Протеомная характеристика межмолекулярных комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека

Актуальность темы

диссертации.

После завершения проекта по расшифровке генома человека внимание молекулярных биологов стало все более смещаться в сторону изучения функциональных характеристик белков. Для понимания молекулярного механизма функционирования конкретного белка необходимо знать не только его структуру, но и возможные белок-белковые взаимодействия в которые вступает данный протеин. В современных исследованиях при изучении нового белка вслед за первым вопросом о его структуре, как правило, следует второй вопрос о том, с чем данный белок связывается. Белковые комплексы играют важную роль в транскрипции, делении клеток, онкогенной трансформации и многих других жизненно необходимых клеточных процессах.

Важное значение белковые комплексы имеют и для иммунологии. Многие иммунные процессы регулируются или осуществляются с участием белковых комплексов. Большинство мембранных рецепторов по своему строению являются мультипротеиновыми комплексами, состоящими из нескольких белков. Другие иммунологически значимые молекулы, такие как цитоплазматические сигнальные белки, а также ядерные факторы транскрипции при выполнении своих функций образуют временные белковые комплексы со своими партнерами.

По различным оценкам от 15 до 20% генов кодируют белки, локализованные на мембране. Если учесть, что многие мембранные белки являются рецепторами, то изучение комплексов мембранных белков приобретает особую значимость. К настоящему времени накоплен значительный материал по изучению комплексов цитозольных белков, в то же время комплексы мембранных белков исследованы значительно в меньшей степени. Это связано с методическими трудностями в выделении мембранных белков. Работа с очищенными мембранными белками затрудняется вследствие их высокой гидрофобности, а также необходимости дополнительного связывания с липидами. Для более глубокого изучения мембранных комплексов имеется настоятельная потребность в совершенствовании существующих методов исследования.

В силу сложившихся методических приемов основная часть современных работ, касающихся межмолекулярных комплексов, ограничивается изучением парных ассоциаций между отдельными молекулами, входящими в состав комплекса. Общая картина строения всего комплекса в целом, как правило, строится из разрозненных данных по отдельным парным ассоциациям. В последнее время благодаря развитию протеомного подхода стало возможным изучение не только парных ассоциаций, но и всего комплекса в целом.

Можно надеяться, что идентификация и характеристика мембранных белковых комплексов лимфоцитов человека позволит лучше понять молекулярные основы иммунных процессов, а также даст дополнительную информацию, которая необходима для направленной разработки новых фармакологических препаратов, влияющих на иммунный ответ. Таким образом, поиск и разработка новых подходов для идентификации и характеристики белковых комплексов, а также систематическое изучение межмолекулярных комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека является актуальной задачей.

Цель работы.

Целью данной работы являлось изучение структуры и состава межмолекулярных комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека на трех уровнях: сравнительно простые комплексы образованные молекулой CD4, более сложно устроенные комплексы тетраспаниновых микродоменов, и, наконец, большие липидно-белковые комплексы, занимающие обширные мембранные области и которые называются липидными рафтами.

Задачи исследования.

1. Развитие методической базы протеомного исследования комплексов мембранных белков. Изучение совместимости флуоресцентного иммунопреципитационного анализа с последующим иммуноблотом.

2. Определение изоформ белка CD45 образующих межмолекулярный комплекс с молекулой CD4.

3. Протеомная характеристика белков, ассоциированных с тетраспанинами CD9 и CD81.

4. Разработать новый метод детекции рафтовых антигенов и изучить с его помощью траслокации в липидные рафты некоторых мембранных белков.

Научная новизна.

В настоящей работе впервые продемонстрирована возможность совмещения флуоресцентной иммунопреципитации с последующим иммуноблотом, таким образом результаты иммунопреципитации и иммуноблота считываются с одного и того же геля. Таким образом, разработанная методика позволяет комбинировать между собой качественные данные, полученные с помощью иммуноблота, с количественными данными, получаемыми методом флуоресцентной иммунопреципитации.

Впервые показано, что на периферических лимфоцитах крови человека молекула CD4 образует межмолекулярный белковый комплекс преимущественно с низмолекулярной изоформой белка CD45, а именно с CD45R0.

Впервые в качестве компонента белкового комплекса тетраспанинов CD9 и CD81 идентифицирована металлопротеаза CD 10.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Настоящая работа выполнена в рамках фундаментальных исследований. Научная значимость настоящего исследования заключается в расширении представлений о 9 строении комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека. Полученные данные позволяют глубже понять механизмы взаимодействия мембранных белков, и могут быть использованы при направленной разработке новых иммунотерапевтических препаратов.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Метод флуоресцентной иммунопреципитации совместим с последующим анализом с помощью иммуноблота.

2. Флуоресцентный иммунопреципитационный анализ позволяет вести пробоподготовку общую для нескольких методов и совместить в одном эксперименте иммунопреципитацию, иммуноаффинное выделение, иммуноблот и масс-спектрометрию.

3. Молекула CD4 образует межмолекулярный комплекс только с низкомолекулярной изоформой белка CD45, а именно CD45R0.

4. Белки CD4 и CD45 не могут напрямую взаимодействовать между собой, и для образования между ними белкового комплекса необходимы вспомогательные молекулы.

5. Цинкзависимая протеаза CD 10 образуют межмолекулярный комплекс с тетраспанинами CD9 и CD81.

Публикации.

Результаты исследований были представлены на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, июнь 2005), на 31-ом конгрессе «FEBS» (Стамбул, Турция, июнь 2006), на VIII конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, июнь 2007), на III российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, сентябрь 2007). Материалы диссертации изложены в 10 публикациях.

Выводы.

1. Предложена и разработана модификация метода флуоресцентной иммунопреципитации, позволяющая совместить её- с последующим иммуноблотом. Продемонстрирована возможность регистрировать с одного геля результаты иммунопреципитации и иммуноблота, что позволяет комбинировать данные по качественной идентификации белков методом иммуноблота с количественными результатами флуоресцентной иммунопреципитации.

2. Флуоресцентный иммунопреципитационный анализ позволяет вести пробоподготовку общую для нескольких методов и совместить в одном эксперименте иммунопреципитацию, иммуноаффинное выделение, иммуноблот и масс-спектрометрию. Флуоресцентный иммунопреципитационный анализ можно рассматривать как общую платформу для нескольких протеомных методов исследования.

3. Обнаружено, что рецептор CD4 на периферических лимфоцитах крови человека и клетках линии СЕМ, образует комплексы не со всеми молекулами CD45, а только с его низкомолекулярной изоформой CD45R0.

4. Определено, что трансферриновый рецептор CD71, ассоциированный с CD4, на клетках линии СЕМ находится в комплексе исключительно в димерной форме скрепленнойS-S— связью.

5. Показано, что для взаимодействия молекул CD4 и CD45 необходимы некоторые дополнительные молекулы. При экспрессии в нелимфоидные клетки 293 Т, которые лишены белков Lck и LPAP, молекулы CD4 и CD45 не могут напрямую взаимодействовать между собой и образовывать комплекс.

6. Обнаружено, что на клетках линии Nalm6 белок CD 10 образует комплекс с молекулами CD9 и CD81. Масс-спектрометрически определен круг белков, ассоциированных с тетраспаниновыми комплексами, в составе которых идентифицировано более 25 различных мембранных белков.

7. Предложен и апробирован новый подход к детекции мембранных белков, который позволяет значительно упростить процедуру выделения и идентификации рафтовых и нерафтовых молекул. Помимо простоты исполнения он также обладает тем преимуществом, что с его помощью селективно детектируются только мембранные молекулы и не регистрируется внутриклеточный пул исследуемых антигенов.