить при субмикронных индентациях, а зонды с калиброванной сферической формой и размерами субмикронного радиуса кривизны отсутствуют.

Стоит отметить, что существует альтернативный способ исследования рельефа и механических свойств живых клеток, так называемый метод ионной сканирующей микроскопии (ИСМ, Scanning ion conductance microscopy) [100, 101, 102]. Считается, что ИСМ существенно меньшие воздействует и возмущает клетки, чем АСМ. Так как при измерении рельефа этим методом расстояние зонд — объект регулируется не по силовому взаимодействию, а по величине ионного тока. При исследовании рельефа клеток ИСМ, действительно показывает удивительные возможности, но измерение механических свойств с помощью этого метода носит косвенный характер. ИСМ является усовершенствованной разновидностью метода локальной фиксации потенциала (patch-clamp) [103], в котором можно измерить локальное давление активация ионных каналов мембраны клетки. По уровню этого давления и оценивается жесткость мембраны. По сравнению с АСМ, такие измерения не являются прямыми.

Подведем общий итог по измерению механических свойств 2D и 3D объектов с помощью АСМ. Потенциально, методики АСМ обладают уникальными возможностями для исследования механических параметров тонких полимерных пленок и живых биологических клеток. Но существенным препятствием является проблема точности таких измерений и их реализация. Отсутствие сферических АСМ зондов с возможностью выбора калиброванного радиуса кривизны в субмикронном диапазоне значений не позволяет проводить количественные измерения механических свойств перечисленных выше объектов и полностью реализовать возможности АСМ.

§ 1.4 Постановка задачи.

ACM имеет большой спектр методик для исследования рельефа и различных свойств твердых объектов. Но, как видно из приведенного литературного обзора, при исследовании объектов с малой женскостью или мягких объектов возникают сложности, особенно существенные при определении механических свойств. В / зависимости от формы и размеров объекта, от его размерности, подходы для измерения механических характеристик с помощью АСМ различаются.

Для измерения механических свойств одномерных объектов хорошо зарекомендовала себя так называемая «трех-точечная» АСМ методика. Однако, для хризотиловых асбестовых нанорубок, которые являются перспективным материалом для нанкомпозитов, см. § 3.1, нет тривиальных измерений, основанных на «трех-точечной» методике. Проведенный литературный обзор показывает необходимость анализа основных факторов, существенно влияющих на точность результатов методики «трех-точечных» измерений.

При измерении механических свойств мягких двухмерных и трехмерных материалов с помощью АСМ важную роль играет форма и размеры кончика зонда, так определение механических параметров происходит методом индентирования. При исследовании ультратонких полисилоксановых блок-сополимерных пленок, которые являются актуальным материалом для протекторных и защитных покрытий, см. § 4.1, требуется применение индентора с радиусом сравнимым с толщиной пленки, то есть лежащим в субмикронном диапазоне. При выполнении точных измерений возможно проанализировать и проверить варианты упрочнения ультратонких пленок блок-сополимера. В исследованиях биологических клеток возникают аналогичные трудности.

Для точных неразрушающих исследований субмебранных структур биологических клеток, которые играют важную роль в в механических процессах клетки, см. § 5.1, необходимы сферические АСМ зонды субмикронного калиброванного радиуса кривизны. При наличии таких зондов возможно проводить количественные исследования по изменению механических свойств клетки и изучать реакцию ее цитоскелета. На данный момент требуемый инструментарий отсутствует, что тормозит развитие АСМ диагностики 2D и 3D структур.

В заключение обзора сформулируем основные задачи диссертационной работы:

• Реализовать «трех-точечный» метод измерений жесткости подвешенного нанообъекта на примере природных и синтезированных нанотрубках хризотила. Провести сравнительные исследования изгибной жёсткости этих нанотрубок. Проанализировать основные факторы, влияющие на точность измерений. Определить значения модуля Юнга у природных и синтетических нанотрубок хризотила.

• Разработать надежный и воспроизводимый способ создания специализированных сферических зондов субмикронного калиброванного радиуса кривизны для АСМ. Исследовать износоустойчивость изготовленных зондов.

• Провести количественные исследования ультратонких пленок полисилоксановых блок-сополимеров с помощью изготовленных специальных калиброванных сферических АСМ зондов субмикронного радиуса кривизны. Изучить роль микродобавок фуллеренов в упруго-прочностных свойствах пленок.

• Апробировать изготовленные специализированные сферические АСМ зонды в сравнительном исследовании топографии и механических свойств живых биологических клеток L41 и А549.

• Исследовать влияние холестерина на механические свойства живых кровяных клеток К562 с помощью специализированных сферических АСМ зондов.

§ 2.2 Способ создания специализированных сферических зондов с калиброванным радиусом кончика в диапазоне 50−250 нм.

В качестве частиц, которые можно прикреплять на кончик АСМ зонда, в работе использовались Si02 гранулы. Водные коллоиды практически одинаковых по диаметру гранул (с характерной дисперсией 2−5%.) являются коммерчески доступными, и можно выбрать значение диаметра в диапазоне от 20 нанометров до 20 микрон [105]. В данной работе использовались Si02 гранулы с дисперсией размеров менее 5%, водные коллоиды которых были изготовлены в ФТИ им. А. Ф. Иоффе по методике, описанной в работах [106, 107, 108].

Чтобы закрепить субмикронную гранулу на кончик иглы АСМ зонда, нужно осуществить процесс, состоящий из нескольких стадий. Основные стадии процесса создания специализированного сферического зонда схематически изображены на рис. 21. Первая стадия заключается в нанесение гранул на подложку таким образом, чтобы в дальнейшем была возможность ими манипулировать, см. рис.21а. На второй стадии необходимо локально обработать кончик АСМ зонда в клеящем материале, при этом очень важно, чтобы зонд сохранил свою работоспособность для дальнейшей визуализации гранул, см. рис. 2 lb. На третьей стадии осуществляется прикрепление гранулы на самый кончик иглы АСМ зонда, обработанной в клеящем материале, см. рис. 21с, d, е. На четвертой стадии нужно произвести отверждение клеящего материала для надежной фиксации гранулы, см. рис. 2 lg. Наконец, на заключительной, пятой стадии, проводится тестирование полученных АСМ зондов на предмет их годности. Все эти этапы можно проделать, используя стандартный атомно-силовой микроскоп с простейшим оптическим контролем, в данной работе использовался АСМ модели NTEGRA Aura фирмы «НТ-МДТ». Стадия нанесения гранул имеет особенности в зависимости от размеров гранул. Поэтому способы изготовления зондов с калиброванным радиусом кончика в диапазоне 50−250 нм и в диапазоне 250−500 нм немного отличаются. В этом разделе мы подробно рассмотрим последовательность изготовления АСМ зонда и, при этом, существует возможность их свободной манипуляции, можно переходить ко второй стадии.

На второй стадии — стадии обработки кончика АСМ зонда в клеящем материале — для начала нужно выбрать тип клея. Для данных целей очень удобно использовать клей ультрафиолетового отверждения UV 50. а) ?(b) ©.

Ц 1 ^^Bfeh шк — :

20 jam с 20 хт 20? am.

1−1 — 1 1 1—¦—1 d) so-,.

-'——1-г———н.

0 15 30 45 60 t, s.

Рис. 24. Способ создания специализированных сферических зондов с калиброванным радиусом кончика в диапазоне 50−250 нм. Вторая стадия: обработка кончика АСМ зонда в клею, а) Оптическая фотография кончика АСМ зонда (стрелка 2) и капли клея на Si подложке (стрелка 1) до момента обработки. Ь) Оптическая фотография процесса обработки кончика АСМ зонда в капле клея, с) Оптическая фотография после завершения процесса обработки, d) Сигнал горизонтального отклонения консоли АСМ зонда (DFL) в течении процесса обработки. Левой пунктирной линией на (d) обозначен момент касания кончика зонда и поверхности капли клея. Правой пунктирной линией на (d) обозначен момент отрыва кончика зонда от поверхности капли клея. Расстояние по оси абсцисс между пунктирными линиями это время обработки кончика АСМ зонда в клею. Использовался зонд CSG30. на одном уровне. Для получения количественной и качественной информации и для использования преимуществ субмикронных сферических зондов, необходимо, чтобы Si02 гранула выступала над кончиком иглы более чем на четверть своего диаметра (или половину радиуса), см. § 2.4. Неработоспособные зонды можно исправить, применив технологию фокусированного ионного пучка (ФИП). ФИП позволяет проводить локальное (в нанометровом масштабе) [104] распыление твердого материала. Например, зонд NSG03 с неудачно закрепленной гранулой радиусом 125 нм, можно сделать годным к использованию, если с помощью ФИБ «срезать» выступающий кончик, см. рис. 34а. После описанной процедуры обработки получается работоспособный специализированный сферический зонд с закрепленной гранулой радиусом 125 нм, см. рис. 34Ь.

§ 2.7 Выводы.

В данной главе отражены следующие результаты:

• Предложен надежный и воспроизводимый способ создания специализированных сферических зондов субмикронного калиброванного радиуса кривизны для АСМ. Способ позволяет закреплять на кончике иглы зондового датчика одиночную частицу как микронных, так и субмикронных размеров. Способ не требует обязательного изготовления специального посадочного места на кончике иглы и надежно сохраняет исходные характеристики зондового датчика. Указанный технический результат достигается тем, что при изготовлении коллоидного зондового датчика используют АСМ, с помощью которого на кончик иглы его собственного работоспособного зондового датчика прикрепляют коллоидную частичку. Способ включает в себя последовательность определенных действий. Сначала с помощью АСМ визуализируют расположение коллоидных частиц, предварительно осажденных на гладкую подложку, и по принципу минимального числа соседей выбирают из них частицу кандидата для закрепления. Затем с помощью АСМ закрепляют частицу на кончике иглы зондового датчика. Наконец, завершая операции, оперативно подтверждают с помощью АСМ, что выбранная частица закреплена, см. также патент [№ 2 010 134 186 дата приоритета 27.08.2010]. В главе рассмотрен вариант способа, в котором используют отверждаемый УФ светом полиуретановый клей.

• Используя только АСМ со встроенной оптикой, изготовлены наборы специализированных зонды с радиусом закругления 70, 125, 135, 325, 450 нм. Определен выход годных зондов, который составил 20%.

• Исследована износоустойчивость специализированных зондов. Проведенные тесты показали, что коллоидная гранула остается на месте закрепления после нагрузки более 1 мкН.

• Повышена производительность технологии изготовления зондов, за счет: 1) оптимизации позиции закрепления гранулы на кончике (гранула должна находиться на одной из двух передних граней пирамиды иглы) — 2) использования метода фокусированного ионного пучка. Это позволило увеличить выход годных зондов до 80%.

• Налажено мелкосерийное производство специализированных зондов. В сотрудничестве с фирмами НТ СПб и НТ-МДТ осуществлены поставки более 500 зондов пользователям АСМ.

Глава 3. Исследование механических свойств 1D наносистем.

§ 3.1 Асбестовые нанотрубки — как одномерные системы.

В последние годы очень бурно развиваются научные направления, связанные с созданием и исследованием новых материалов для современной техники и наноэлектроники. Большой интерес научного сообщества вызывают исследования физических свойств материалов на основе кластеров из наночастиц металлов и полупроводников, сверхтонких нитей, волокон и различных нанокомпозитов [113, 114, 115, 116]. Перспективными объектами для создания нанокомпозитов являются одномерные системы, такие как нанотрубки, см. например, работы [117, 118, 119].

Одним из наиболее широко распространенных типов нанотрубок являются гидросиликатные наносвитки [120, 121]. Гидросиликатные наносвитки являются перспективным материалом-наполнителем для нанокомпозитов на основе полимерной матрицы. В работах [116, 122] рассматривались вопросы получения нанокомпозитов, содержащих в качестве наполнителя наночастицы на основе гидросиликатных наносвитков магния, с повышенными механическими и новыми функциональными свойствами, связанными, в частности, с особенностями транспортных характеристик таких материалов. Перспективным может быть и создание катализаторов на основе подобных нанокомпозитов. Несмотря на полученные в ряде работ положительные результаты по разработке нанокомпозитов, отсутствие развитых теорий, которые могли бы описать влияние состава и строения матрицы и наноразмерных включений на свойства композиционных материалов, существенно ограничивает возможности химического конструирования подобных нанокомпозитов. В свою очередь, создание таких теорий затруднено из-за недостаточного объёма экспериментальных данных о механических и функциональных характеристиках наночастиц, содержащихся в композиционном материале. А перенос свойств вещества в макрообъёме на наночастицы того же состава, во многих случаях не правомерен [123]. В связи с перечисленными причинами актуальным является проведение систематического исследования по изучению механических свойств нанотрубок, как перспективного материала-наполнителя для нанокомпозитов, и сравнение полученных результатов с соответствующими данными для массивных образцов того же состава.

В качестве объекта для подобных исследований был выбран нанотубулярный гидросиликат магния состава ]У^з81205(0Н)4. Его нанотубулярная структура схематически изображена на рис. 35а. Данное вещество можно получить двумя способами. Первый способ: добыча из природных месторождений, — в которых нанотубулярный гидросиликат магния содержится в макроразмерных образцах на основе минерала хризотила и представляет собой плотно упакованные пучки наносвитков, см. рис. 35Ь. Отдельные наносвитки можно получить дезагрегацией минерала хризотила [124]. Второй способ: искусственное получение, заключающееся в проведении синтеза из соответствующих реагентов в гидротермальных условиях, см. рис. 35с [125]. Наносвитки, полученные первым и вторым способом имеют практически одинаковые размеры внешних и внутренних диаметров, см. обозначения рис. 35а, обусловленные химической связью содержащихся в них компонент. Характерные значения 0=25−50 нм, ё=2−10 нм и межплоскостного расстояния а=7.3 А. Разброс в значениях диаметров обуславливается количественным содержанием посторонних примесей в составе М§ 38 1205(0Н)4. Содержание примесей может меняться в процессе синтеза (зависит от чистоты химического процесса) или, в случае природного получения, содержание примесей зависит от местоположения месторождения.

Итак, в данной главе будут изучаться механические свойства двух видов нанотрубок: 1) наносвитки гидросиликата магния, полученные дезагрегацией минерала хризотила (далее «природные асбестовые нанотрубки (наносвитки)») и 2) наносвитки гидросиликата магния, полученные синтезом в формирования природного минерала по сравнению с синтезированным материалом. Из приведенных в таблице 1 данных видно, что статистический разброс значений модуля Юнга достаточно большой и превышает 50%, хотя инструментальная погрешность одного измерения, как будет показано ниже, не превышает 25%. Анализ полученных результатов показывает, что разброс значений модуля Юнга синтезированных наносвитков существенно выше, чем у природных нансовитков того же состава. При этом следует отметить, что разброс значений модуля Юнга, определённых в данной работе, меньше, чем в работе [32].

Одной из причин, обуславливающих разброс величин модулей Юнга, является погрешность определения жёсткости нанотрубки, связанная с ошибками измерении параметров жесткости кантиливера — к^-, и наклонов силовых кривых — Эо и 8 (см. § 1.3 выражение (2)). Абсолютная ошибка ок5 определения локальной жесткости кз связана с ошибками измерений параметров: = J (?)4 4t) «1 + (£)Ч.

Используя (2) и (9), а также полагая абсолютные ошибки crSo= о$ = о (в обоих случаях ошибка определяется шумами сигнала отклонения кантилевера, DFL, пропорционального силе взаимодействия), можно получить следующее соотношение для относительной ошибки а^ /ks измерений ks:

1 + S2 где б = 5/50, Ф (б) = -——-. Функция Ф (8) имеет минимум при значении.

5 = 0.4534 (Фм1м — 19.63), при этом также минимальна и относительная ошибка. Интересно, что в этой точке Б примерно в два раза меньше Бо, что соответствует близости значений контактной жесткости и жесткости.

Относительная ошибка в измерении локальной жесткости трубки акх/к5 = 0.25, как это было показано выше. Тогда сохранение аЕк/Е5 приблизительно на том же уровне требует выполнения двух условий: о^/Ь «1/9 и о^/О «1/16, см. выражение (12). Характерный диаметр поры, над которой располагается изучаемый наносвиток, составляет около 600 нм, и точность в измерении длины лучше 60 нм легко достигается, относительная ошибка измерения длины аь/Ь в проводимых экспериментах не превышала 5%. Значения поперечного размера наносвитка (диаметра) определялось по его высоте на подложке. Плоские участки трековой мембраны имеют среднеквадратичное отклонение по высоте 5 нанометров и зернистую структуру с характерным размером зерна около 50 нм. Поскольку типичный диаметр наносвитка 30 нм, выполнить второе условие было значительно сложнее. Измерения диаметра необходимой точности (погрешность около 1 нм) были возможны у неизогнутых прямых наносвитков, обладающих участком по крайней мере микронной длины, опирающимся на подложку. В проводимых эксперментах относительная ошибка измерения диаметра <�т0/0 была не хуже 10%. Таким образом, можно заключить, что точность определения модуля Юнга наносвитка гидросиликата магния составляет 25−35% в основном из-за погрешности измерения изгибной жёсткости наносвитка, а также ошибки измерений его диаметра, вносящей второстепенный вклад в общую инструментальную погрешность.

Анализ экспериментальных данных показывает, что статистический разброс значений модуля Юнга наносвитков, как правило, существенно превышает инструментальную погрешность эксперимента. Как видно из таблицы 1, меньший разброс в значениях модуля Юнга наблюдается у природных нанотрубок, для которых характерен и меньший разброс в величине наружного диаметра. Также хорошо видно, что синтезированные нанотрубки имеют среднее значение модуля упругости более чем в 3 раза превышающее значение модуля Юнга природных нанотрубок. Возможно, различия в величине и разбросе значений модуля Юнга определяются структурными особенностями отдельных наносвитков. В частности, существенное влияние на механические характеристики вещества, находящегося в наноразмерном состоянии, может оказывать плотность дефектов. Известно о повышении механической прочности многостенных углеродных нанотрубок, подвергнутых воздействию высокоэнергетического электронного пучка [131]. Различная степень дефектности натуральных нанотрубок, возможно, возникает при разделении макрообразца на волокна (дезагрегация). Синтезированные наносвитки гидросиликата магния могут иметь в среднем большую плотность дефектов вследствие менее продолжительного времени формирования (синтеза), по сравнению с природными асбестовыми нанотрубками.

Таблица 2 — Данные рентгеноструктурный микроанализа природного и синтезированного нанотрубок хризотила. Данные получены в ФТИ им. А. Ф. Иоффе в лаборатории Гусарова В.В.

Объект Элементный состав, %.

О М8 81.

Природный хризотил-асбест 59.3±0.4 23.9±0.4 16.8±0.1 1,42±0.03.

Синтезированный хризотил-асбест 57.6±0.5 24.5±0.3 17.9±0.2 1.37±0.02.

Теоретическая формула М8з81205(0Н)4 64.28 21.43 14.29 1.50.

Действительно, данные рентгеноструктурного микроанализа, см. таблицу 2, показывают что состав, более близкий к стехиометрическому (к теоретической формуле), характерен для образцов наносвитков, полученных дезагрегацией природного минерала. У синтезированных нанотрубок наблюдаются более существенные отклонения стехиометрического состава от теоретической формулы. Это подтверждает наличие большей неоднородности в их строении и значениях морфологических параметров, а также большей дефектности структуры синтезированных нанотрубок (см. также наличие дефектных структур в синтезированных нанотрубках на ПЭМ изображении на рис. 35Ь).

Другой причиной большого разброса значений модуля Юнга может быть потенциально возможное заполнение внутреннего канала нанотрубок веществами различного состава, в частности, адсорбированной из воздуха водой, подробней см. § 3.4.

Значения модуля Юнга, определенные для макрообразцов минерала хризотила, представляющего собой пучки сросшихся друг с другом наносвитков, лежат в областях 120−210 ГПа по данным работ [132, 133]. Это, в принципе, сравнимо (с учетом погрешности) со значениями модуля Юнга отдельных природных наносвитков, измеренными в этой главе.

Для получения более точных результатов необходимо как совершенствование экспериментальной методики, так и проведение прецизионного анализа строения, морфологии, дефектной структуры каждого анализируемого наносвитка.

§ 3.4 Измерение механических характеристик нанотрубок с различными наполнителями.

В § 3.3 все измерения механических характеристик нанотрубок происходили в атмосферных условиях. В атмосфере во внутренних полых каналах нанотрубок должна конденсироваться вода. При переходе в форвакуумные условия (10″ 4−10″ 5 Па) у некоторых нанотрубок (как природных, так и синтезированных) наблюдалось повышение локальной жесткости (соответственно и модуля Юнга). Погрешность измерений локальной жесткости и модуля Юнга в данном случае была мала, так как исследования на воздухе и в вакууме проводились одним кантилевером, определенной жесткости кс, и на одних и тех же определенных нанотрубках. Такое повышение механических характеристик можно объяснить влиянием частичного испарения несвязанной воды из внутреннего канала наносвитка. В зависимости от лиофобных или лиофильных свойств жидкости, см. рис. 38 по отношению к внутренней поверхности наносвитка, жесткость последнего может изменяться за счет Лапласова давления в капилляре, см. стрелки на рис. 38. При испарении жидкости давление в капилляре будет изменяться, что также повлияет на жесткость наносвитка.

Для подтверждения влияния давления на внутренние стенки нанотрубок на их механические свойства также изучались природные нанотрубки хризотила с различными наполнителями. Полученные результаты показаны на рис. 39. Видно, что есть зависимость модуля Юнга нанотрубки от значения коэффициента поверхностного натяжения наполнителя. Например, максимальный модуль Юнга имеет нанотрубка с Оа, который имеет наибольший коэффициент поверхностного натяжения.

Конечно, для более весомых и качественных выводов о влиянии внутреннего давления в нанотрубках необходима значительно большая статистика. В данной работе эти результаты приведены для иллюстрации возможных дополнительных факторов, влияющих на измеряемый модуль Юнга нанотрубок. а).

Ь).

Рис. 38. Схематическое изображение нанотрубок заполненными жидкостью: а) жидкость не смачивает внутреннюю поверхность нанотрубки (лиофобность) и Ь) жидкость смачивает внутреннюю поверхность нанотрубки (лиофильность). Стрелками на схеме показано действие сил Лапласова давления.

Es (GPa.

100 coefficient of surface tension (10' N/m).

Рис. 39. Зависимость модуля Юнга нанотрубок (ЫТ) от коэффициента поверхностного натяжения различных наполнителей.

§ 3.5 Выводы.

Подведем итог основных результатов, полученных в данной главе:

• Реализован трех-точечный метод измерения жесткости подвешенных нанообъектов. С помощью АСМ проведены сравнительные измерения изгибной жёсткости природных и синтетических нанотрубок хризотила, перекрывающих субмикронные поры в трековой мембране.

• Определены значения модуля Юнга у натуральных и синтетических нанотрубок. У натуральных нанотрубок модуль Юнга согласуется в пределах ошибки измерений с литературными данными для макроскопических образцов. Синтезированные нанотрубки имеют значение модуля Юнга более чем в 3 раза превышающее этот же параметр у натуральных нанотрубок. Показано, что последнее может быть связано с большей дефектностью и неоднородностью синтезированных наносвитков.

• Произведен анализ ошибки определяемых механических параметров. Показано, что на точность измерения механических характеристик в «трехточечном» методе наиболее сильно влияют погрешности определения коэффициента жесткости кантилевера и высоты (диаметра) измеряемой нанотрубки.

Глава 4. Исследование механических свойств 2D наносистем.

§ 4.1 Полисилоксановые блок-сополимерные ультратонкие пленки как двухмерный объект.

Современные полимерные материалы это широко изучаемая область прикладных наук. Связано это в первую очередь с тем, что различные полимерные композиты по своим прочностным характеристикам сравнимы с такими материалами как кевлар и углеродные волокна, но значительно дешевле в получении [134]. Это обстоятельство, а также другие особенные свойства полимерных материалов делают перспективным их использование в космической, авиационной и других гражданских отраслях техники и промышленности [135]. Например, полисилоксановые блок-сополимеры вызывают интерес как материал для формирования тонких и ультратонких пленок. Такие пленки могут использоваться в качестве защитных покрытий, к примеру, изоляционная обмотка электропроводов, весьма перспективным считается их применение в мембранной технологии [136, 137].

Полиблочные полисилоксановые блок-сополимеры состоят из двух сополимеров состава (AnBm)x. Сополимер (А), так называемый жесткий блок с высокой температурой стеклования и сополимер (В) — гибкий блок с низкой температурой стеклования. В общем случае супрамолекулярная организация пленок обусловливается целым рядом факторов: мольным соотношением n/m и молекулярными параметрами сомономеровтермодинамическим качеством растворителя, из которого формируются пленкискоростью удаления растворителятемпературной предысторией пленок. Определяющим фактором является термодинамическая несовместимость жесткого и гибкого блоков, препятствующая полному разделению фаз и приводящая к образованию наногетерогенной структуры [138, 139]. Поскольку основным носителем ценных для практического использования свойств блоксополимеров является гибкий блок, синтез проводят таким образом, чтобы дисперсионная среда формировалась именно этим блоком. Образующиеся в таких условиях домены жесткого блока создают межфазные слои [140, 141]. Совместное действие перечисленных выше факторов приводит к тому, что свойства полиблочных сополимеров могут существенно отличаться от простой суммы индивидуальных физико-химических и физико-механических свойств гомополимеров. Методы атомно-силовой микроскопии оказываются источником ценной информаций для понимания структуры и свойств сополимеров [142, 143, 53]. В особенности это относится к ультратонким пленкам с толщиной, сопоставимой с размерами доменов, когда применение стандартных методик определения прочностных параметров становится практически неосуществимым. Ультратонкие пленки, толщина которых может составлять 100 — 1000 нм, вполне могут рассматриваться как двухмерные объекты. Размер доменов сополимера в таких пленках, существенно больше латерального разрешения АСМ и составляет десятки нанометров, что позволяет в обычных условиях изучать различные варианты упаковки доменов на поверхности [143].

Помимо структурных особенностей морфологии блок-сополимерных пленок, особый интерес вызывают их упруго-механические свойства, так как физико-химические и прочностные параметры ультратонких полимерных пленок могут значительно отличаться от свойств полимера в блочном состоянии [144, 145, 146, 147]. Теория дисперсно-упрочненных материалов предсказывает, что прочностные параметры материала можно улучшить при ведении в объем полимера модифицирующих добавок наноструктурированных веществ [148]. Поэтому в работе также изучалось влияние модифицирующих добавок Сбо на прочностные параметры блок-сополимера. При диагностике локальных механических свойств обычно используется метод индентирования, см. § 1.3. Достоверность определяемых прочностных параметров, однако, существенным образом зависит от информации о форме самого кончика АСМ зонда, с помощью которого выполняется индентация.

В данной работе исследовались ультратонкие пленки полиблочного полисилоксанового сополимера лестничного фенилсилсеквиоксана (ЛФС) и полидиметилсилоксана (ПДМС), выпускаемые ВНИИСК им. Лебедева, формулы: сн, сн, сн, сн,.

СЧ I /О^ | /О^ ! /О^ ^ | /О. si si si si.

III I.

CH, cib CH, Cll, i.

Используя для длины Si-0 связи и угла Si-O-Si мостика параметры, например, кварца, 0.161 нм и 144°, можно оценить максимальные размеры жесткого (ЛФС) и гибкого (ПДМС) блоков примерно в 7 и 18 нм, соответственно. Образцы для исследований приготавливались следующим образом: 1 г ЛФС-ПДМС с разным количеством модификатора С60 разбавлялся в 5.5 г толуоладля химической сшивки в приготовленный раствор добавлялось 0.33 г сшивающего агента (торговая марка «Винилоксим»), Раствор распылялся аэрографом на твердую очищенную от органических загрязнений кремниевую подложку. Такое формирование пленок хорошо моделирует реальный процесс формирования пленок полимера. После высыхания растворителя характерный размер распыленных капель составлял десятки микрон, высота капель лежала в диапазоне 500−1000 нм. Изучалось шесть образцов, описание которых приведено в таблице 3.

Таблица 3 — Описание образцов.

Номер образца Содержание Сб0 в ЛФС-ПДМС, wt.% Наличие «Винилоксима».

1 0.000 Нет.

1 + 0.000 Да.

2+ 0 001 Да.

3+ 0.003 Да.

4+ 0.01 Да.

5+ 0.03 Да.

Как известно [2], истинный рельеф тем меньше искажен в АСМ изображении, чем острее зонд. Однако причина лучшего разрешения мелких деталей на поверхности образца 4+ не в использовании более острого зонда. Сначала исследовался образец 1, рис. 40а, а затем образец 4+, рис. 40Ь, и в более поздний момент зонд, скорее наоборот, мог затупиться. АСМ изображения на рис. 40 были получены при средней силе взаимодействия около 100 пН, см. подпись к рисунку. Сосредоточение этой силы на кончике зонда, паспортный радиус кривизны которого составляет менее 10 нм, может создать в материале напряжение более одного МПа, что сопоставимо с макроскопическим модулем Юнга блок-сополимера ЛФС-ПДМС [148]. При таком уровне воздействия зонд АСМ деформирует поверхность сополимера.

Как правило, при АСМ исследовании образца № 1 хорошо выявлялись только более грубые (~ 100 нм) изменения в рельефе. На вставке к рис. 40а, однако, показан удачный вариант визуализации тонких (примерно 30−50 нм) структур. Можно предположить, что в данном случае кончик зонда оказался более затупленным, чем обычно, что уменьшило возмущение поверхности сканированием. Элементы структуры с периодом приблизительно 35 нм уверенно детектировались также и в поверхностном рельефе других образцов. Увеличение средней силы взаимодействия выше порога примерно в 1 нН приводило, однако, к размытию регистрируемого АСМ изображения и исчезновению в нем тонкой ячеистой структуры. Учитывая разницу в поверхностной энергии жесткого и гибкого блоков, можно предположить, что домены жесткого блока соответствуют возвышенностям в АСМ изображениях [143, 149]. Тогда сглаживание рельефа изображения при увеличении силы можно связать с внедрением жестких доменов в более мягкую дисперсионную среду, сформированную гибким блоком сополимера.

Таким образом, полуконтактное АСМ исследование рельефа сополимера возмущает его поверхность, и в измеряемых топографиях поверхности разных образцов проявляются также прочностные свойства образца. Для воспроизводимого наблюдения в АСМ элементов структуры толщиной 35 нм требовалось, чтобы средняя сила не превышала некоторого порога. Уровень порога для образцов без сшивающего агента оказывался примерно на порядок ниже, чем в противном случае.

Введение

сшивающего агента в объем полимера не сказывается заметным образом на супрамолекулярной организации блок-сополимера.

§ 4.3 Измерение упруго-механических свойств полисилоксановых блок-сополимерных пленок с помощью стандартных АСМ зондов.

После исследования структурных особенностей рельефа ультратонких пленок блок-сополимера, можно перейти к изучению их механических характеристик. В начале образцы с различными модифицирующими добавками С6о подвергались индентационным тестам (см. § 1.3) с использованием стандартных АСМ зондов. Отпечатки, оставшиеся на поверхности образцов № 2+ и 5+ после индентирования на глубину 8 м ~ 140 нм, показаны на рис. 41а и b (см. также профили на рис. 41, с). Наблюдается существенная разница в глубине сформировавшихся отпечатков при приблизительно одинаковых размерах в плоскости. В образце № 5+, содержащем 0.03% фуллерена, глубина отпечатка, характеризующая остаточную неупругую деформацию сополимера, 5R ~ 0. А в образце 2+, содержащем 0.001% фуллерена, 5R ~ 15 нм. Следует отметить, что улучшение упругости поверхностных слоев образца № 5+ по сравнению с образцами № 1+, 2+ и 3+ уверенно регистрировалось при использовании намеренно затупленных зондов. В частности, результаты рис. 41 были получены с помощью зонда с радиусом закругления кончика около 100 нм (кривизна кончика определялась после испытаний с помощью решетки TGT1, см. описание процедуры, например, в работе [150]). Размеры отпечатков в плоскости, как уже было отмечено выше, слабо зависели от вариаций состава блоксополимера, и в основном определялись значением 5 М. Профиль на рис. 41с показывает, что диаметр отпечатка на рис. 41а составляет около 300 нм. Сечением сферы радиусом 140 нм на высоте 140 нм будет окружность с приблизительно теми же тремстам нанометрами в диаметре. Это совпадение не случайно и указывает на простой сценарий формирования отпечатка (см. рис.44а) при индентировании полимера: твердый АСМ зонд погружается в мягкий образец и практически не деформирует его вне области контакта. Такой сценарий следует также учитывать при определении механических параметров материала по нагрузочно-разгрузочным кривым, измеряемым во время индентации. Точная форма и геометрия кончика стандартного зонда непосредственно во время выполнения индентационных тестов, однако неизвестна, что затрудняет количественный анализ. с) I о W^^Oo Е с N.

— 15 -о- <�¦> ./ —(b) V о.

300 х, nm.

Рис. 41. Наиоидентациоиные испытания образцов стандартным зондом. Полуконтактные АСМ изображения участков поверхности образцов 2+ (а), и 5+ (Ь) после индентирования, с максимальной силой около 190 нН в обоих случаях. Профили рельефа в области индентационных отпечатков вдоль соответствующих линий на (а) и (Ь) представлены на ©. И визуализация и индентирование проводились с помощью намеренно затупленного зонда NSG01 (кс=4.7 Н/мрадиус закругления кончика определенный после измерений с помощью стандартной тестовой решетки TGT1 составлял 140 нм).

§ 4.4 Измерение упруго-механических свойств полисилоксановых блок-сополимерных пленок с помощью специализированных сферических зондов субмикронного калиброванного радиуса кривизны.

Как уже говорилось выше, неизвестная геометрия кончика стандартных зондов делает невозможным оперативное получение точных количественных данных о механических свойствах образца. Пирамиды большинства стандартных зондов в рабочем положении, см. рис. 3 в § 1.3, не симметричны относительно поверхности, что крайне затрудняет количественный анализ. Для количественных измерений необходимо использовать калиброванные по размерам и форме зонды АСМ. Причем, для получения адекватных данных, радиус кончика таких зондов должен быть сопоставим с толщиной измеряемых пленок. Специализированные сферические зонды субмикронного калиброванного радиуса кривизны хорошо подходят для проведения количественного анализа механических свойств ультратонких полимерных пленок.

Для исследования упруго-прочностных параметров полисилоксановых блок-сополимерных пленок использовался специализированный зонд с радиусом кончика 325 нм, см. рис. 42f. При АСМ индентации такой зонд формировал на поверхностях различных образцов отпечатки почти круглой формы диаметром несколько сотен нанометров, см. рис. 42а — 42е. Измеряемая после индентации глубина отпечатков 5R была по величине примерно на порядок меньше глубины индентации 5 М, что указывает на существенную релаксацию слоев сополимера. У образцов 4+ и 5+ наблюдалась наименьшая 8r (фактически равная 0), т. е. почти полная релаксация, см. профили всех трех отпечатков на рис. 42g. Глубина отпечатков на образцах 4+ и 5+ сравнима с амплитудой неровностей окружающей поверхности сополимера, что еще раз подтверждает полную релаксацию поверхности полимера после снятия нагрузки у образцов содержащих 0.01% (4+) и 0.03% (5+) добавки фуллеренов. Полная зависимость относительной неупругой деформации, Д, (100%-5к/5м) полимеров от процентного количества содержания фуллеренов приведена на.

Рассмотрим инструментальный вклад формы зонда [2] в АСМ изображения. Радиус кончика используемых специализированных зондов составляет 325 нм, см. рис. 42f, что примерно на порядок меньше глубины отпечатков (см. профили на рис. 42g). Например, диаметр крайнего левого отпечатка на рис. 42а составляет около 560 нм, а его глубина, см. рис. 42g, около 30 нм. Рельеф изображения в области отпечатка можно аппроксимировать сферой с радиусом кривизны Rj~5602/(8−30)~1306 нм, что в несколько раз больше радиуса кривизны зонда. Для отпечатков меньшей глубины соотношение между радиусами только возрастало. Таким образом, инструментальный вклад слаб, а размеры отпечатков в АСМ изображениях близки к достоверным.

Д,%.

1050 а У Relative residual inelastic deformation a) } b) 1 c) J d) i e) *.

Рис. 43. Зависимость относительной неупругой деформации от количества модифицирующей добавки фуллеренов в полимерных пленках: (а) — полимер без добавок Сбо и связывающего агента (С.А.) (образец 1), (а)* - (а)+С.А. (образец 1+), (Ь) — (а)*+0.001% С60 (образец 2+), © -(а)+С.А.+0.003% С6о (образец 3+), (d) — (а)+С.А.+0.01% С60 (образец 4+), (е) -(а)+С.А.+0.03% С6о (образце 5+). Статистика считалась по 25 проведенным индентационным тестам.

В проводимых экспериментах был использован простейший вариант индентирования, не компенсирующий проскальзывание зонда в плоскости образца. Эффект возникает из-за того, что кантилевер с зондом устанавливается в держатель не горизонтально, а под некоторым углом, который для приборов компании НТ-МДТ составляет около 20°. Например, при вертикальном перемещении образца, на 250 нм, фактор наклона ведет к неконтролируемому горизонтальному движению зонда на расстояние около 90 нм (~250^(20°)). Эффект может приводить к небольшой вытянутости отпечатков (эллиптичности), сделанных сферическим индентором. Отпечаток, диаметром примерно 560 нм, на рис. 42а образовался после индентации образца на глубину 8М=249 нм. Ожидаемая из-за эффекта вытянутость отпечатка примерно 15% (100%-90/560), при меньших индетациях вытянутость отпечатка будет около 10%. Утверждать, что на рис. 42а достоверно наблюдается отпечаток такой вытянутости, однако не корректно. Исходные неровности рельефа поверхности полимера приводят к неопределенностям в измерениях формы отпечатка. Поскольку результат эффекта мал, в дальнейших оценках можно не учитывать возможную вытянутость отпечатков.

Стоит обсудить поточнее, каким образом специализированный зонд индентирует поверхность полимера. Возможны два варианта сценария индентации, см. рис.44а, Ь. В первом варианте деформация полимера происходит только в области контакта с индентором, что очень удобно, так как все параметры (диаметр контакта, Б, и глубина индентации (деформации), 5М) известны, см. рис. 44а. Во втором варианте деформируется не только область контакта, но рядом лежащие области. Такой сценарий индентации сложнее, так как известной остается только величина 5 М, а остальные параметры такие как: Б и фактическая глубина индентации, 5*м, становятся не известными, см. рис. 44Ь. Проведенные эксперименты показали, что размеры отпечатков от специализированного зонда плавно зависели от глубины индентации. Предполагая погружение сферы радиуса в материал на глубину контакта можно вычислить диаметр контакта как длину хорды, которая, по теореме наименьших квадратов аппроксимированы плавной кривой Б = 2-^21⁰ ¦ (х5м) — (х6м)2> в которой 2К0=650 нм, а параметр аппроксимации X = /5М = 0.91. Близость к единице единственного варьируемого параметра служит важным аргументом в пользу малости деформации образца (всего 9%) вне области индентационного контакта. Это подтверждает предложенный при обсуждении данных рис. 41 наиболее простой сценарий формирования отпечатка, рис. 44а.

При индентировании образцов специализированными зондами получались хорошо воспроизводимые и плавные, удобные для анализа, нагрузочно-разгрузочные зависимости сила — деформация (описание получения этих зависимостей приведено в § 1.3). Для сравнения, зависимости, полученные стандартным зондом, показаны на рис. 45а. На представленных кривых обнаруживаются изломы, появление которых можно связать с немонотонными изменениями формы острия зонда с удалением от кончика. Кривые на рис. 45а демонстрируют сильный гистерезис. Ширина гистерезиса характеризует уровень остаточной неупругой деформации и оказывается приблизительно одинаковой для всех образцов. Принципиально другая картина наблюдается в поведении плавных, без изломов нагрузочно-разгрузочных кривых на рис. 45Ь, измеренных специальным зондом сферической формы: максимальный гистерезис у образца 1, минимальный у образца 4+. Более того, в отличие от данных на рис. 45а, крутизна зависимостей (жесткость) на рис. 45Ь меняется вполне закономерным образом: возрастает примерно на порядок величины при добавлении сшивающего агента.

На рис. 45с показаны зависимости жесткости от деформации, определенные по нагрузочно-рагрузочным кривым, полученным при разных скоростях индентации образца 1. Жесткость растет при увеличении нагрузки по сублинейному, близкому к корневому степенному закону, а убывает при снятии нагрузки сверхлинейным образом. Максимальная нагрузочная жесткость в несколько раз меньше максимальной разгрузочной. Такая разница в амплитуде.

Важно заметить здесь, что, при полностью пластической реакции на приложение нагрузки, разгрузочная жесткость, определяемая как тангенс угла наклона разгрузочной кривой, будет казаться бесконечно большой, так как сила взаимодействия практически моментально исчезнет. В действительности, при полностью пластичном поведении материала, разгрузочная жесткость должна быть равна нулю. В принципе, пластичность и, в особенности, ползучесть материала могут приводить даже к кажущимся отрицательным разгрузочным жесткостям [151, 152, 153].

Кроме пластичности, в форму кривых вносит вклад также и вязкость полимера. Например, нагрузочная кривая на рис. 45с, измеренная при более высокой (на два порядка) скорости деформации, демонстрирует не значительное увеличение жесткости, по сравнению с нагрузочной кривой, измеренной медленно. Увеличение нагрузочной жесткости при быстрой деформации можно связать с ростом силы вязкого трения, пропорциональной скорости движения зонда в полимере. Подробный анализ зависимости механических параметров полимера от скорости индентации выходит за рамки данной работы, во всех проведенных измерениях скорость индентации о поддерживалась постоянной, приблизительно на уровне 10″ м/с.

Наконец отметим, что вектор силы между зондом и образцом, рис. 45а и 45Ь, принимает отрицательные значения, соответствующие притяжению. В связи с этим есть неоднозначность в определении точки контакта. На рис. 45 эта точка совпадает с минимумами в нагрузочных силовых кривых или, что равнозначно, с нулем в нагрузочной жесткости. В итоге, в анализе формы идентационных кривых следует учитывать: вязкость, пластичность и ползучесть полимера, а также особенности адгезивного взаимодействия (капиллярного или, например, электростатического), см. подробнее рассмотрение соответствующих эффектов и моделей в работах [15, 154, 155].

С учетом сделанных выше замечаний, точное количественное моделирование экспериментальных кривых представляется довольно сложным.

Интересно, тем не менее, что для всех изученных образцов поведение нагрузочной жесткости удовлетворительно описывалось простой корневой зависимостью, соответствующей приближению Дерягина-Муллера-Топорова теории Герца упругого контакта сферы — плоскость [15], см. подгоночную кривую на рис. 45с. Такое согласие послужило основанием для вычисления значений Е, модуля Юнга сжатия поверхностных слоев полимера, см. таблицу 4. Количественные оценки механических свойств образцов можно получить и без анализа формы индентационных кривых. По измеряемой площади отпечатков, S, которая считалась равной площади контакта индентора с образцом и максимальной величине нагрузки FMAX, были также определены значения Н, твердости по Бриннелю, H=FMAx/S [15]. Площадь индентационных отпечатков в АСМ изображениях определялась с помощью программы SPM Image Magic [156], а также с помощью модуля Grain Analysis штатной программы Nova Интегра Аура [126]. Модуль использовался в режиме измерения пор, а величина порога настраивалась на уровень невозмущенной индентацией поверхности. В изученных образцах твердость Н находится на уровне нескольких МРа, см. данные таблицы 4, и по величине близка к значениям прочности макроскопических пленок полимера на разрыв [148].

Согласно данным таблицы 4, наилучшие механические параметры обнаруживаются у образцов 4+ и 5+. При сопоставимых с образцом 1+, 2+ и 3+ прочностных параметрах, поверхностные слои образцов 4+ и 5+ (полимер с добавкой 0.01% С6о и 0.03% С6о, соответственно) оказываются более упругими. Значение коэффициента относительной неупругой деформации, Д, у образцов 4+ и 5+ близки к 0 (учитывая среднюю шероховатость поверхности), что означает, что полимер практически полностью восстанавливается после снятии нагрузки, см. рис. 46d, е и обсуждение к нему. У образца 3+ (полимер с добавкой 0.003% Сб0) упругие свойства (Д) оказываются лучше, чем у образцов 1, 1+ и 2+, но значительно уступают образцам 4+ и 5+. Образец 2+ (полимер с добавкой 0.001% С6о) имеет коэффициент Д, сравнимый по значению с Д у образцов 1 и 1+, то есть влияние добавки Сбо в данном количестве не существенно. В принципе модуль Юнга, Е, у образцов 3+, 4+ и 5+ по среднему значению превосходит Е у 1+ и 2+, но в пределах ошибки это не так существенно. Интересно, что введение связывающего агента во все образцы, кроме № 1 (чистый блок-сополимер), приводит к значительному увеличению таких прочностных параметров как модуль Юнга, Е, и твердость, Н. А дополнительное введение модифицирующей добавки С60 приводит к более однородному распределению упругих параметров (значение, А у образцов с Сво имеет меньший разброс, чем у полимера со связывающим агентом, см. таблицу 4). Добавка фуллеренов начинает улучшать упругие свойства полимера при концентрации 0.003% в его объеме и существенно увеличивает упругость при концентрациях 0.01% и 0.03%.

Таблица 4 — Упруго-прочностные параметры образцов, определенные с помощью АСМ образца 1 1+ 2+ 3+ 4+ 5+.

Е, модуль Юнга сжатия *, [МПа] 11±2 106±31 103±24 116±22 122 116 123 119.

Н, твердость по Бриннелю**, [МПа] 0.6±0.2 3.1 ±0.9 3.2±0.7 3.711.1 11.113.7 60 130.

А, относительная остаточная неупругая деформация ***, [%] 12.2±1.9 17±2.6 15.5±1.2 1011.5 1.910.6 0.910.6.

Примечания:

Для определения модуля Юнга экспериментальные значения коэффициента нагрузочной жесткости к (5)ЕХР = ёБ/ёб, см. рис.4с, аппроксимировались модельной зависимостью 2Е Iк (5)мш =—Л8хЯ0 [15], см. описание в § 1.3. Коэффициент Пуассона у=0.5, Яо=325 нм.

1-у) Н = РМАХ/8, где Б это площадь отпечатка, а в Имах учитывалась также сила адгезии, которая определялась по разгрузочным кривым, для 5+ большая ошибка обусловлена сложностью измерения площади отпечатка, так как 8 у этого образца стремится к 0. Д =100%-5к/8м.

Механизм такого улучшения упруго-деформационных свойств сополимера пока представляется не до конца ясным. Можно предположить, например, координационную (каталическую) роль фуллерена, приводящую к дополнительной агрегации жёстких блоков дисперсионной среды и упрочнению межмолекулярных связей полимера. Будем, для простоты оценки, считать растворы с микродобавками С6о в сополимере истинно молекулярными.

3 3.

Учитывая плотность материала 1.05 г/см, вычислим концентрацию Сбо в 1 см для всех образцов с микродобавками: n2+ = NA • m/fiC60, где NA — число.

•у.

Авогадро, ш/цсбо — число молей молекул Сбо в 1 см полимера. Значит: п2+= 6.022−1023-(1−05−10−5/720)" 8.8−1015 см" 3, n3+" 2.6−1016 см" 3, n4+" 8.8−1016 см" 3, n5+A 2.6−1017 см" 3. Далее оценим соответствующие средние расстояния между.

Сбо" а2+ =п~1/3ж 48 нм, а3+"34 нм, а4+"22 нм, а5+"15 нм. Сравнивая эти значения с размерами ячейки сетки доменов жестких блоков, 35 нм, можно подсчитать, что в образцах 4+ и 5+ на каждую ячейку сетки блок-соплимера приходится в среднем 4 и, соотвественно, 12 молекул С6оВ образце 3+ на каждую ячейку приходится примерно 1 молекула С6о, а в образце 2+ одна молекула примерно на 2−3 ячейки. Эксперимент демонстрирует, что при переходе от образца 3+ к образцу 4+ наблюдается существенное подавление относительной неупругой деформации. Именно в этот момент на одну ячейку пространственной сетки начинает приходиться несколько и более молекул фуллеренов, что, действительно, может указывать на качественное изменение роли Сбо в упрочнении межмолекулярных связей в образцах 4+ и 5+.

§ 4.5 Выводы.

Итак, в данной главе были получены следующие результаты:

• С помощью АСМ выявлена пространственная сетка доменов жесткого блока сополимеров в ультратонких полимерных пленках с характерным размером ячейки около 35 нм.

• Выполнены количественные измерения упруго-прочностных характеристик ультратонких пленок блок-сополимеров с помощью специальных калиброванных сферических зондов АСМ субмикронного радиуса кривизны.

• Проведенные измерения показали, что происходит усиление упругих свойств блок-сополимера (относительная остаточная неупругая деформация почти полностью исчезает) при введении в его объем дополнительно к сшивающему агенту 0.01% и 0.03% фуллеренов. Концентрация 0.01% соответствует нахождению в характерной ячейке межблочной доменной структуры приблизительно одной молекулы фуллерена Механизм усиления упругих свойств может быть связан с «залечиванием» дефектов структуры агрегатов жестких блоков в присутствии молекул фуллеренов.

Глава 5. Исследование механических свойств 3D наносистем.

§ 5.1 Биологическая клетка как трехмерный физический объект.

Постоянное совершенствование приборов для диагностики материалов открывает новые возможности исследования в клеточной биологии, медицине и биофизике. Особенно важную роль играют исследования индивидуальных биологических клеток с помощью современных физических методов. Но, на удивление, такой объект как живая биологическая клетка на настоящий момент слабо изучен, как на механическом, так и на морфологическом уровне. Информация, по большей части, носит визуальный характер, то есть это данные оптических или электронных микроскопов. Методики сканирующей электронной микроскопии позволяют получить нанометровое разрешение, но, существенный недостаток состоит в том, что исследуется при этом не живая, а мертвая, высушенная клетка. Исследовать живые биологические объекты общепринято оптическими методиками, разрешение которых ограничено дифракционным пределом оптической системы и, как правило, лишь немного лучше микронного. Развитие флуоресцентной микроскопии и ее применение в биологии, однако, дало существенный скачок в понимании устройства внутриклеточных процессов, но, тем немее, очевидно, что перечисленные методики не могут предоставить информации о механических, тактильных, характеристиках.

Изучение локальной жесткости и модуля Юнга индивидуальных клеток актуально, например, для проявления взаимодействия с клеткой различных вирусов. Механические параметры одиночных клеток служить индикаторами ее злокачественного перерождения и трансформации [71]. Информация о механическом портрете живой клетки важна в исследованиях изменений содержания липидных компонентов [99], при изучении механизмов действия различных лекарственных препаратов [97, 98]. Тактильные нанометровые восприятия живых клеток может дать АСМ. Зонд АСМ может прямым образом механически «ощупать» трехмерное устройство биологических клеток, и, что особенно ценно, сделать это в физиологическом растворе. Однако, см. подробней § 1.3 и § 1.4, широкое использование АСМ в исследованиях живых клеток затруднено, что, как мы считаем, в большой степени вызвано недостатками стандартных АСМ зондов для таких исследований. В этой главе демонстрируется, как с помощью изготовленных специализированных сферических зондов субмикронного калиброванного радиуса кривизны можно проводить исследования механических свойств живых клеток различных линий.

В особенности, мы были заинтересованы определить механические свойства кровяных клеток миелоидной лейкемии человека К562. Изменение упруго-механических свойств этих клеток влияет на общий кровоток в сосудах и капиллярах организма человека. В локальном отклике клетки на механическое воздействие, в ее механическом портрете, ведущую роль играет кортикальный цитосклет (вблизи клеточной мембраны). Трансформации, перестройки цитоскелета могут быть инициированы отклонениями от нормы концентраций различных важных компонент в липидном бислое [99, 157]. Примером такой важной компоненты липидного бислоя считается холестерин. В нашем исследовании, чтобы вызвать изменения механических свойств клетки, уровень холестерина специально варьировался. Изучение механических свойств субмембранных структур клетки, в том числе холестериновых микродоменов, кортикального цитоскелета, потенциально становится возможным только при субмикронном радиусе кривизны зондов, которые позволяют информативное индентационное субмикронное тестирование, исключающее «паразитное» влияние более глубоко расположенных ядер клеток, см. § 1.3.

Клетки миелоидной лейкемии человека К562 культивировались в среде RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 80 мкг/мл гентамицина, см. подробней в [157]. Данные клетки были получены из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт.

Петербург). Для снижения уровня мембранного холестерина использовали метил-бета-циклодекстрин (МбЦД) — циклический олигосахарид, являющийся селективным акцептором стиролов. Клетки инкубировали с МбЦД в питательной среде в течение 40 минут (37 °С, 5% С02), [157].

В качестве объектов для апробации специализированных сферических зондов субмикронного калиброванного радиуса кривизны были также исследованы живые клетки следующих линий: 1) L41, лимфобластоидная клеточная линия лейкемического происхождения, 2) А549, эпителиальные клетки карциномы легкого человека. Клетки культивировались по стандартной методике для монослойных культур, описанной в [158], в пластиковых чашках Петри диаметром 40 мм. Использовалась стандартная ростовая среда, и среда, в которую добавлялся растворимый в воде комплекс С6(/ПВП (фуллерен/поливинилпироллидол) с целью выявить влияние фуллерена на механические свойства клеток. Ранее было показано, что в малых концентрациях Сбо/ПВП не токсичен для клеток в культуре, и даже обладает защитным действием против вызванной УФ облучением фототоксичности клеток [159, 160]. Данные клетки были получены из Российской коллекции клеточных культур (НИИ Гриппа, Санкт-Петербург).

Зрелые клетки транспортировались из НИИ Гриппа и Института цитологии РАН в ФТИ в герметичном термостатируемом контейнере. Все культуры клеток выращивались в пластиковых чашках Петри, обработанных полилизином для лучшего закрепления клеток на дне чашек. Непосредственно перед АСМ исследованиями питательный раствор в чашке Петри с образцами клеток замещался физиологическим раствором при комнатной температуре. Все АСМ эксперименты с клетками выполнялись в течение 8 часов после замены питательного раствора.

§ 5.2 Исследование рельефа и механических характеристик живых клеток А549 и L41 с помощью специализированных сферических зондов субмикронного калиброванного радиуса кривизны.

При АСМ исследовании живой клетки желательно чтобы давление нанометрового острия стандартного зонда поддерживалось ниже уровня прочности объекта, иначе такие измерения могут стать разрушающими. Специализированные зонды субмикронного радиуса кривизны дают возможность понизить уровень контактного давления и сохранить целостность клетки за счет ухудшения разрешения в плоскости до известного приемлемого уровня, который определяется диаметром прикрепленной гранулы, см. рис. 47.

Рис. 47. СЭМ фотография специализированного зонда С8С12 С с приклеенной коллоидной 8102 гранулой радиусом 325 нм. На выделенной вставке приведено увеличенное СЭМ изображение кончика зонда с гранулой.

Рельеф клеток А549 и Ь41 измерялся в жидкостной ячейке в полуконтактном режиме, данные систематизировались по параметру средней за период силы постукивания (Р,-5), см. § 1.3 формула (1). Хотя работа в полуконтактном режиме в жидкости сопровождается определенными трудностями, см. подробней см. § 1.3, несомненным плюсом полуконтактного режима является факт малых сил латерального трения, что меньше возмущает клетку во время сканирования.

Для исследования живых клеток А549 и L41 использовался зонд CSC12C с 650 нм Si02 гранулой на кончике, см. рис. 47, жесткость кантилевера измерялась по алгоритму Садера [50], кс=0.4 Н/м. Полученные с помощью такого зонда полуконтактные АСМ изображения живых клеток двух различных линий приводятся на рис. 48 и рис. 49.

На рис. 48а и 48Ь показаны АСМ изображения рельефа группы (около десяти) живых клеток L41 культивированных в стандартной ростовой среде, полученные при средней силе взаимодействия (Fts) = 0.55 нН. У клеток L41 выявляется плавный рельеф. Наиболее высокие области, по-видимому, сформированы ядрами, более жесткими образованиями по сравнению с остальными частями клетки. Соответствующие ядрам области определяются, однако не всегда однозначно.

Использование зонда с 650 нм гранулой также позволило исследовать клетки линии А549. Одиночная клетка А549 выглядит в АСМ изображении на рис. 48с и 48d распластанной, в самой высокой части ее рельефа можно выделить ядро диаметром 3−4 микрона. На периферии клетки наблюдаются вытянутые особенности, соответствующие, как можно предположить, актиновым псевдоподиям [87]. Псевдоподии отвечают за движение и образуются преимущественно в направлении перемещения клетки. На рис. 48f и 48е приведены АСМ изображения пары клеток А549 выращенных среде, содержащей Сбо/ПВП. В рельефе обоих клеток четко выражены ядерные области. В отличие от одиночной клетки, псевдоподии располагаются по периферии клетки не симметрично. Как можно видеть на рис. 48f, клетки соприкасаются вдоль плавной границы.

Выпячивание отростков псевдоподий, вызываемое полимеризацией актина под мембраной, может быть подавлено близостью к другой клетке, что известно как эффект так называемого контактного торможения [87]. Завершая анализ топографии рельефа клеток, стоит подчеркнуть, что в данных на рис. 48с-48е, а также других аналогичных, но не представленных здесь, изображениях клеток А549, каких-либо специфических особенностей рельефа, проявляющих разные условия культивирования клеток, замечено не было.

Рассмотрим на рис. 49 результаты исследования механических свойств живых клеток L41, культивировавшихся в среде Сб</ПВП. Наблюдается хорошее соответствие контуров клетки в АСМ изображениях на рис. 49а и 49Ь с контурами клетки в области АСМ сканирования, выделенной на оптической фотографии на рис. 49с. Оптическая фотография была получена после АСМ измерений и дополнительно свидетельствует в пользу того, что АСМ воздействие использованного 650 нм зонда сохраняет целостность клетки и не открепляет ее от поверхности подложки. Открепившиеся клетки данных линий легко опознать в оптическом изображении: в подвешенном состоянии они имеют сферическую форму, — см., например, на рис. 49с два пузырька, примыкающих справа к области АСМ сканирования. При анализе механических свойств, профиль обратной жесткости (податливость, котангенс угла наклона F (8) кривых) можно сопоставить с соответствующим профилем высоты рельефа клетки, см. рис. 49d. При измерении силовых кривых глубина индентации была меньше радиуса гранулы, 325 нм. Поскольку высота клетки ~2 мкм, паразитный вклад в измеряемые значения жесткости от твердой подложки мал [161]. Более того благодаря субмикронной величине индентации на воздействие откликается сравнительно тонкий поверхностный слой, и как видно на рис рис. 49d, податливость клетки слабо меняется от места к месту. Можно отметить, однако, что максимальной высоте рельефа соответствует область несколько пониженной податливости — повышенной жесткости. Это согласуется с предположением, что наиболее высокие области содержат более.

L41 почти на порядок жестче, чем А549, и эффект упрочнения в L41 может нивелироваться на фоне ошибки измерений. Для уточнения результатов наиболее важно исключить воздействие на живые клетки условий транспортировки. Для этого, требуется проводить АСМ исследования в непосредственной близости от места культивирования клеток.

Таблица 5 — Данные АСМ измерений модуля Юнга живых клеток L41 и А549.

Образец Число проанализированных клеток Es, модуль Юнга.

L41 контроль 4 17.911.3 кПа.

Ь41+Сб0/ПВП 2 17.5+1 кПа.

А549 контроль 3 3.8±1.9 кПа.

А549+С60/ПВП 4 7.7±2.8 кПа.

§ 5.3 Исследования роли холестерина на механические свойства живых клеток К562 с помощью специализированных сферических зондов субмикронного калиброванного радиуса кривизны.

По сравнению с L41 и А549, клетки К562 слабее фиксировались полилизином, и сканирование в полуконтактном режиме открепляло их от дна чашки Петри. Для уменьшения возмущающего воздействия зонда, АСМ был переведен в поточенный режим, см. § 1.3, но получить стабильную топографию все равно не удалось. Живые кровяные клетки К562 имеют форму близкую к сферической (исходя из данных оптической микроскопии), при осаждении на подложку они образуют что-то вроде полусферы. Как видно из рис.50а., латеральные размеры клеток составляют более 20 мкм, следовательно, высота клеток имеет значения более 10 мкм. Такие большие размеры могли также вызвать трудности в получении стабильной АСМ топографии.

Механические свойства К562 измерялись в режиме силовой спектроскопии специализированным АСМ зондом CSG30 с 650 нм гранулой на кончике, см. вставку на рис.50а, кс=0.787 Н/м, жесткость кантилевера вычислялась по алгоритму Садера [50]. Зонд позиционировался над клеткой с помощью оптического микроскопа, см. рис.50а. Контактная локальная жесткость определялась путем численного дифференцирования кривых сила-деформация F (5), пример зависимостей F (S), приведен на. рис.50Ь, модуль Юнга вычислялся аналогичным образом, описанным в § 5.2, § 1.3. Глубина индентирования при измерении механических параметров была меньше радиуса гранулы, 325 нм. При высоте клеток более 10 мкм, такая индентациия гарантировала, что исследовался лишь сравнительно тонкий слой клетки, включающий в себя мембранные и субмембранные структуры (липидный бислой, холестериновые микродомены, цитоскелет), исключая паразитный вклад от глубоко лежащих клеточных ядер и от еще более далекой твердой подложки. а).

30 LI in h—н b).

MbCD.

100 200 §, nm.

Pnc.50. а) Оптическая фотография специализированного ACM зонда и исследуемых клеток К562 в питательном растворе. На вставке приведена СЭМ фотография используемого в исследованиях специализированного АСМ зонда CSG30 с SiC>2 гранулой на кончике, радиус гранулы 325 нм, кс=0.787 Н/м. Ь) Зависимости сила-деформация F (S) измеренные на контрольных клетках (красная кривая) и после обработки МбЦД (синяя кривая), с) Результаты измерений модуля Юнга контрольных (красный столбик) и обработанных МбЦД (синий столбик) клеток К562.

Проведенные измерения показали, что локальная жесткость и модуль Юнга клеток К562 после обработки МбЦД увеличились в 1.5 раза, см. рис.50Ь, с и таблицу 6, соответственно. Стоит отметить, что полученные абсолютные значения модуля Юнга для клеток К562 хорошо согласуются с данными по другим линиям клеток, например см. § 5.2. Известно, что обработка МбЦД.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Подведем итоги. Достигнуты основные цели диссертационной работы: разработан количественный подход в АСМ измерениях механических свойств нанои микросистем, создан необходимый инструментарий в виде специализированных зондов, развитый подход проиллюстрирован исследованиями механических свойств хризотиловых нанотрубок, ультратонких полисилоксановых покрытий, живых клеток эукариот.

Сформулируем основные результаты этих исследований.

Реализована «трех-точечная» АСМ методика количественного тестирования механических свойств одномерных объектов, а именно хризотиловых нанотрубок. Показано, что:

1) В трех-точечном АСМ методе измерения жесткости подвешенных нанообъектов основной вклад в погрешность определения модуля Юнга наносвитков дают ошибки в определении диаметра наносвитка и в калибровке жесткости АСМ кантилевера.

2) В наносвитках хризотила, синтезированных в гитротермальных условиях, значение модуля Юнга в более чем 3 раза больше значения модуля упругости у наносвитков натурального минерала, что связано с большей дефектностью и неоднородностью первых.

Несовпадение модуля Юнга у нанотрубок синтезированного и природного хризотила представляется существенным. В природе у нанотрубок хризотила аспектное отношение может достигать нескольких десятков тысяч, в то время как у изученных синтезированных нанотрубок отношение длины к диаметру, как правило, не превосходило сотни. Причина в том, что природный хризотил медленно формировался в более равновесных условиях. Полученные результаты позволяют, таким образом, вывод, что несовершенство синтезированного материала связано не только с не достаточно продолжительным временем формирования, но также и с пока еще не оптимизированными условиями синтеза.

Разработана технология специализированных сферических зондов АСМ субмикронного калиброванного радиуса кривизны, необходимых для количественных исследований механических свойств двухмерных и трехмерных объектов.

3) Предложенная технология специализированных зондов, позволяет изготавливать износостойкие и антикоррозийные зонды калиброванного радиуса кривизны для проведения количественных неразрушающих исследований рельефа и механических свойств объектов малой жесткости (модуль Юнга 1КПа-10МПа), с субмикронным пространственным разрешением.

4) Выявлено значительное улучшение упругости тонких (субмикронных) поверхностных слоев полисилоксановых блок-сополимеров достигается при введении в его объем дополнительно к сшивающему агенту винилоксиму более 0.01% фуллеренов.

Важным представляется, что существенный скачек в улучшении упругих свойств блок-сополимера (относительная остаточная неупругая деформация почти полностью исчезает) наблюдается для образцов с пороговой концентрацией фуллеренов 0.01%, и эффект стабилизируется с дальнейшим ростом концентрации фуллеренов. Пороговая концентрация соответствует нахождению в характерной ячейке межблочной доменной структуры (размер которой, согласно полученным АСМ данным составляет 35 нм) более одной молекулы фуллеренов. Механизм усиления упругих свойств может быть, таким образом, связан с каталитическим «залечиванием» дефектов структуры агрегатов жестких блоков в присутствии хотя бы одной молекулы фуллерена.

5) Проведены количественные неразрушающие исследования топографии и механических свойств живых биологических клеток L41 и А549. Обнаружена существенная разница в морфологии рельефа, в величине модуля Юнга клеток. Это результат демонстрирует также хорошие перспективы применения специализированных АСМ зондов для развития новых диагностик клеточной биологии.

6) Показано значительное (на 80−90%) снижение уровня мембранного холестерина клеток К562 приводит к увеличению модуля Юнга субмембраных структур клетки в 1.5 раза.

Последний результат крайне интересен для понимания роли холестерина во внутриклеточных процессах. До нашей работы механические свойства клеток и ее мембранных и субмембранных структур в зависимости от уровня холестерина изучались только косвенными методами. В АСМ можно прямо измерить механические параметры клеток. Специализированные сферические АСМ зондов субмикронного калиброванного радиуса кривизны открывают исследователю доступ к анализу механического отклика мембранных и субмембранных структур клетки, где происходят важные химико-биологические процессы.

Результаты наших АСМ экспериментов с живыми клетками важны для прогнозирования побочных эффектов терапии, направленной на модификацию липидного бислоя и снижение уровня холестерина. Новая информация по клеткам А549 и L41 представляет интерес для изучения влияния комплекса С60/ПВП на механические свойства клеток и, как следствие, более глубокого понимания его роли в подавлении фототоксичности.

В итоге можно заключить, что цель и основные задачи диссертации были достигнуты и успешно выполнены.

Автор крайне признателен своему научному руководителю и другу A.B. Анкудинову за мотивацию, образование, жизненный и научный опыт, полученные в ходе совместной плодотворной работы по подготовке данной диссертации.

Автор благодарит зав. лабораторией оптики поверхности А. Н. Титкова, а также сотрудников этой лаборатории М. С. Дунаевского, П. А. Алексеева, П. А. Дементьева, зав. лабораторией физико-химических свойств полупроводников Е. И. Терукова, В. Е. Корсукова, своих друзей A.B. Савельева и И. И. Новикова за оказанную помощь и поддержку. Большое спасибо М. В. Филатову, В.В. Исаеву-Иванову, М. Ю. Еропкину, О. И. Киселеву, В.И. Чубинскому-Надеждину, Ю. А. Негуляеву за помощь в обсуждении и получении результатов биологической главы диссертации. Хочу поблагодарить М. Ф. Кудоярова, В. Н. Неведомского, В. В. Гусарова, A.A. Красилина, Б. О. Щербина, Ю. А. Кумзерова за помощь в обсуждении и получении результатов третьей главы диссертации. Автор признателен А. П. Возняковскому и Шумилову Ф. А. за помощь в обсуждении и получении результатов 4 главы диссертации, а также A.B. Стовпяге, A.A. Феклистову, А. О. Голубку и сотрудникам компании НТ-МДТ за оказанную помощь в оптимизации технологии изготовления специализированных АСМ зондов, зав. лаб. физики аморфных полупроводников В. Г. Голубеву и его сотрудникам Е. Ю. Трофимовой, Д. А. Курдюкову за предоставленные образцы Si02 гранул.

Автор особенно благодарен своей семье и любимой невесте Сухих Н. М. за терпение, всестороннюю помощь и поддержку.

1. Binnig G., Quate С.F. and Gerber С. Atomic Force Microscope // Phys. Rev. 1986.-Lett. 56.-p. 930−933.

2. Миронов B.JI. Основы Сканирующей Зондовой Микроскопии: Учебное пособие для студентов старших курсов высших учебных заведений / Миронов В. Л. // Нижний Новгород: ИФМ РАН. — 2004. — 110 с.

3. Sarid D. Exploring scanning probe microscopy with «Mathematica» // John Wiley& Sons, Inc., New York. — 1997, — 262 p.

4. Рыбалкина M. Нанотехнологии для всех / Рыбалкина М. // М.: Nanotechnology News Network. — 2005. — С. 30.

5. http://www.ntmdt-tips.com/products/group/golden.

6. http://www.brukerafmprobes.com.

7. http://probe.olympus-global.com.

8. http://www.nanosensors.com/productscatalog.html.

9. http://www.spmtips.com/afm-probes.afm.

10. http://www.anasysinstruments.com/products/probes.

11. http://www.nanoworld.com/afm-probes-catalog.

12. Meyer G., Amer N. M. Novel optical approach to atomic force microscopy // Appl. Phys. Lett. — 1988. — 53. — P. 1045−1074.

13. Alexander S. et al. An atomic-resolution atomic-force microscope implemented using an optical lever // J. Appl. Phys. — 1989. — 65, — P. 164−167.

14. Colchero J, Marti O. et al. Scanning force and friction microscopy // Phys. Status Solid. — 1991, — 131(a).-P. 73−75.

15. Bhushan В. Handbook of Micro/Nanotribology / Bhushan B. 2d ed. // Boca Raton etc.:CRC press. — 1999. — 859 p.

16. Giessibl F.J. Advances in atomic force microscopy // Rev. Mod. Phys. -2003.-75,-P. 949−983.

17. Бараш Ю. С. Силы Ван-дер-Ваальса // M: «Наука». — 1988. — 344 с.

18. http://www.ntmdt.ru/spm-basics/view/probe-sample-interaction-potential.

19. Albrecht Т. R., Grutter P., Home D and Rugar D. Frequency modulation detection using high-Q cantilevers for enhanced force microscope sensitivity // J. Appl. Phys. — 1991. — 69. — P. 668.

20. Giessibl F.J. Forces and frequency shifts in atomicresolution dynamic-force microscopy // Phys. Re v. B. — 1997. — 56(24). — P. 16 010−16 015.

21. Hao H.W., Baro A. M. and Saenz J. J. Electrostatic and contact forces in force microscopy//J. Vac. Sci. Technol. — 1991. — В 9. — P.1323−1329.

22. Yongho Seo and Wonho Jhe. Atomic force microscopy and spectroscopy // Rep. Prog. Phys. — 2008. — 71. — P. 16 101 (1−23).

23. Martin Y., Williams С. C. and Wickramasinghe H. K. Atomic force microscope—force mapping and profiling on a sub 100-A scale // J. Appl. Phys. — 1987.-61.-P. 4723−4729.

24. Zhong Q., Inniss D., Kjoller K., Elings V.B. Fractured polymer/silica fiber surface studied by tapping mode atomic force microscopy // Surf. Sci. Lett. — 1993. -290. — P. L688-L692.

25. Garcia R., San Paulo A. Attractive and repulsive tip-sample interaction regimes in tapping-mode atomic force microscopy // Phys. Rev. B. — 1999. — 60(10). -P. 4961−4967.

26. Gleyzes P et al. Bistable behavior of a vibrating tip near a solid surface // Appl. Phys. Lett. — 1991. — 58(25). — P. 2989−2991.

27. Garcia R. and Perez R. Dynamic atomic force microscopy methods // Surface Science Reports. — 2002. — 47. — P. 197−301.

28. Bielefeldt H., Giessibl F. J. A simplified but intuitive analytical model for intermittent-contact mode force microscopy based on Hertzian mechanics // Surface Science. — 1999. — 440. — P. L863-L867.

29. Sahin O. et.al. An atomic force microscope tip designed to measure time-varying nanomechanical forces // Nature Nanotechnology. — 2007. — 2. — P. 507−514.

30. Физическая энциклопедия в 5-ти томах / Прохоров А. М. // М.: Советская энциклопедия — 1988. — том 3. — 672 с.

31. Walters D. A. et al. Elastic strain of freely suspended single-wall carbon nanotube ropes // Appl. Phys. Lett.. — 1999. — 74. — P. 3803−3805.

32. Piperno S. et al. Characterization of Geoinspired and Synthetic Chrysotile Nanotubes by Atomic Force Microscopy and Transmission Electron Microscopy // Adv. Funct. Mater. — 2007. — 17. — P. 3332−3338.

33. Ландау JI.Д., Лившиц Е. М. Теоретическая физика: Учеб. пособ.: Для вузов. В Ют .И ФИЗМАТ ЛИТ, М. 5-е изд., стереот. — 2003. — том VII. Теория упругости. — 264 с.

34. Wu В., Heidelberg A., Boland J.J. Mechanical properties of ultrahigh-strength gold nanowires // Nature Materials. — 2005. — 4. — P. 525 — 529.

35. Yu M. F. et al. Strength and Breaking Mechanism of Multiwalled Carbon Nanotubes Under Tensile Load // Science. — 2000. — 287. — P. 637−640.

36. Salvetat J.-P. et al. Mechanical properties of carbon nanotubes // Applied Physics. — 1999. — A 69. — P. 255−260.

37. Cuenot S. et al. Elastic Modulus of Polypyrrole Nanotubes // Phys. Rev. Lett. — 2000. — 85. — P. 1690−1693.

38. Jing G. Y. Surface effects on elastic properties of silver nanowires: Contact atomic-force microscopy // Phys. Rev. — 2006. — В 73. — P. 235 409 1−235 409 6.

39. Yu M. F., Kowalewski T. and Ruoff R.S. Investigation of the Radial Deformability of Individual Carbon Nanotubes under Controlled Indentation Force // Phys. Rev. Lett. — 2000. — 85. — P. 1456−1459.

40. Кумзеров Ю. А. и др. Тепловые и акустические свойства хризотилового асбеста // ФТТ. — 2005. — 47(2). — С. 357−360.

41. Aksu S. В. and Turner J. A. Calibration of atomic force microscope cantilevers using piezolevers // Rev. Sci. Instrum. — 2007. — 78. — P. 43 704 (1−8).

42. Sader J. E. Parallel beam approximation for V-shaped atomic force microscope cantilevers // Rev. Sci. Instrum. — 1995. — 66. — P. 4583- 4587.

43. Neumeister J. M. and Ducker W.A. Lateral, normal, and longitudinal spring constants of atomic force microscopy cantilevers // Rev. Sci. Instrum. — 1994. — 65. -P. 2527−2531.

44. Senden Т., Ducker W. Experimental Determination of Spring Constants in Atomic Force Microscopy // Langmuir. — 1994. — 10 (4). — P. 1003−1004.

45. Butt H.J. et al. Scan speed limit in atomic force microscopy // J. Microsc. -1993. 169.-P. 75−84.

46. Gibson С. T. et. al. Determination of the spring constants of probes for force microscopy/spectroscopy // Nanotechnology.- 1996. — 7. — P. 259−262.

47. Tortonese M., Kirk M. Characterization of application specific probes for SPMs // Int. Soc. Opt. Eng. — 1997. -3009. — P. 53−60.

48. Cleveland J. P. A nondestructive method for determining the spring constant of cantilevers for scanning force microscopy // Rev. Sci. Instrum. — 1993. -64.-P. 403−405.

49. Hutter J.L. and Bechhoefer J. Calibration of atomic-force microscope tips // Rev. Sci. Instrum. — 1993.-64.-P. 1868−1873.

50. Sader J.E. Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope // J. Appl. Phys. — 1998. — 84. — P. 64−76.

51. Wu В., Heidelberg A., Boland J. Mechanical properties of ultrahigh-strength gold nanowires // Nature Materials. — 2005. — 4. — P. 525−529.

52. Алексеев П. А. и др. Определение модуля Юнга нанопроводов GaAs, наклонно растущих на подложке // ФТП. — 2012. — 46(5). — С. 659−664.

53. VanLandingham M.R. et al. Nanoindentation of polymers: An overview // Macromol. Symp. — 2001. — 167. — P. 15−43.

54. Oliver W.C., Pharr G.M. An improved technique for determining hardness and elastic modulus using load and displacement sensing indentation experiments // J. Mater.Res. — 1992. — 7(6). P. 1564−1583.

55. Снеддон И. Н., Берри Д. С. Классическая теория упругости. / Пер. с англ. под ред. Э. И. Григолюка // М.: Физматгиз. -1961.-219 с.

56. Fischer-Cripps А.С. Critical review of analysis and interpretation of nanoindentation test data // Surface & Coatings Technology. — 2000. — 200. — P. 4153−4165.

57. VanLandingham M. R. et al. Recent Progress in Nanoscale Indentation of Polymers Using the AFM // SEM IX International Congress on Experimental Mechanics. Proceedings. Society for Experimental Mechanics. — 2000, Orlando, FL. -P. 912−915.

58. Domke J., Radmacher M. Measuring the Elastic Properties of Thin Polymer Films with the Atomic Force Microscope // Langmuir, — 1998. — 14. — P. 3320−3325.

59. Clifford C. A., Seah M. P. Quantification issues in the identification of nanoscale regions of homopolymers using modulus measurement via AFM nanoindentation // Applied Surface Science. — 2005. — 252. — P. 1915;1933.

60. Cappella В., Dietler G. Force-distance curves by atomic force microscopy // Surface Science Reports. — 1999. — 34. — P. 1−104.

61. Дерягин Б. В., Чураев Н. В., Муллер В. М. Поверхностные силы. — М.: Наука, — 1985.-398 с.

62. Derjaguin B.V., Muller V.M., Toporov Y.P. Effect of contact deformations on the adhesion of particles // Colloid Interface Sei. — 1975. — 53. — P. 314−326.

63. Li Y. Q. et al. Direct Measurement of Interaction Forces between Colloidal Particles Using the Scanning Force Microscope // Langmuir. — 1993. — 9. — P. 637 641.

64. Mak L. H., Fuchs H. et al. Reproducible attachment of micrometer sized particles to atomic force microscopy cantilevers // Rev. Sei. Instrum. — 2006. — 77. — P. 46 104 1−3.

65. Ducker W. A. et al. Direct measurement of colloidal forces using an atomic force microscope // Nature — 1991. — 353. — P. 239 — 241.

66. Gan Y. Invited Review Article: A review of techniques for attaching micro-and nanoparticles to a probe’s tip for surface force and near-field optical measurements// Rev.Sci.Instrum. — 2007. — 78. — P. 81 101 (1−8).

67. Лебедев Д. В., Бухараев A.A. и др. Измерение модуля Юнга биологических объектов с помощью специального зонда атомно-силового микроскопа // ПЖТФ — 2009. — 35 (8). — С. 54−61.

68. Kuznetsov V., Papastavrou G. Note: Mechanically and chemically stable colloidal probes from silica particles for atomic force microscopy // Rev. Sci. Instrum. — 2012. — 83. — P. 116 103 (1−3).

69. Rabe U., Janser K., Arnold W. Vibrations of free and surface-coupled atomic force microscope cantilevers: Theory and experiment // Rev. Sci. Instrum. -1996.-67.-P. 3281−3293.

70. Turner J.A., Hirsekorn S., Rabe U., Arnold W. High-frequency response of atomic-force microscope cantilevers // J. Appl. Phys. — 1997. — 82. — P. 966−979.

71. Vanapalli S. A., Duits M., Mugele F. // Biomicrofluidics. — 2009. — 3. — P. 1 2006(1−15).

72. Butt H.-J., Wolff E.K., Gould S.A.C., Dixon Northern B., Peterson C.M., Hansma P.K. Imaging cells with the atomic force microscope // Journal of Structural Biology. — 1990, — 105 (1−3).-P. 54−61.

73. Haberle W., Horber J. K. H. and Binnig G. Force microscopy on living cells//JVST.- 1991.-B 9.-P. 1210−1213.

74. Ohnesorge F. M., Horber J. K. H., Haberle W., Czerny C.-P., Smith D. P. E. and Binnig G. AFM Review Study on Pox Viruses and Living Cells // Biophysical Journal. — 1997. — 73. — P. 2183−2194.

75. Frey M.T. et al. Cell Mechanics Book Series: Methods in Cell Biology / Edited by Wang Y.L., Discher D. E // San Diego: Elsevier Academic Press Inc. 2007. -V. 83.-P. 47−65.

76. Mazia D., Schatten G. and Sale W. Adhesion of cells to surfaces coated with polylysine. Applications to Electron Microscopy // Journal of Cell Biology. — 1975.-66(9).-P. 198−200.

77. Kasas S., and Ikai A. A method for anchoring round shaped cells for atomic force microscope imaging // Biophys. J. — 1995. — 68 — P. 1678−1680.

78. Alsteens D., Dupres V., McEvoy K., Wildling L., Gruber H.J. and Dufrene Y.F. Structure, cell wall elasticity and polysaccharide properties of living yeast cells, as probed by AFM // Nanotechnology. — 2008. — 19. — P. 384 005 1−9.

79. Ohnesorge F. M., Horber J. K. H., Haberle W., Czerny C.-P., Smith D. P. E. and Binnig G. AFM Review Study on Pox Viruses and Living Cells // Biophysical Journal. — 1997. — 73. — P. 2183−2194.

80. Paul M. R., Clark M. T., Cross M. C. The stochastic dynamics of micron and nanoscale elastic cantilevers in fluid: fluctuations from dissipation // Nanotechnology. — 2006. — 17. — P. 4502−4513.

81. Kiracofe D. and Raman A. Nonlinear dynamics of the atomic force microscope at the liquid-solid interface // Phys. Rev. — 2012. — 86. — P. 205 405 (116).

82. Kuznetsova T.G., Chizhik S.A., Zhdanov R.I. et al. Atomic force microscopy probing of cell elasticity // Micron. — 2007. — 38. — P. 824−833.

83. Jena P., Horber J.K.H. Atomic Force Microscopy in Cell Biology Book Series: Methods in Cell Biology / Edited by Jena P., Horber J.K.H // San Diego: Elsevier Academic Press Inc.2002. — V. 68. — P. 67−90.

84. Domke J., Parak W.J., George M., Gaub H.E. and Radmacher M. Mapping the mechanical pulse of single cardiomyocytes with the atomic force microscope // Eur. Biophys. J. — 1999.-28.-P. 179−186.

85. Henderson E., Haydon P.G. and Sakaguchi D.S. Actin filament dynamics in living glial cells imaged by atomic force microscopy // Science. — 1992. — 257. — P. 1944;1946.

86. Rotsch C. and Radmacher M. Drug-induced changes of cytoskeletal structure and mechanics in fibroblasts — An atomic force microscopy study // Biophys. J. — 2000. — 78. — P. 520−535.

97. Oberleithner H. et al. Potassium softens vascular endothelium and increases nitric oxide release // PNAS. — 2009. — 106. — P. 2829−2834.

98. Lam W. A., Rosenbluth M. J., Fletcher D. A. Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness // Blood. — 2007. — 109. — P. 3505−3508.

99. Chubinskiy-Nadezhdin V. I., Negulyaev Y. A., Morachevskaya E. A. Cholesterol depletion-induced inhibition of stretch-activated channelsis mediated via actin rearrangement //BBRC. — 2011 — 412. — P. 80−85.

100. Hansma P.K., Drake B., Marti O., Gould S.A., Prater C.B. The scanning ion-conductance microscope // Science. — 1989. — 243(4891). — P. 641−643.

101. Korchev Y.E., Bashford C.L., Milovanovic M., Vodyanoy I., Lab M.J. Scanning ion conductance microscopy of living cells // Biophys. J. — 1997. — 73(2). -P. 653−658.

102. Rheinlaender J., Geisse N.A., Proksch R. and Schaffer T.E. Comparison of Scanning Ion Conductance Microscopy with Atomic Force Microscopy for Cell Imaging // Langmuir. — 2011. — 27(2). — P. 697−704.

103. Neher E., Sakmann B. et al. Improved Patch-Clamp Techniques for HighResolution Current Recording from Cells and Cell-Free Membrane Patches // Pfluegers Arch. — 1981.-391.-P. 85−100.

104. Seliger R. L. et al. A high-intensity scanning ion probe with submicrometer spot size // Appl. Phys. Lett. — 1979. — 34. — P. 310−312.

105. http://microspheres-nanospheres.com.

106. Stober W., Fink A., Bohn E. Controlled growth of monodisperse silica spheres in the micron size range // J. Colloid Interface Sci. — 1968. — 26. — P. 62−69.

107. Трофимова Е. Ю. и др. Влияние предварительной обработки тетраэтоксисилана на синтез коллоидных частиц аморфного диоксида кремния // Коллоид, журн. — 2011. — 73. — С. 535−539.

108. Каплан С. Ф., Курдюков Д. А., Голубев В. Г. И др. Наноструктурированные одномерные и трехмерные магнитофотонные кристаллы на основе пористого кремния и искусственных опалов // Известия РАН: серия физическая — 2007. — 71(1). — С. 29−32.

109. Рехвиашвили С. Ш., Розенберг Б. А., Дремов В. В. Влияние размерной зависимости поверхностного натяжения жидкой пленки на капиллярную силу в атомно-силовом микроскопе // Письма в ЖЭТФ. — 2008. — 88(11). — С. 887.

110. San Paulo A. and Garcia R. Tip-surface forces, amplitude, and energy dissipation in amplitude-modulation (tapping mode) force microscopy // Phys.Rev. B. -2001.-64.-P. 193 411.

111. http://www.ntmdt-tips.com/products/view/tgtl.

112. http://www.fixme.ru/products/ritelok/uv.html.

113. Богомолов B.H., Кумзеров Ю. А. — Препринт ФТИ им. А. Ф. Иоффе АН СССР № 971. Л. — 1985. — 59 с.

114. Kumzerov Yu.A. Nanostructured Films and Coatings / ed. Gan-Moog Chow, Ovid’ko I.A., Tsakalakos T. — Nato Science Series 3. High Technology. Kluwer Academic Publ., Dordrecht-Boston-London. — 2000. — 78. — 63 p.

115. Помогайло А. Д. Гибридные полимер-неорганические нанокомпозиты // Успехи химии. — 2000. — 69. — С. 60−89.

116. Кононова C.B., Гусаров В. В. и др. Нанокомпозит на основе полиамидоимида с гидросиликатными наночастицами различной морфологии// Журн. прикл. химии. — 2007. — 80. — С. 2064;2070.

117. Ивановский A.JI. Неуглеродные нанотрубки: синтез и моделирование // Успехи химии. — 2002. — 71. — С. 203−224.

118. Захарова Г. С., Волков В. Л., Ивановская В. В., Ивановский А. Л. Нанотрубки и родственные наноструктуры оксидов d-металлов: синтез и моделирование // Успехи химии. — 2005. — 74. — С. 651−685.

119. Еняшин А. Н., Ивановский А. Л. Нанотубулярные композиты: моделирование капиллярного заполнения нанотрубок дисульфида молибдена молекулами TiC14 // Наносистемы: физика, химия, математика. — 2010. — 1. — С. 63−71.

120. Roy D.M., Roy R. An Experimental Study of the Formation of Synthetic Serpentines and Related Layer Silicate Minerals // Am. Mineral. — 1954. — 39. — P. 957−975.

121. Tenne R. Inorganic Nanotubes and Fullerene-like Nanoparticles // Nat. Nanotechnol. — 2006. — 1. — P. 103−111.

122. Yudin V.E., Gusarov V.V. et al. Effects of Nanofiller Morphology and Aspect Ratio on the Rheo-Mechanical Properties of Polyimide Nanocomposites // Express Polymer Lett. — 2008. — 2. — P. 485−493.

123. Иванова E.A., Кривцов A.M., Морозов Н. Ф. Особенности расчёта изгибной жёсткости нанокристаллов // ДАН. — 2002. — 385. — С. 494−496.

124. Kumzerov Y., Vakrushev S. Nanostructures Within Porous Materials / Encyclopedia of Nanoscience and Nanotechnology. — American Scientific Publishers. -2004. — P. 811−849.

125. Корыткова Э. Н., Маслов А. В., Пивоварова Л. Н., Дроздова И. А., Гусаров В. В. Формирование на состава Mg3Si205(0H)4 в гидротермальных условиях // Физ. и хим. стекла. — 2004. — 30. — С. 72−78.

126. http://www.ntmdt.com/software.

127. Чивилихин С. А., Попов И. Ю., Свитенков А. И., Чивилихин Д. С., Гусаров В. В. Формирование и эволюция ансамбля наносвитков на основе соединений со слоистой структурой // ДАН. — 2009. — 429. — С. 185−186.

128. Bhushan В., Fuchs Н., Tomitori М. Applied scanning probe methods VII: Scanning probe microscopy techniques / ed. by Bhushan В., Fuchs H., Tomitori M. -Springer Berlin Heidelberg. — 2008. — 465 p.

129. Burnham N.A., Chen X., Hodges C.S., Matei G.A., Thoreson E.J., Roberts C.J., Davies M.C., Tendler S.J.B. Comparison of calibration methods for atomic-force microscopy cantilevers. // Nanotechnology. — 2003. — 14. — P. 1−6.

130. Matei G.A., Thoreson E.J., Prattand J.R., Newell D.B., Burnham N.A. Precision and accuracy of thermal calibration of atomic force microscopy cantilevers // Rev. Sci.Instrum. — 2006. — 77. — P. 83 703 (1−6).

131. Kis A. Mechanical Properties of Mesoscopic Objects / Thesis for the degree of Doctor of Science. — Ecole Polytechnique Federate de Lausanne. — 2003. -166 p.

132. Чемякина H.A., Иванов B.B. Использование хризотилового волокна в пенобетонах // Экспозиция — 2007. — 9. — С. 6−7.

133. Соколов П. Н. Производство асбестоцементных изделий. — Высш. шк., М. — 1970. -288 с.

134. Баженов С. Л., Берлин А. А., Кульков А. А., Ошмян В. Г. Композиционные полимерные материалы: Прочность и технология. -Интеллект, Москва. — 2010. — 352 с.

135. Берлин А. А. Современные полимерные композиционные материалы // Соросовский образовательный журнал. — 1995. — 1. — С. 57−65.

136. Dolgoplosk S., Savchenko V., Martyakova N., Aleskovskaya E. // Papers of 5 International Conference. on Silicone in Coatings, Brussel. — 1996. — P. 17.

137. Ямпольский Ю. П, Сидоренко В. М., Бондарь В. И., Тарасов A.B., Сторожук И. П. // Высокомолек.соед. А. — 1996. — 18(3), — С. 837.

138. Роговина Л. З., Слонимский Г. Л. // Успехи химии. — 1977. — 46(10). -С. 1871.

139. Ношей А., Мак-Грат Дж. Блок-сополимеры. — М. Мир. — 1980. — 478 с.

140. Липатов Ю. С. Коллоидная химия полимеров. — Киев, Наукова думка, — 1984.-344 с.

141. Вакула В. Л., Притыкин Л. М. Физическая химия адгезии полимеров.

— М.: Химия. — 1984. — 224 с.

142. Knoll А. et al. Phase behavior in thin films of cylinder-forming block copolymers // Phys.Rev.Lett. — 2002. — 89. — P. 35 501 (1−4).

143. Меньшиков E.A. Автореферат диссертации к.ф.-м.н. — МГУ, Москва.

— 2009.

144. Волчек Б. З., Пуркина A.B., Никитин В. Н. // Высокомолек. соед. А. -1976, — 18(6).-С. 1203.

145. Годовский Ю. К., Конюхова Е. В., Малинский Ю. М., Милешкивич, С. Б. Долгоплоск В.П., Щербакова Т. К., Дорофеенко Л. П. // Высокомолек. соед. Б. — 1985. — 27(1). — С. 73.

146. Берштейн В. А., Левин В. Ю., Егорова Л. М., Егоров В. М., Жданов A.A., Слонимский Г. Л., Рябкина А. Ю., Завин Б. Г., Гриценко О. Т. // Высокомолек.соед. А. — 1987. — 29(11). — С. 2362.

147. Эренбург Е. Г., Долгоплоск С. Б., Терентьева Л. М., Савченко В. М., Генкин А. Н., Петрова H.A. // Высокомолек. соед. Б. — 1991. — 32(8). — С. 586.

148. Возняковский А. П. Самоорганизация в нанокомпозитах на основе детонационного синтеза // ФТТ. — 2004. — 46(4). — С. 629.

149. Puskas J.E., Antony P., El Fray M., Altstadt V. The effect of hard and soft segment composition and molecular architecture on the morphology and mechanical properties of polystyrene-polyisobutylene thermoplastic elastomeric block copolymers // European Polymer Journal. — 2003. — 39. — P. 2041.

150. Bhushan В., Kwak K. J and Palacio M. // J. Phys.: Condens. Matter. -2008.-20.-P. 365 207.

151. Ngan A.H.W., Wang H.T., Tang В., Sze K.Y. Correcting power-law viscoelastic effects inelastic modulus measurement using depth-sensing indentation // Int. J. Solids Struct. — 2005. — 42. — P. 1831.

152. Tranchida D. et al. Mechanical Characterization of Polymers on a Nanometer Scale through Nanoindentation. A Study on Pile-up and Viscoelasticity // Macro molecules. — 2007. — 40. — P. 1259.

153. Passeri D. et al. Indentation modulus and hardness of viscoelastic thin films by atomic force microscopy: A case study // Ultramicroscopy — 2009. — 109. — P. 1417.

154. Sun Y., Akhremitchev В., Walker G.C. Using the Adhesive Interaction between Atomic Force Microscopy Tips and Polymer Surfaces to Measure the Elastic Modulus of Compliant Samples // Langmuir. — 2004. — 20. — P. 5837.

155. Lin D.C., Dimitriadis E. K., Horkay F. Elasticity of rubber-like materials measured by AFM nanoindentation // eXPRESS Polymer Letters. — 2007. — 1(9). — P. 576.

156. http://knol.google.eom/k/spm-software.

157. Чубинский-Надеждин В. И. Роль мембранного холестерина в регуляции механочувствительных ионных каналов и актинового цитоскелета: дис. канд. биол. наук: 03.03.04: защищена 14.12.2012 — Санкт-Петербург. -2012.-112 с.

158. Соминина А. А. Методические рекомендации по работе с клеточными культурами и средами // Изд-во ВНИИ гриппа МЗ СССР. -1975. -43 с.

159. Пиотровский Л. Б., Еропкин М. Ю., Еропкина Е. М., Думпис М. А., Киселев О. И. Механизмы биологического действия фуллеренов — зависимость от агрегатного состояния // Психофармакол. биол. наркол. — 2007. — 7(2). — С. 1548−1554.

160. Еропкин М. Ю., Пиотровский Л. Б., Еропкина Е. М., Думпис М. А., Литасова Е. В., Киселев О. И. Влияние агрегатного состояния и природы полимера-носителя на фототоксичность фуллерена С60 in vitro II Эксп. клинич. фармакол. — 2011. — 74. — С. 28−31.

161. Dimitriadis Е.К., Horkay F., Maresca J., Kachar B. and Chadwick R.S. Determination of Elastic Moduli of Thin Layers of Soft Material Using the Atomic Force Microscope // Biophysical Journal. 2002. — 82. — P. 2798−2810.

162. Rico F., Roca-Cusachs P., Gavara N., Farre R., Rotger M. and Navajas D. Probing mechanical properties of living cells by atomic force microscopy with blunted pyramidal cantilever tips // Phys. Rev. -2005. — E 72. — P. 21 914 (1−10).

163. Chen R., Ratnikova T.A., Stone M.B., Lin S., Lard M., Huang G., Hudson J.S. and Ke P.C. Differential Uptake of Carbon Nanoparticles by Plant and Mammalian Cells // Small. — 2010. — 6(5). — P. 612−617.

164. Zidovetzki R., Levitan I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies // Biochim. Biophys. Acta. — 2007. — 1768. — P. 1311−1324. d.