Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Оценка трансфекции гена VEGF121 в мультипотентные стромальные клетки человека невирусными методами

Диссертация: Оценка трансфекции гена VEGF121 в мультипотентные стромальные клетки человека невирусными методами
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

В работе использовали центрифуги Eppendorf (Германия) и Jouan (Франция) — инвертированный микроскоп Olympus (Япония) — С02-инкубатор RS Biotech (New Brunswick Scientific, Великобритания) — морозильники Liebherr (Германия) и Sanyo (Япония) — автоматические пипетки и дозаторы Eppendorf (Германия), Ленпипет (Россия) — электропоратор Eppendorf (Германия) — термостаты BioSan (Латвия) и Binder… Читать ещё >

Оценка трансфекции гена VEGF121 в мультипотентные стромальные клетки человека невирусными методами (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
  • ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ
    • 1. 1. Актуальность проблемы
    • 1. 2. Цель и задачи исследования
    • 1. 3. Научная новизна
    • 1. 4. Теоретическая и практическая значимость
    • 1. 5. Положения, выносимые на защиту
    • 1. 6. Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации
    • 1. 7. Апробация работы
    • 1. 8. Публикации
    • 1. 9. Структура и объем диссертации
  • ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
    • 2. 1. Трансфекция МСК
    • 2. 2. Анализ функции трансфицированных генов
    • 2. 3. Влияние трансфекции на состояние стволовых клеток морфология, пролиферация)
    • 2. 4. Механизмы регуляции экспрессии трансфицированных генов
    • 2. 5. Способы регуляции экспрессии трансфицированных генов

1.1. Актуальность проблемы.

Клеточная терапия с использованием мультипотентных мезенхимных стромальных клеток человека (МСК) считается одним из наиболее перспективных направлений медицины. МСК сейчас используют практически во всех областях медицины: от пластической хирургии до возмещения больших дефектов тканей и органов [Riordan N. H. et al, 2009; Psaltis P. J. et al, 2008; Yoshimura K. et al, 2008; Schaffler A., Buchler C., 2007; Пальцев M.A., 2009].

Использование МСК в регенеративной медицине неслучайно. Эти клетки есть у каждого человека, и их достаточно просто выделить и культивировать. МСК содержатся в костном мозге, жировой ткани, пуповинной крови и почти во всех органах. При аллотрансплантации МСК относительно неиммуногенны и даже отмечено, что они могут незначительно подавлять иммунный ответ реципиента, что позволяет им длительно выживать после введения для оказания терапевтического эффекта [Le Blanc К. et al, 2004].

Помимо всех выше перечисленных достоинств, МСК экспрессируют широкий спектр цитокинов и факторов роста, которые оказывают паракринные эффекты: осуществляют иммуномодуляцию и трофику [Sadan О., Melamed Е., Offen D., 2009], стимулируют гемопоэз in vitro [Pittenger M. F. et al, 1999; Majumdar M. K. et al, 1998; Парфенова E.B., Ткачук В. A., 2000]. Также есть данные, что МСК оказывают проангиогенный эффект, причем у МСК, выделенных из жировой ткани, он выше, чем у МСК из костного мозга [Kim Y. et al, 2007]. Кроме того, МСК усиливают неоангиогенез за счет дифференцировки в эндотелиальные клетки и выделения множества ангиогенных факторов, таких как VEGF, bFGF и ангиопоэтин-1 [Al-Khaldi A. et al, 2003; Lee J. В. et 7 а1, 2006; Kaigler Б. ег а1, 2003; Бокерия Л. А. с соавт., 2006]. Все вышеперечисленное позволяет применять МСК для лечения ишемических состояний нижних конечностей и сердца.

Кроме того, есть данные о том, что введение в очаг ишемии генно-инженерных конструкций с факторами ангиогенеза, такими, например, как УЕОЕ (эндотелиальный фактор роса сосудов), также может приводить к усиленному росту сосудов [Константинов Б.А. с соавт., 2005; Бочков Н. П. с соавт., 2006; Бочков Н. П., Воронов Д. А., 2010], что с успехом используется в комплексной терапии ишемических состояний.

С целью большей стимуляции роста новых сосудов целесообразно совместить оба метода, т. е. трансплантировать МСК, трансфицированные генами ангиогенеза, в частности УЕОЕ. В литературе описаны положительные примеры такого подхода. Наиболее безопасными методами трансфекции являются невирусные методы — липофекция и электропорация, так как лишены многих побочных эффектов вирусных методов (инсерционный мутагенез, иммунологические осложнения). В отношении трансфекции МСК имеются противоречивые сведения об эффективности невирусных методов и о степени повышения уровня экспрессии трансгена. С целью разработки оптимальных протоколов трансфекции необходимо проведение серии экспериментов с использованием плазмиды с геном УЕОЕ.

ГЛАВА 6. ВЫВОДЫ.

1. Выявлены индивидуальные различия между культурами МСК в результативности трансфекции и динамике элиминации плазмид р3450УгЕОП21 из клеток.

2. К 3-му дню количество плазмид, трансфицированных липофекцией и электропорацией, снижается (р<0,05), после чего с 3-го по 9-ый день не изменяется.

3. Липофекция и электропорация не отличаются друг от друга по результативности и динамике элиминации плазмид из трансфицированных клеток.

4. Уровни экспрессии УЕСЕ в половине культур МСК, трансфицированных липофекцией или электропорацией, повышаютсямаксимальный (в 5−6 раз) эффект наблюдается к 9-му дню.

5. Уровень экспрессии УЕСЕ не связан со степенью метилирования промоторной области трансфицированной плазмиды введенного гена.

2.6.

Заключение

.

Как видно из анализа литературы, МСК сами по себе оказывают положительное действие на организм, однако этого действия бывает недостаточно для эффективного репаративного процесса. Поэтому было предложено использовать трансфекцию с целью усиления терапевтических эффектов (например, для лечения ишемической болезни нижних конечностей). Показано, что трансфицированные определенными факторами МСК оказывают больший эффект, чем нетрансфицированные. Однако трансфекция МСК не так широко используется, как трансфекция других клеток. Это связано, прежде всего, с трудностями культивирования и с тем, что МСК труднее трансфицировать. Поэтому еще не до конца изучены механизмы и поведение МСК после трансфекции. Разработка этого направления безусловно перспективна.

При транзиторной трансфекции со временем генетическая конструкция элиминируется из клетки, с этим, в основном, связывают отсутствие продукта трансгена. Однако на различных типах клеток доказано, что здесь также оказывают влияние эпигенетические процессы, происходящие в клетке по отношению к введенной конструкции. По МСК таких данных нет, это подчеркивает новизну темы.

Основными механизмами эпигенетической регуляции трансгена являются метилирование ДНК и деацетилирование гистонов. Эти процессы взаимосвязаны, поэтому доказав наличие одного из них, можно с большой вероятностью утверждать и о наличии другого. Существуют пути увеличения экспрессии введенного гена в результате эпигенетических процессов. Это применение деметилирующих агентов и блокаторов гистоновых деацетилаз, которые оказывают довольно сильное положительное действие, но очень токсичны для организма, а некоторые из них, к тому же, потенциально онкогенны.

Таким образом, анализ литературы показывает, что имеются.

32 противоречивые сведения о результативности, динамике элиминации и экспрессии генетических конструкций, трансфицированных невирусными методами в МСК человека, метилирование трансфицированных плазмид в МСК не изучалось.

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Материалы исследования.

Программы для компьютерного анализа.

Расчеты относительного количества плазмид и мРНК VEGF121 производились с использованием программного обеспечения амплификатора CFX96 (Bio-Rad, США). Предсказание расположения CpG-островков в CMV-промоторе генетической конструкции и подбор праймеров производился с использованием программы MethPrimer, доступной по адресу в Интернете http://www.urogene.org/methprimer/indexl .html. Степень бисульфитной конверсии определялась программой QUMA (http://quma.cdb.riken.jp). Для анализа нуклеотидных последовательностей использовали программу Sequence Scanner v. 1.0 (Applied Biosystems, США). Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программ Statistica 6.0 (StatSoft) и Microsoft Excel (Microsoft, США).

Оборудование.

В работе использовали центрифуги Eppendorf (Германия) и Jouan (Франция) — инвертированный микроскоп Olympus (Япония) — С02-инкубатор RS Biotech (New Brunswick Scientific, Великобритания) — морозильники Liebherr (Германия) и Sanyo (Япония) — автоматические пипетки и дозаторы Eppendorf (Германия), Ленпипет (Россия) — электропоратор Eppendorf (Германия) — термостаты BioSan (Латвия) и Binder (Германия) — шейкеры Eppendorf (Германия) и BioSan (Латвия) — аналитические весы Sartorius (Россия) и Ohaus (США) — спектрофотометр Eppendorf (Германия) — дистиллятор (Россия) — источник постоянного тока Pharmacia (Швеция) — электрофорезные камеры Хеликон (Россия) — трансиллюминатор (Франция) — секвенатор Applied Biosystems (США) — рН.

34 метр Mettler Toledo (Италия), амплификаторы Bio-Rad (США), Eppendorf (Германия), ДНК-технология (Россия), проточный цитометр Flowmax (Partee, Германия).

Ферментные препараты.

В работе использовании следующие ферментные препараты: коллагеназа I (ПанЭко, Россия), DNase, Hinalll (Promega, Германия), М-MuLV, EcoBl, M. SssI (СибЭнзим, Россия), Taq-полимераза (Синтол и ДНК-Синтез, Россия) — в условиях, рекомендованных изготовителем.

Реактивы и расходные материалы.

В работе использовали неорганические соли отечественного производства (Хеликон, ПанЭкоРоссия) категорий «ОСЧ» и «ХЧ», а также фирмы «Sigma» (США). Все реактивы использовались без предварительной очистки. Олигонуклеотиды синтезированы биотехнологическими фирмами «ДНК-Синтез» и «Синтол» (Россия).

В работе использовали пластиковую посуду и расходные материалы европейских и американских производителей.

Культуры клеток.

Культуры МСК-1 и МСК-2 были выделены из жировой ткани доноров женского пола, полученной в ходе плановой хирургической операции. От доноров были получены информированные согласия на использование клеток в эксперименте. Культуры МСК-3 — МСК-7 были любезно предоставлены лабораторией генетики стволовых клеток МГНЦ РАМН (руководитель — Д.В. Гольдштейн). Источник тот же — жировая ткань.

Прописи растворов, примененных в работе 1. PBS (1х).

1.7шМ дигидрофосфат калия (КН2РО4),.

5.2mM гидроортофосфат натрия (Na2HP04), 150шМ хлорид натрия (NaCl).

2. GTB-буфер

4 М гуанидин тиоционат, 25шМ цитрат натрия (рН 7.0), 0.5% N-лауроилсаркозин натрия, 0.1М Ь-меркаптоэтанол.

3. Тризол 1 мл GTB,.

0,1 мл 2 М ацетат натрия (рН 4.0), 1 мл водонасыщенного фенола.

4. ТВЕ (Юх) 0,89 М Tris-base 0,89 М борной кислоты 0,02 М ЭДТА (рН 8.0).

3.2. Методы исследования.

Культуры клеток.

Культуры клеток выделяли из жировой ткани. Кусочки жировой ткани трижды промывали раствором PBS, добавляли равный объем коллагеназы I (0,3 Ед/мл) и инкубировали 1 час при 37 °C, периодически помешивая. После чего нейтрализовали фермент полной ростовой средой (15 мл) и центрифугировали 10 минут на 2 тыс. об/мин. Осадок ресуспендировали в ростовой среде и культивировали в чашках Петри или флаконах 25-см в полной ростовой среде: DMEM7F12 (ПанЭко, Россия), 10% FBS (Perbio HyClone, США), гепарин 8 Ед/мл (ПанЭко, Россия), L-глутамин 2 мМ (ПанЭко, Россия), FGF-b Юнг/мл (ПанЭко, Россия), пенициллин/стрептомицин (ПанЭко, Россия) — при температуре 37 °C и содержании СО2 5%. После выделения клеток культуральную среду.

36 меняли через сутки и далее каждые 3−4 дня.

Культуры МСК-3 — МСК-7 были любезно предоставлены лабораторией генетики стволовых клеток МГНЦ РАМН. Иммунофенотипирование и дифференцировка этих культур клеток проводилась там же.

Дифференцировка клеток в адипогенном направлении.

МСК (9-ый пассаж) культивировали в полной ростовой среде до конфлюентности 60−70%, после чего в среду добавляли 100 мкМ индометацина, 1 мкМ дексаметазона, 0,5 мкМ 1-метил-З-изобутилксантина и 10 мкг/мл инсулина и культивировали 20 дней, среду меняли каждые 3−4 дня. После культивирования клетки были фиксированы в метаноле и окрашены красителем Oil Red О (3 мг/мл Oil Red О в 60%-ном растворе изопропанола) в течение 15 минут.

Дифференцировка МСК в остеогенном направлении.

МСК (7-ой пассаж) культивировали в полной ростовой среде до конфлюентности 60−70%, после чего в среду добавляли 50 мкМ L-аскорбиновой кислоты фосфата, 10 мМ бета-глицерофосфата и 100 нМ дексаметазона и культивировали 17 дней, среду меняли каждые 3−4 дня. После культивирования клетки были фиксированы в метаноле и окрашены красителем Alizarin Red (2% Alizarin Red в 0.1M NH4OHpH 5.4) в течение 15 минут.

Иммунофенотипирование клеток.

Клетки дважды промывали раствором PBS, добавляли 0,2% раствор ЭДТА в PBS и инкубировали 10 минут, ЭДТА нейтрализовали равным объемом полной ростовой среды и центрифугировали 5 минут при 1000 rpm. Клеточный осадок ресуспендировали в PBS до конечной концентрации 10 млн./мл. На 1 млн. клеток добавляли 5 мкл.

37 флюоресцентно окрашенных антител (CD44, CD73, CD 105, CD 14, CD 19), перемешивали на вортексе и инкубировали 30 минут на льду. Далее промывали раствором PBS и центрифугировали 5 минут при 2000 rpm, ресуспендировали в 500 мкл 1%-ного формальдегида и оценивали флюоресценцию на проточном цитометре (Flowmax, Partee, Германия).

Трансфекция.

Трансфекцию проводили плазмидой с геном VEGF121 (pS450VEGF121), регулируемым CMV-промотором (рис. 2), любезно предоставленной профессором Б. С. Народицким (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Гамалеи Минздравсоцразвития РФ). Условия трансфекции были оптимизированы с помощью плазмиды pEYFP-Cl (Clontech, США) (рис. 3).

Клетки (4−7-ой пассаж) в количестве 105 ресуспендировали в 100 мкл буфера для электропорации (Eppendorf, Германия) и проводили электропорацию — 400В/мм, 55мкс с использованием электропоратора Multiporator (Eppendorf, Германия), после чего рассевали по лункам 6-ти луночных планшетов или во флаконы 25 см. Липофекцию с помощью Унифектина-56 (Unifect Group, Россия) проводили в культурах клеток конфлюентных до 60−70%. Соотношение Унифектина и плазмиды — 12 Ед.:6 мкг на чашку Петри диаметром 10 см или культуральный флакон О.

25 см. После обоих способов трансфекции среду меняли на следующий день, далее каждые 3−4 дня.

Выделение ДНК.

На 1-е, 3-й, 6-е и 9-е сутки после трансфекции клетки промывали дважды раствором PBS, добавляли раствор трипсин-ЭДТА (ПанЭко, Россия), инкубировали 10 минут при 37 °C, добавляли равный объем полной ростовой среды и центрифугировали 5 минут при 1,5 тыс. об/мин. Осадок дважды промывали PBS и считали количество клеток в камере Горяева. Выделение ДНК проводили с помощью набора «ДНК-Сорб-АМ».

ИнтерЛабСервис, Россия) по рекомендованному производителем протоколу. Образцы растворяли в ТЕ-буфере и хранили при X -20°С. iVcol (7191) Pcmv.

Т7.

Ilindlll (17).

100 m.u. CELO s.

JJmdlII (6469) ApalA (6247).

P (BLA).

ApalA (5750) дрг i.

Щ/.

Clal (50).

Ncol (145) VEGF121.

Clal (521) pS415VEGF121.

7475 bp.

ApaLl (4504), A.

ORI P (LAC) ficoRI (3834).

Sitial (3820) Лиа1(з818) Xmai (3818) BamHl (3813) Я % ж 4.

Aval {702) BGH pA.

Clal (1318).

JJcoRl (2194) 88,8 m. u, CELO.

Рис. 2. Плазмида pS450VEGF121. Ncol, Hind III, Clal, Aval, ЕсоШ, Smal, Xmal, BamHl, ApaLl — сайты рестрикции соответствующих ферментовPcmv — цитомегаловирусный промоторТ7 — промотор Т7- VEGF121 — кДНК гена эндотелиального фактора роста сосудовBGHтелячий гормон роста- 88,8 m.u. CELO и 100 m.u. CELO — фрагмент генома аденовируса CELO от 88,8 до 100 ед. картыP (LAC) — последовательность лактозного промотораP (BLA) — последовательность промотора (3-лактамазыORI — точка начала репликацииАРГ — ген устойчивости к ампициллинуbp — пар оснований.

ЕсоОт I.

3854).

Nhe I (592) Eco? tl HI (597) Аде I (601).

BSPG I (1323).

MOS.

1330−1417).

AfiW (1638).

Рис. 3. Плазмида pEYFP-Cl. P CMV — цитомегаловирусный промоторP SV40 — промотор SV40- P f 1 — промоторEYFP — кДНК гена усиленного желтого флюоресцентного белкаori — точка начала репликацииpUC — сайт начала плазмидной репликацииMCS — сайт множественного клонированияAsel, Nhel, EcoAlWl, Agel, BsrGl, Aflll, Stul, EcoOl 091 — сайты рестрикции соответствующих ферментовKanr — ген устойчивости к канамицинуNeor — ген устойчивости к неомицинуHSV ТК — тимидинкиназа вируса простого герпесаkb — тысячи пар оснований.

Выделение РНК.

Клетки снимали с флаконов и чашек Петри, как описано выше. К клеточной суспензии добавляли 2,5 мл тризола и 0,5 мл хлороформа, перемешивали на вортексе и центрифугировали 20 мин. при 4 °C на 4000 об/мин. Верхнюю фазу переносили в новую пробирку, добавляли равный объем смеси фенол-хлороформ и также центрифугировали. Верхнюю фазу переносили в новую пробирку, добавляли равный объем ледяного.

40 изопропанола и инкубировали при -20°С не менее часа. Далее центрифугировали 20 минут при 4 °C на 12 тыс об/мин. Осадок растворяли в 0,3 мл GTB-буфера, переносили в новую пробирку, добавляли равный объем ледяного изопропанола и инкубировали не менее 30 минут при -20 С, после чего центрифугировали 20 минут (4°С, 12 тыс об/мин). К осадку добавляли 1 мл 75%-ного этанола и инкубировали при комнатной температуре 15 минут, центрифугировали 10 минут (4°С, 12 тыс об/мин). Осадок подсушивали на воздухе и растворяли в 100 мкл MilliQ. После этого проводили обработку DNase (Promega, Германия) по рекомендованному производителем протоколу.

Отрицательные контроли трансфекции.

Из нетрансфицированных образцов всех культур выделяли ДНК и РНК, как описано выше.

Синтез кДНК.

Реакция обратной транскрипции проводилась с помощью фермента M-MuLV (СибЭнзим, Россия) по протоколу, рекомендованному производителем.

ПЦР в реальном времени.

В реакционную смесь (25 мкл), содержащую 300 нМ праймеров, 200 мкМ дНТФ, 3 мкМ Mg2+, lxSYBR Green I (Invitrogene, США) и 0,04 Ед. Taq-полимеразы, вносили по 5 мкл ДНК. ПЦР в реальном времени проводили на приборе CFX96 (Bio-Rad, США). Условия реакции: 95 °C — 3 мин, 45х (95°С — 5 сек, 60 °C — 10 сек, 72 °C — 20 сек). Использованные праймеры представлены в табл. 1.

Показать весь текст

Список литературы

  1. С. В. Создание рекомбинантных аденовирусов, экспрессирующих гены факторов роста кровеносных сосудов и изучение влияния этих вирусов на ангиогенез in vivo: Дис.. канд. биол. наук. Москва. 2005.-141 с.
  2. Биология стволовых клеток и клеточные технологии в 2 т. Под ред. Пальцева М. А. М.: Медицина, 2009, 728 с.
  3. Н. П. Клеточная терапия в свете доказательной медицины // Клиническая медицина. 2006. — Т. 3, № 10. — с. 4−10.
  4. Н. П., Воронов Д. А. Генотерапия в лечении сердечнососудистых заболеваний: фундаментальные основы, терапевтический потенциал, современное состояние и перспективы // Кардиология и сердечно-сосудистая хирургия. — 2010. Т. 3, № 3. — с. 4−11.
  5. Н. П., Никитина В. А., Рослова Т. А., Чаушев И. Н., Якушина И. И. Клеточная терапия наследственных болезней // Вестник РАМН. 2008. — № 10. — с. 20−28.
  6. Т. Н., Ефименко А. Ю., Акопян Ж. А., Парфенова Е. Е. Клеточная терапия сердечной недостаточности: клинический опыт, проблемы и перспективы // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. 2010. — Т. V, № 2. — с. 11−18.
  7. Е. В., Ткачук В. А. Перспективы генной терапии сердечно-сосудистых заболеваний // Вопросы медицинской химии. 2000. Т. 46, № 3.- с. 293−310.
  8. Al-Khaldi A., Al-Sabti Н., Galipeau J., Lachapelle К. Therapeutic angiogenesis using autologous bone marrow stromal cells: improved blood flow in a chronic limb ischemia model // Ann Thorac Surg. 2003. — № 75. — p. 204 209.
  9. Bahadori M. New Advances in RNAs // Arch Iranian Med. 2008. -№ 11(4).-p. 435−443.
  10. Baksh D., Yao R., Tuan R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow // Stem Cells. 2007. — № 25(6). — p. 1384−1392.
  11. Balyasnikova I. V., Franco-Gou R., Mathis J. M., Lesniak M. S. Genetic modification of mesenchymal stem cells to express a single-chain antibody against EGFRvIII on the cell surface // J Tissue Eng Regen Med. -2009. Article online.
  12. Bangari D. S., Mittal S. K. Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity // Curr Gene Ther. 2006. — № 6. — p. 215 226.
  13. Bestor T. H. Gene silencing as a threat to the success of gene therapy // J Clin Invest. 2000. — № 105. — p. 409−411.81
  14. Bosch P., Pratt S. L., Stice S. L. Isolation, Characterization, Gene Modification, and Nuclear Reprogramming of Porcine Mesenchymal Stem Cells // Biology of Reproduction. 2006. — № 1 (vol. 74). — p. 46−57.
  15. Bushman F., Lewinski M., Ciuffi A., Barr S., Leipzig J., Hannenhalli S., Hoffmann C. Genome-wide analysis of retroviral DNA integration // Nat Rev Microbiol. 2005. -№ 3. — p. 848−858.
  16. Cao F., Xie X., Gollan T., Zhao L., Narsinh K., Lee R. J., Wu J. C. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells // Mol Imaging Biol.- 2010. -№ 12(1).-p. 15−24.
  17. Chan J., O’Donoghue K., de la Fuente J., Roberts I. A., Kumar S., Morgan J. E., Fisk N. M. Human fetal mesenchymal stem cells as vehicles for gene delivery // Stem Cells. 2005. — № 23. — p. 93−102.
  18. Chelobanov B. P., Laktionov P. P., Vlasov V. V. Proteins involved in binding and cellular uptake of nucleic acids // Biochemistry (Mosc). 2006. -№ 71 (6).-p. 583−596.
  19. Cheng J. C., Matsen C. B., Gonzales F. A., Ye W., Greer S., Marquez V. E., Jones P. A., Selker E. U. Inhibition of DNA methylation and reactivation of silenced genes by zebularine // J. Natl. Cancer Inst. 2003. — № 95. — p. 399 409.
  20. Cheng L., Ziegelhoffer P. R., Yyang N-S. In vivo promoter activity and transgene expression in mammalian somatic tissues evaluated by usingparticle bombardment // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. — Vol. 90. — c. 4455−4459.
  21. Cheng T., Xu C. Y, Wang Y. B., Chen M., Wu T., Zhang J., Xia N. S. A rapid and efficient method to express target genes in mammalian cells by baculovirus // World J Gastroenterol. 2004. — № 10 (11). — p. 1612−1618.
  22. Christiano R. Viral and non-viral vectors for cancer gene therapy // Anticancer Res. 1998. — № 18. — p. 3142−3246.
  23. Cohen R. N., van der Aa M. A. E. M., Macaraeg N., Lee A. P., Szoka F. C. Jr. Quantification of Plasmid DNA Copies in the Nucleus after Lipoplex and Polyplex Transfection // J Control Release. 2009. — 135(2). — p. 166−174.
  24. Cudkowicz G., Upton A. C., Smith L. H.5 Gosslee D. G., Hughes W. L. An Approach to the Characterization of Stem Cells in Mouse Bone Marrow // Ann N Y Acad Sci. 1964. — № 114. — p. 571−585.
  25. Di Ianni M., Terenzi A., Perruccio K., Ciurnelli R., Lucheroni F., Benedetti R., Martelli M. F., Tabilio A. 5-Azacytidine prevents transgene methylation in vivo // Gene Therapy. 1999. — № 4(6). — p. 703−707.
  26. Engler C., Kelliher C., Wahlin K. J., Speck C. L., Jun A. S. Comparison of non-viral methods to genetically modify and enrich populations of primary human corneal endothelial cells // Mol Vis. 2009. — № 15. — p. 629 637.
  27. Escher G., Hoang A., Georges S., Tchoua U., El-Osta A., Krozowski Z., Sviridov D. Demethylation using the epigenetic modifier, 5-azacytidine, increases the efficiency of transient transfection of macrophages // J. Lipid Res. 2005. — № 46. — p. 356−365.
  28. Fazzari M. J., Greally J. M. Epigenomics: beyond CpG islands. // Nat. Rev.Genet. 2004. — № 5. — p. 44655.
  29. Finnin M. S., Donigian J. R., Cohen A., Richon V. M., Rifkind R. A., Marks P. A., Breslow R., Pavletich N. P. Structures of a histone deacetylase homologue bound to the TSA and SAHA inhibitors // Nature. 1999. — № 401. -p. 188−193.
  30. Flotte T. R. Gene therapy: The first two decades and the current state-of-the-art // J Cell Physiol. 2007. — № 213. — p. 301−305.
  31. Gaetano C., Catalano A., Palumbo R., Illi B., Orlando G., Ventoruzzo G., Serino F., Capogrossi M. C. Transcriptionally active drugs improve adenovirus vector performance in vitro and in vivo // Gene Therapy. — 2000. — № 7.-p. 1624−1630.
  32. Gaymalov Z. Z., Yang Z., Pisarev V. M., Alakhov V. Y., Kabanov A. V. The effect of the nonionic block copolymer pluronic P85 on gene expression in mouse muscle and antigen-presenting cells // Biomaterials. 2009. — 30(6). -p. 1232−45.
  33. Gheisari Y., Soleimani M., Azadmanesh K., Zeinali S. Multipotent mesenchymal stromal cells: optimization and comparison of five cationic polymer-based gene delivery methods // Cytotherapy. 2008. — 10(8). — p. 81 523.
  34. Gottfried O. N., Dailey A. T. Mesenchymal Stem Cell And Gene Therapies For Spinal Fusion // Neurosurgery. 2008. — № 63. — p. 380−392.
  35. Gwak, S. J., Kim, B. S. Poly (lactic-co-glycolic acid) nanosphere as a vehicle for gene delivery to human cord blood-derived mesenchymal stem cells: comparison with polyethylenimine // Biotechnol Lett. 2008. — № 30(7). — p. 1177−1182.
  36. Haleem-Smith H., Derfoul A., Okafor C., Tuli R., Olsen D., Hall D. J., Tuan R. S. Optimization of high-efficiency transfection of adult human mesenchymal stem cells in vitro // Mol Biotechnol. 2005. — № 30. — p. 9−20.
  37. Hamm A., Krott N., Breibach I., Blindt R., Bosserhoff A. K. Efficient transfection method for primary cells // Tissue Eng. 2002. — № 8. — p. 235 245.
  38. He J., Yang Q., Chang L. J. Dynamic DNA methylation and histone modifications contribute to lentiviral transgene silencing in murine embryonic carcinoma cells // J Virol. 2005. — № 79(21). — p. 13 497−13 508.85
  39. Helledie T., Nurcombe V., Cool S. M. A simple and reliable electroporation method for human bone marrow mesenchymal stem cells // Stem Cells Dev. 2008. — № 17(4). — p. 837−848.
  40. Hung S.-C., Lu C.-Y., Shyue S.-K., Liu H.-C., Hob L. L.-T. Lineage Differentiation-Associated Loss of Adenoviral Susceptibility and Coxsackie-Adenovirus Receptor Expression in Human Mesenchymal Stem Cells // Stem Cells.-2004.-№ 22.-p. 1321−1329.
  41. Iversen N., Birkenes B., Torsdalen K., Djurovic S. Electroporation by nucleofector is the best nonviral transfection technique in human endothelial and smooth muscle cells // Genet Vaccines Ther. 2005. — № 3(1). — p. 2.
  42. Jones P. A., Taylor S. M. Cellular differentiation, cytidine analogs and DNA methylation // Cell. 1980. — № 20. — p. 85−93.
  43. Kaigier D., Krebsbach P. H, Polverini P. J, Mooney D. J. Role of vascular endothelial growth factor in bone marrow stromal cell modulation of endothelial cells //Tissue Eng. -2003. -№ 9(1). p. 95−103.
  44. Kameda T., Smuga-Otto K., Thomson J. A. A severe de novo methylation of episomal vectors by human ES cells // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2006. — № 349. — p. 1269−1277.
  45. Kim J. H., Park S. N., Suh H. Generation of insulin-producing human mesenchymal stem cells using recombinant adeno-associated virus // Yonsei Med J. 2007. — № 48(1). — p. 109−119.
  46. Kucerova L., Altanerova V., Matuskova M., Tyciakova S., Altaner C. Adipose Tissue-Derived Human Mesenchymal Stem Cells Mediated Prodrug Cancer Gene Therapy // Cancer Research. — 2007. № 67. — p. 6304−6313.
  47. Lakshmipathy U., Pelacho B., Sudo K., Linehan J. L., Coucouvanis
  48. E., Kaufman D. S., Verfaillie C. M. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells // Stem Cells. 2004. -№ 22. — p. 531−543.
  49. Le Blanc K., Rasmusson I., Sundberg B., Gotherstrom C., Hassan M., Uzunel M., Ringden O. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells // Lancet. — 2004. — № 363. — p. 1439−1441.
  50. Lee J. B., Bae Y. C., Sung S. M., Jung J. S. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells improve postnatal neovascularization in a mouse model of hindlimb ischemia // Cell Physiol Biochem. 2006. — № 17(5−6).-p. 279−290.
  51. Lee K., Majumdar M. K., Buyaner D., Hendricks J. K., Pittenger M.
  52. F., Mosca J. D. Human mesenchymal stem cells maintain trangene expression during expansion and differentiation // Mol Ther. 2001. — № 3. — p. 857−866.
  53. Ma L., Wang G., Li L., Feng K., Bai L., Pei X. Expression of lipofect AMINE mediated human GM-CSF eukaryotic expressing vector in HFCL cells // Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2000. — № 21(12). p. 624−627.
  54. Madonna R., Willerson J. T., Geng Y. J. Myocardin a enhances telomerase activities in adipose tissue mesenchymal cells and embryonic stem cells undergoing cardiovascular myogenic differentiation // Stem Cells. — 2008. -№ 26(1).-p. 202−211.
  55. Majumdar M. K., Thiede M. A., Mosca J. D., Moorman M., Gerson S. L. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells // J. Cell. Physiol. 1998. -№ 176.-p. 57−66.
  56. Makino S., Fukuda K., Miyoshi S., Konishi F., Kodama H., Pan J., Sano M., Takahashi T., Hori S., Abe H., Hata J., Umezawa A., Ogawa S. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vitro // J Clin Invest. 1999. -№ 103(5). — p. 697−705.
  57. Marshall H. M., Ronen K., Berry C., Llano M., Sutherland H., Saenz D., Bickmore W., Poeschla E., Bushman F. D. Role of PSIPl/LEDGF/p75 in Lentiviral Infectivity and Integration Targeting // PLoS ONE. 2007. — № 2. -p. el340.
  58. Mclnerney J. M., Nawrocki J. R., Lowrey C.H. Long-term silencing of retroviral vectors is resistant to reversal by trichostatin A and 5-azacytidine // Gene Ther. 2000. — № 7. — p. 653−663. '
  59. Mei S. H., McCarter S. D., Deng Y., Parker C. H., Liles W. C., Stewart D. J. Prevention of LPS-induced acute lung injury in mice by mesenchymal stem cells overexpressing angiopoietin 1 // PLoS Med. 2007. -№ 4(9).-p. e269.
  60. Meng Q.Y., Li X.Q., Yu X.B., Lei F. R., Jiang K., Li C. Y. Transplantation of VEGF165-gene-transfected endothelial progenitor cells in the treatment of chronic venous thrombosis in rats // Chin Med J (Engl). — 2010. — № 123 (4).-p. 471−477.
  61. Modlich U., Baum C. Preventing and exploiting the oncogenic potential of integrating gene vectors // J Clin Invest. 2009. — № 119(4). — p. 755−758.
  62. Mok P. L., Cheong S. K., Leong C. F., Othman A. In vitro expression of erythropoietin by transfected human mesenchymal stromal cells // Cytotherapy. 2008. — № 10(2). — p. 116−124.
  63. Morozkin E. S., Laktionov P. P., Rykova E. Y., Vlassov V. V. Extracellular nucleic acids in cultures of long-term cultivated eukaryotic cells // Ann N Y Acad Sei. 2004. — № 1022. — p. 244−249.90
  64. Naldini L., Blomer U., Gallay P., Ory D., Mulligan R., Gage F. H., Verma I. M., Trono D. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector // Science. 1996. — № 272(5259). — p. 263−267.
  65. Nan X., Campoy F. J., Bird A. MeCP2 is a transcriptional repressor with abundant binding sites in genomic chromatin // Cell. 1997. — № 88. — p. 471−481.
  66. Palmer G. D., Steinert A., Pascher A., Gouze E., Gouze J. N., Betz O., Johnstone B., Evans C. H., Ghivizzani S, C. Gene-induced chondrogenesis of primary mesenchymal stem cells in vitro // Mol Ther. 2005. — № 12(2). — p. 219−228.
  67. Parolin C., Sodroski J. A defective HIV-1 vector for gene transfer to human lymphocytes // J Mol Med. 1995. — № 73(6). — p. 279−288.
  68. Partridge K. A., Oreffo R. O. Gene delivery in bone tissue engineering: progress and prospects using viral and nonviral strategies // Tissue Eng. 2004. — № 10. — p. 295−307.
  69. Patkin E. L. Epigenetic mechanisms for primary differentiation in mammalian embryos // Int Rev Cytol. 2002. -№ 216. — p. 81−129.
  70. Paulsen M., Ferguson-Smith A. C. DNA methylation in genomic imprinting, development, and disease. // J Pathol. 2001. — № 195. — p. 97−110.
  71. Pitard B., Pollard H., Agbulut O., Lambert O., Vilquin J. T., Cherel91
  72. Y., Abadie J., Samuel J. L., Rigaud J. L., Menoret S., Anegon I., Escande D. A nonionic amphiphile agent promotes gene delivery in vivo to skeletal and cardiac muscles // Hum Gene Ther. 2002. — № 13(14). — p. 1767−75.
  73. Pittenger M. F., Mackay A. M., Beck S. C., Jaiswal R. K., Douglas R., Mosca J. D., Moorman M. A., Simonetti D. W., Craig S., Marshak D. R. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells // Science. -1999. -№ 284. -p. 143−147.
  74. Praznovszky T., Kereso J., Tubak V., Cserpan I., Fatyol K., Hadlaczky G. De novo chromosome formation in rodent cells // Proc Natl Acad Sci USA. 1991. — № 88(24). — p. 11 042−11 046.
  75. Psaltis P. J., Zannettino A. C. W., Worthley S. G., Gronthosb S. Concise Review: Mesenchymal Stromal Cells: Potential for Cardiovascular Repair // Stem Cells. 2008. — № 26. — p. 2201−2210.
  76. Riew K. D., Wright N. M., Cheng S., Avioli L. V., Lou J. Induction of bone fonnation using a recombinant adenoviral vector carrying the human BMP-2 gene in a rabbit spinal fusion model // Calcif Tissue Int. 1998. — № 63(4).-p. 357−360.
  77. Rosenqvist N., Hard Af Segerstad C., Samuelsson C., Johansen J., Lundberg C. Activation of silenced transgene expression in neural precursor cell lines by inhibitors of histone deacetylation // J. Gene Med. 2002. — № 4. — p. 248−257.
  78. Sadan 0., Melamed E., Offen D. Bone-marrow-derived mesenchymal stem cell therapy for neurodegenerative diseases // Expert Opin Biol Ther. -2009. № 9(12). — p. 1487−1497.
  79. Schaffler A., Buchler C. Concise Review: Adipose Tissue-Derived Stromal Cells—Basic and Clinical Implications for Novel Cell-Based Therapies // Stem Cells. 2007. — № 25. — p. 818−827.
  80. Sheyn D., Pelled G., Zilberman Y., Talasazan F., Frank J. M., Gazit D., Gazit Z. Nonvirally engineered porcine adipose tissue-derived stem cells: use in posterior spinal fusion // Stem Cells. 2008. — № 26(4). — p. 1056−1064.
  81. Somia N., Verma I. M. Gene Therapy: Trials and Tribulations // Nature Reviews Genetics. 2000. -№ 1(2). — p. 91−99.
  82. Spizizen J., Reilly B. E., Evans A. H. Microbial transformation and transfection // Annu Rev Microbiol. 1966. — № 20. — p. 371−400.
  83. Sriadibhatla S., Yang Z., Gebhart C., Alakhov V. Y., Kabanov A. Transcriptional activation of gene expression by pluronic block copolymers in93stably and transiently transfected cells // Mol Ther. 2006. — 13(4). — p. 804−13.
  84. Stender S., Murphy M., O’Brien T., Stengaard C., Ulrich-Vinther M., Soballe K., Barry F. Adeno-associated viral vector transduction of human mesenchymal stem cells // Eur Cell Mater. 2007. -№ 13. — p. 93−99.
  85. Tate P., Skarnes W., Bird A. The methyl-CpG binding protein MeCP2 is essential for embryonic development in the mouse // Nat Genet. 1996. — № 12.-p. 205−208.
  86. Tichy P., Rytir V., Kohoutova M. Genetic transformation and transfection of Bacillus subtilis spheroplasts // Folia Microbiol (Praha). — 1968. -№ 13(6).-p. 510−514.
  87. Tu Q., Valverde P., Li S., Zhang J., Yang P., Chen J. Osterix overexpression in mesenchymal stem cells stimulates healing of critical-sized defects in murine calvarial bone // Tissue Eng. 2007. — № 13(10). — p. 24 312 440.
  88. Uchida E., Mizuguchi H., Ishii-Watabe A., Hayakawa T. Comparison of the efficiency and safety of non-viral vector-mediated gene transfer into a wide range of human cells // Biol Pharm Bull. 2002. — № 25. — p. 891−897.
  89. Valero A., Post J. N., van Nieuwkasteele J. W., Ter Braak P. M., Kruijer W., van den Berg A. Gene transfer and protein dynamics in stem cells using single cell electroporation in a microfluidic device // Lab Chip. 2008. -№ 8(1).-p. 62−67.
  90. Wu M. H., Liebowitz D. N., Smith S. L., Williams S. F., Dolan M.E. Efficient expression of foreign genes in human CD34(+) hematopoietic precursor cells using electroporation // Gene Ther. 2001. — № 8(5). — p. 384 390.
  91. Xu Y., Mirmalek-Sani S. H., Lin F., Zhang J., Oreffo R. O. Adipocyte differentiation induced using nonspecific siRNA controls in cultured human mesenchymal stem cells // RNA. 2007. — № 13(8). — p. 1179−1183.
  92. Yang J. F., Zhou W. W., Tang T., Hu J. G., Yu J. F., Yang Y. F., Zhou X. M., Hu D. X. Transfection of human VEGF165 gene into bone marrow mesenchymal stem cells in rats // Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban. — 2006. № 31(3). — p. 313−318.
  93. Yoshimura K., Sato K., Aoi N., Kurita M., Hirohi T., Harii K. Cell-Assisted Lipotransfer for Cosmetic Breast Augmentation: Supportive Use of Adipose-Derived Stem/Stromal Cells // Aesth Plast Surg. 2008. — № 32. — p. 48−55.
  94. Zeng B., Chen H.5 Zhu C., Ren X., Lin G., Cao F. Effects of combined mesenchymal stem cells and heme oxygenase-1 therapy on cardiac performance // Eur J Cardiothorac Surg. 2008. — № 34(4). p. 850−856.
  95. Zhang X. Y., La Russa V. F., Bao L., Kolls J., Schwarzenberger P., Reiser J. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells // Mol Ther. 2002. — № 5. — p. 555−565.
  96. Zhang X.-Y., La Russa V.F., Reiser J. Transduction of Bone-Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells by Using Lentivirus Vectors Pseudotyped with Modified RD114 Envelope Glycoproteins // Journal of Virology. 2004. -№ 3 (78). — p. 1219−1229.
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!