Помощь в написании студенческих работ
Антистрессовый сервис

Регуляция активности растворимой гуанилатциклазы под действием белка теплового шока Hsp90

Диссертация: Регуляция активности растворимой гуанилатциклазы под действием белка теплового шока Hsp90
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Недавние исследования показали роль Hsp90 в регуляции системы NO-рГЦ-сОМР. Например, Hsp90 может регулировать активность эндотелиальной и нейрональной изоформ NO-синтаз. Hsp90 стимулирует синтез N0 и подавляет образование супероксид-аниона, осуществляемые NO-синтазой. Hsp90 связывается с эндотелиальной NO-синтазой и стимулирует активацию фермента кальмодулином. Также как и рГЦ NO-синтаза является… Читать ещё >

Регуляция активности растворимой гуанилатциклазы под действием белка теплового шока Hsp90 (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Содержание

  • Список сокращений
  • Обзор литературы
  • 1. Свойства растворимой гуанилатциклазы
    • 1. 1. Роль растворимой гуанилатциклазы в системе передачи сигнала NO-рГЦcGMP
    • 1. 2. Структура растворимой гуанилатциклазы и её экспрессия в тканях
      • 1. 2. 1. Изоформы растворимой гуанилатциклазы: распределение в тканях и регуляция экспрессии
      • 1. 2. 2. Доменная организация растворимой гуанилатциклазы
        • 1. 2. 2. 1. Гем-связывающий домен
        • 1. 2. 2. 2. Каталитический домен
        • 1. 2. 2. 3. Димеризационный домен
    • 1. 3. Каталитическая активность растворимой гуанилатциклазы и способы её регуляции
      • 1. 3. 1. Активация растворимой гуанилатциклазы оксидом азота (NO): роль гемовой группы
      • 1. 3. 2. Деактивация растворимой гуанилатциклазы
      • 1. 3. 3. NO-независимые регуляторы активности растворимой гуанилатциклазы
        • 1. 3. 3. 1. Регуляция растворимой гуанилатциклазы порфиринами и металлопорфиринами
        • 1. 3. 3. 2. Активация растворимой гуанилатциклазы полиненасыщенными жирными кислотами
        • 1. 3. 3. 3. Окислительно-восстановительная регуляция активности растворимой гуанилатциклазы
      • 1. 3. 4. Регуляция чувствительности растворимой гуанилатциклазы к NO в различных физиологических и патофизиологических состояниях
  • 2. Защита белков от стрессорного повреждения. Белок теплового шока Hsp
    • 2. 1. Механизмы стрессорного повреждения белков
      • 2. 1. 1. Клеточные источники активных форм кислорода и окислительный стресс
      • 2. 1. 2. Окислительная модификация белков
      • 2. 1. 3. Окислительная инактивация растворимой гуанилатциклазы в некоторых патологических состояниях
    • 2. 2. Белки теплового шока
      • 2. 2. 1. Общие свойства белков теплового шока
      • 2. 2. 2. Строение и функции Hsp
        • 2. 2. 2. 1. Внутриклеточные субстраты Hsp
        • 2. 2. 2. 2. Смена белков-партнёров Hsp90 при фолдинге
        • 2. 2. 2. 3. Hsp90 как мишень противоопухолевых препаратов, гельданамицина и радщикола
        • 2. 2. 2. 4. Шаперонные свойства Hsp
        • 2. 2. 2. 5. Участие Hsp90 в регуляции синтеза NO
        • 2. 2. 2. 6. Протекторные свойства Hsp90 при окислительном повреждении белков
  • Материалы и методы
  • 1. Реактивы и оборудование
  • 2. Радиохимический метод определения активности рГЦ
  • 3. Выделение рГЦ из легких свиньи
  • 4. Реконструкция рГЦ с активирующими факторами
  • 5. Аффинная очистка моноклональных антител к Hsp90 на колонке с иммобилизованным Hsp
  • 6. Изучение характеристик взаимодействия рГЦ и Hsp90 при помощи метода поверхностного плазмонного резонанса
  • 7. Изучение влияния Hsp90 на различные способы активации рГЦ в клетках линии
  • PC
  • 8. Коиммунопреципитация рГЦ и взаимодействующих с ней белков из ткани легких кролика. Анализ состава преципитированных комплексов рГЦ
  • 9. Электрофорез в полиакриламидном геле
  • 10. Иммуноблоттинг
  • 11. Определение свободных сульфгидрильных групп при взаимодействии ДТТ или цистеина с ионами Мп2+ и Cd +
  • 12. Определение белка по методу Лоури
  • 13. Статистическая обработка результатов
  • Результаты исследования
  • 1. Выделение из печени кролика факторов, регулирующих Мп2±зависимую активность рГЦ легких, и их идентификация
    • 1. 1. Экстракция и фракционирование сульфатом аммония гомогената печени кролика
    • 1. 2. Гидрофобная хроматография на фенил-сефарозе
    • 1. 3. Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-Тойоперл 650 М
    • 1. 4. Адсорбционная хроматография на гидроксиапатите
  • 2. Доказательства идентичности фактора, стимулирующего Мп2+ -зависимую активность рГЦ, и Hsp
    • 2. 1. Совпадение пиков стимулирующего Мп2±зависимую активность рГЦ фактора и Hsp90 при хроматографической очистке фактора
    • 2. 2. Изучение влияния моноклональных антител, специфичных к нативному
  • Hsp90, на Мп2±зависимую активность рГЦ в присутствии Hsp
  • 3. Изучение взаимодействия рГЦ и Hsp90 методом поверхностного плазмонного резонанса
    • 3. 1. Изучение физико-химических характеристик взаимодействия рГЦ и Hsp
    • 3. 2. Изучение биохимических особенностей взаимодействия рГЦ и Hsp
  • 4. Идентификация комплексов рГЦ и Hsp90 в ткани методом коиммунопреципитации
  • 5. Изучение влияния Hsp90 на активность рГЦ в присутствии различных регуляторов
    • 5. 1. Изучение специфичности влияния Hsp90 на активность рГЦ в сравнении с другими белками теплового шока
    • 5. 2. Изучение влияния Hsp90 на NO-зависимую активность рГЦ и стабильность фермента
    • 5. 3. Изучение влияния Hsp90 на различные способы активации рГЦ в клетках линии PC
    • 5. 4. Изучение влияния Hsp90 на ингибирование активности рГЦ под действием MnCl2HCdCl
    • 5. 5. Изучение влияния Hsp90 на активность рГЦ в присутствии соединений, окисляющих атом железа в составе гемовой группы
  • 6. Влияние Hsp90 на взаимодействие рГЦ и гемовой группы
  • Обсуждение результатов
  • Выводы

Растворимая гуанилатциклаза (рГЦ) является гетеродимерным гемсодержащим ферментом, который представляет собой основной рецептор оксида азота (N0). Молекула N0 — универсальный регулятор состояния сердечнососудистой, иммунной и нервной систем организма. Синтез NO в клетке осуществляется несколькими специализированными изоформами ферментов NO-синтаз из молекулы аргинина. N0 связывается с гемовой группой рГЦ, активируя синтез циклического гуанозинмонофосфата (cGMP) из GTP. Этот внутриклеточный мессенджер в свою очередь модулирует активность cGMP-завиеимых протеинкиназ, cGMP-завиеимых ионных каналов и cGMP-регулируемых фосфодиэстераз, которые участвуют в запуске таких клеточных процессов как расслабление гладкомышечных клеток, ингибирование агрегации тромбоцитов, модуляция синаптической передачи нервного импульса и экспрессия генов. N0 является самым эффективным физиологическим активатором рГЦ. Тем не менее, спектр эндогенных активаторов рГЦ довольно широк и включает в себя низкомолекулярные соединения различной природы. В число этих соединений входят как активаторы, так и ингибиторы рГЦ, которые действуют на различные регуляторные участки фермента. рГЦ подвержена ингибированию различными окислителями, которые переводят гемовое железо из степени окисления +2 в +3, блокируя связывание NO, как, например, производные оксадиазолохиноксалинона, или модифицируют сульфгидрильные группы, ответственные за нормальное функционирование фермента. В литературе описана принципиальная возможность стимуляции рГЦ под действием факторов белковой природы, однако эти факторы не были идентифицированы и не была доказана их способность специфично связываться с рГЦ. Недавно было обнаружено взаимодействие одной из изоформ рГЦ с белком постсинаптической плотности синаптосом мозга (PSD-95), что может быть связано с формированием функциональных многокомпонентных белковых комплексов, в которых синтез сигнальных молекул и ответные реакции ферментов-эффекторов пространственно сопряжены. Однако в этом исследовании не было выявлено непосредственное влияние взаимодействия рГЦ и PSD-95 на синтез cGMP. Таким образом, несмотря на единичные сведения о взаимодействии рГЦ с другими белками клетки, не существует ясных представлений о регуляции активности фермента за счёт белок-белковых взаимодействий.

Синтез, стабильность и связывание оксида азота с рГЦ, а также функционирование фермента в клетке зависят от ее окислительно-восстановительного состояния. Таким образом, внутриклеточная система передачи сигнала ЫО-рГЦ-сОМР может быть повреждена в ходе окислительного стресса, который сопровождает многие патологические состояния, такие как ишемия/реперфузия, диабет и атеросклеротическое повреждение кровеносных сосудов. В нормальной клетке существует специальная антиоксидантная система, функцией которой является нейтрализация различных активных форм кислорода — основных повреждающих агентов окислительного стресса. Известно, однако, что умеренный непродолжительный стресс может в значительной мере защитить NO-зависимые пути передачи сигнала от последующего острого стресса. В результате такого защитного стресса индуцируется синтез ряда белков теплового шока (Hsp). Помимо основной функции Hsp, заключающейся в осуществлении фолдинга и поддержании функционального взаимодействия белков, для некоторых из них характерна способность к защите различных ферментов от окислительной инактивации подобно внутриклеточным низкомолекулярным тиолам. Например, повышенная экспрессия Hsp90 может быть связана с уменьшением чувствительности некоторых ферментов к окислительной инактивации, вызванной ионами металлов. Однако точный механизм защитного действия Hsp не известен.

Недавние исследования показали роль Hsp90 в регуляции системы NO-рГЦ-сОМР. Например, Hsp90 может регулировать активность эндотелиальной и нейрональной изоформ NO-синтаз. Hsp90 стимулирует синтез N0 и подавляет образование супероксид-аниона, осуществляемые NO-синтазой. Hsp90 связывается с эндотелиальной NO-синтазой и стимулирует активацию фермента кальмодулином. Также как и рГЦ NO-синтаза является гем-содержащим ферментом. Оказалось, что Hsp90 значительно облегчает встраивание гемовой группы в молекулу NO-синтазы, участвуя в формировании активного фермента.

В настоящем исследовании был осуществлен широкий поиск белковых факторов, способных регулировать активность рГЦ. На основании существующих теоретических предпосылок была сформулирована и проверена гипотеза о том, что помимо NO-синтаз, Hsp90 может взаимодействовать с рГЦ и регулировать ее активность.

Цель и задачи исследования

.

Целью данной работы было исследовать влияние Hsp90 как одного из эндогенных белковых факторов на синтез cGMP, катализируемый рГЦ, в присутствии гем-зависимых, гем-независимых и аллостерических активаторов фермента, а также в модельных условиях окислительного стресса.

В работе были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. идентифицировать Hsp90 как один из эндогенных белковых факторов, регулирующих активность рГЦ.

2. охарактеризовать взаимодействие Hsp90 и рГЦ с использованием очищенных белков, а также показать возможность образования комплекса Hsp90 и рГЦ в ткани.

3. показать специфичность эффектов Hsp90 по сравнению с другими белками теплового шока.

4. изучить влияние Hsp90 на гем-зависимую и гем-независимую активность рГЦ.

5. исследовать возможность конформационной стабилизации рГЦ под действием Hsp90 в условиях, моделирующих окислительный стресс.

Обзор литературы.

ВЫВОДЫ:

1. Методом поверхностного плазмонного резонанса показано взаимодействие очищенных препаратов рГЦ и Hsp90. Взаимодействие характеризуется высокой аффинностью с константой диссоциации Кц = 5,04 нМ. Показано, что комплекс рГЦ и Hsp90 иммунопреципитируется из легких кролика специфическими моноклональными антителами к а-субъединицы рГЦ.

2. Установлено, что Hsp90 стабилизирует активированную конформацию рГЦ, а также защищает фермент от ингибирования под действием ионов марганца и кадмия.

3. Показано, что другие белки теплового шока, включая Hsp70, Hsp60, Hsp40 и Hsp25 не образуют комплекс с рГЦ в легких кролика, а также не оказывают заметного влияния на её активность, что указывает на возможность специфической регуляции активности фермента под действием Hsp90.

Показать весь текст

Список литературы

  1. А.А. Парадоксы окислительного метаболизма мозга. Биохимия. 1995- 60(9): 1536−42.
  2. А.А., Куклей M.J1. Свободные радикалы в нормальном и ишемическом мозге. Нейрохимия. 1996- 13(4):78−85.
  3. Ю.А., Арчаков А. И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972.
  4. А.Н., Якутова Э. Ш., Владимиров Ю. А. Образование гидроксильных радикалов при взаимодействии гипохлорита с ионами железа. Биофизика. 1993- 38(3):390−6.
  5. И. С. Роль растворимой гуанилатциклазы в молекулярном механизме физиологических эффектов оксида азота. Биохимия. 1998- 63(7):794−801.
  6. В.П. Возможная роль активных форм кислорода в защите от вирусных инфекций. Биохимия. 1998- 63(12):1438−40.
  7. В.П. Кислород и явления запрограммированной смерти: I Северинское чтение. М.: Биохим. об-во РАН, 1999. 48.
  8. В.П. НгОг-сенсоры легких и кровеносных сосудов и их роль в антиоксидантной защите организма. Биохимия. 2001- 66(10):1153−6.
  9. Aizawa, Т.- Wei, Н.- Miano, J. М.- Abe, J.- Berk, В. С., and Yan, С. Role of phosphodiesterase 3 in NO/cGMP-mediated antiinflammatory effects in vascular smooth muscle cells. Circ Res. 2003 Sep 5- 93(5):406−13.
  10. Aktas, В.- Honig-Liedl, P.- Walter, U., and Geiger, J. Inhibition of platelet P2Y12 and alpha2A receptor signaling by cGMP-dependent protein kinase. Biochem Pharmacol. 2002 Aug 1- 64(3):433−9.
  11. Alderton, W. K.- Cooper, С. E., and Knowles, R. G. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochem J. 2001 Aug 1- 357(Pt 3):593−615.
  12. Andrew, C. R.- George, S. J.- Lawson, D. M., and Eady, R. R. Six- to five-coordinate heme-nitrosyl conversion in cytochrome c' and its relevance to guanylate cyclase. Biochemistry. 2002 Feb 19- 41(7):2353−60.
  13. Bayguinov, O. and Sanders, К. M. Dissociation between electrical and mechanical responses to nitrergic stimulation in the canine gastric fundus. J Physiol. 1998 Jun 1- 509 (Pt 2):437−48.
  14. Bayraktutan, U.- Draper, N.- Lang, D.- Shah, A. M. Expression of functional neutrophil-type NADPH oxidase in cultured rat coronary microvascular endothelial cells. Cardiovasc Res. 1998- Apr- 38(1):256−62.
  15. Becker, J. and Craig, E. A. Heat-shock proteins as molecular chaperones. Eur J Biochem. 1994 Jan 15- 219(l-2):ll-23.
  16. Bellamy, Т. C. and Garthwaite, J. The receptor-like properties of nitric oxide-activated soluble guanylyl cyclase in intact cells. Mol Cell Biochem. 2002a Jan- 230(1−2): 165−76.
  17. Bellamy, Т. C. and Garth waite, J. Pharmacology of the nitric oxide receptor, soluble guanylyl cyclase, in cerebellar cells. Br J Pharmacol. 2002b May- 136(1):95−103.
  18. Bellamy, Т. C.- Wood, J.- Goodwin, D. A., and Garth waite, J. Rapid desensitization of the nitric oxide receptor, soluble guanylyl cyclase, underlies diversity of cellular cGMP responses. Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Mar 14- 97(6):2928−33.
  19. , А. Т.- Silverstein, A. M.- Demady, D. R.- Kanelakis, К. C.- Noguchi, S.- Pratt, W. В., and Osawa, Y. Neuronal nitric-oxide synthase is regulated by the Hsp90-based chaperone system in vivo. J Biol Chem. 1999 Jan 15- 274(3): 1472−8.
  20. Benjamin, I. J. and McMillan, D. R. Stress (heat shock) proteins: molecular chaperones in cardiovascular biology and disease. Circ Res. 1998 Jul 27- 83(2): 117−32.
  21. Borkovich, K. A.- Farrelly, F. W.- Finkelstein, D. В.- Taulien, J., and Lindquist, S. hsp82 is an essential protein that is required in higher concentrations for growth of cells at higher temperatures. Mol Cell Biol. 1989 Sep- 9(9):3919−30.
  22. Bose, S.- Weikl, Т.- Bugl, H., and Buchner, J. Chaperone function of Hsp90-associated proteins. Science. 1996 Dec 6- 274(5293): 1715−7.
  23. Brandish, P. E.- Buechler, W., and Marietta, M. A. Regeneration of the ferrous heme of soluble guanylate cyclase from the nitric oxide complex: acceleration by thiols and oxyhemoglobin. Biochemistry. 1998 Dec 1- 37(48): 16 898−907.
  24. Brandwein, H. J.- Lewicki, J. A.- Waldman, S. A., and Murad, F. Effect of GTP analogues on purified soluble guanylate cyclase. J Biol Chem. 1982 Feb 10- 257(3): 1309−11.
  25. Braughler, J. M. Oxidative modulation of soluble guanylate cyclase by manganese. Biochim Biophys Acta. 1980 Nov 6- 616(1):94−104.
  26. Braughler, J. M. Soluble guanylate cyclase activation by nitric oxide and its reversal. Involvement of sulfhydryl group oxidation and reduction. Biochem Pharmacol. 1983 Mar 1- 32(5):811−8.
  27. Braughler, J. M.- Mittal, С. K., and Murad, F. Effects of thiols, sugars, and proteins on nitric oxide activation of guanylate cyclase. J Biol Chem. 1979 Dec 25- 254(24): 12 450−4.
  28. Brugge, J. S. Interaction of the Rous sarcoma virus protein pp60src with the cellular proteins pp50 and pp90. Curr Top Microbiol Immunol. 1986- 123:1−22.
  29. Buchner, J. Supervising the fold: functional principles of molecular chaperones. FASEB J. 1996 Jan- 10(1): 10−9.
  30. Bui, L.- Rish, K.- Jaronczyk, K.- Bourque, S.- McLaughlin, В. E.- Brien, J. F.- Marks, G. S.- Smith, A., and Nakatsu, K. The source of heme for vascular heme oxygenase I: heme uptake in rat aorta. Can J Physiol Pharmacol. 2004 Apr- 82(4):209-l 7.
  31. Burette, A.- Petrusz, P.- Schmidt, H. H.- Weinberg, R. J. Immunohistochemical localization of nitric oxide synthase and soluble guanylyl cyclase in the ventral cochlear nucleus of the rat. J Comp Neurol. 2001 Feb 26- 431(1): 1−10.
  32. Busse, R.- Pohl, U.- Mulsch, A., and Bassenge, E. Modulation of the vasodilator action of SIN-1 by the endothelium. J Cardiovasc Pharmacol. 1989- 14 Suppl 1 l: S81−5.
  33. Calabrese, V.- Bates, Т. E., and Stella, A. M. NO synthase and NO-dependent signal pathways in brain aging and neurodegenerative disorders: the role of oxidant/antioxidant balance. Neurochem Res. 2000 Oct- 25(9−10): 1315−41.
  34. Carney, J. M.- Starke-Reed, P. E.- Oliver, C. N.- Landum, R. W.- Cheng, M. S.- Wu, J. F., and Floyd, R. A. Reversal of age-related increase in brain protein oxidation, decrease in45,4647,48
Заполнить форму текущей работой

Сессия? Спокойно!