Определение аминокислот и их моноаминовых метаболитов в физиологических жидкостях методом микроколоночной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием

Успехи в изучении строения ДНК, химии белка и энзимологии позволили установить природу многих наследственных заболеваний на молекулярном уровне, обнаружить существование огромного генетического полиморфизма структурных белков и белков-ферментов. Биохимические исследования показали, что в основе наследственных болезней обмена веществ лежат генетически детерминированные нарушения ферментов, наступившие в результате генных мутаций. При этом происходит синтез белка с измененной структурой и нарушенными каталитическими свойствами, или синтез нестойкого и быстро распадающегося структурного белка, или же подавление и полное прекращение синтеза белка.

К настоящему времени известно более 600 наследственных ферментопатий, но только для 105 из них установлен точный уровень «метаболического блока» и характер ферментативного дефекта [1]. Количество заболеваний с известным патогенезом растет ежегодно.

Исследования в области клинической генетики с помощью современных методов дают все новые и новые данные о роли наследственности в генезе многих заболеваний детского возраста. Это и нозоологические формы генетически детерминированных заболеваний (хромосомные и генные болезни), и большая группа широко распространенных недугов, при которых существенную роль играет наследственная предрасположенность (астма, аллергические дерматозы, сердечно-сосудистая патология, психические заболевания, заболевания нервной системы, в том числе — рассеяный склероз, и др.) [2, 3]. Во многих случаях возникновение заболеваний определяется взаимодействием полигенно детерминированного наследственного предрасположения и факторов окружающей среды, условий работы, жизни [1, 6].

Однако до сих пор большая часть этих заболеваний не диагностируется или выявляется поздно, когда происшедшие изменения носят необратимый характер. Одна из трудностей ранней диагностики состоит в том, что в период новорожденное&tradeу детей нет специфических расстройств, а обнаруживаемые изменения фенотипически похожи на заболевания ненаследственного генеза. Так, фенилкетонурия (ФКУ) и гомоцистинурия обнаруживаются у детей с олигофренией, муковисцидоз — при пневмонии, галактоземия — при нарушении зрения и т. д. Сложность диагностики заключается также в том, что для наследственных заболеваний обмена веществ характерен выраженный клинический полиморфизм из-за наличия изоал-лельных мутаций или мутаций в разных генах. Перед врачами стоит задача поиска объективных критериев диагностики фенотипически сходных, но генетически гетерогенных заболеваний.

Успехи в решении этой проблемы определяются возможностями разработки и использования в практике специальных биохимических методов определения спектров аминокислот, углеводов, липидов, активности ферментов и др. А необходимость обследования больших детских коллективов предъявляет к разрабатываемым методикам анализа специфические требования: необходима высокая чувствительность метода, т.к. это непосредственно связано с количеством забираемой у пациента крови, цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), лимфы и т. д.- скорость анализа должна быть достаточно высокой, чтобыы проводить скри-нирующие исследованиянеобходима простота пробоподготовки и невысокая стоимость реактивов и расходных материалов или малый их расход.

В перечне анализов, необходимых для диагностики наследственных патологий обмена, первое место по праву принадлежит определению спектра аминокислот. По изменению аминокислотного спектра физиологических жидкостей можно диагностировать несколько десятков (более 60) заболеваний [1, 4, 5, 7, 8, 9] - это и наследственные энзимопатии, и нарушение систем транспорта аминокислот, и вторичные гипери гипоаминоацидурии [1, 6, 9] и их транзиторные формы и т. д. Но для точного определения места «метаболического блока» необходимо определение не только спектра аминокислот, но и их метаболитов. Особенно важно это при нарушении метаболизма триптофана, т.к. в его превращениях участвуют более 10 ферментных систем, которые, в свою очередь, находятся под влиянием кофакторов (особенно пиридоксина), адреналина и других гормонов, микроэлементов и пр. [7, 10,11]. Наиболее важными являются его серотониновый и кинурениновый пути метаболизма.

Вторым важнейшим метаболическим путем с точки зрения диагностики первичных и вторичных энзимопатий является цикл превращения фенилаланина и тирозина [1,7, 12]. Изучение этого метаболического пути важно не только при установлении истинных причин гиперфенилаланинемии (ГФА), таких, как ФКУ, транзиторная ГФА, атипичные формы ФКУ, гипертермия, но и при выяснении причин вторичных аминоацидопатий, выражающихся в неврологических, психических, кардиологических отклонениях, а также при диагностике ряда опухолевых заболеваний. Особенно важно с этой точки зрения определение ванилил-миндальной (ВМК) и гомованилиновой (ГВК) кислот, а также катехо л аминов.

Частым осложнением при энзимопатиях являются дерматиты [2]. Причинами их могут быть нарушения метаболизма как триптофана, так и гистидина. И важным показателем для контроля хода течения этих заболеваний и подбора терапии является гистамин — один из метаболитов гистидина.

Таким образом, для диагностики более сотни первичных и вторичных патологий обмена, связанных с тяжелыми поражениями центральной нервной системы, отставанием в умственном, речевом, физическом развитии, зачастую приводящим к инвалидности, с потерей зрения, аллергическими дерматитами, заболеваниями желудочно-кишечного тракта, а также для подбора терапии и контроля хода их лечения необходима разработка современных методов определения спектра аминокислот, основных метаболитов триптофана (серотонинового и кинуренинового путей), тирозина (катехоламинов, ВМК, ГВК), гистами-на, причем эти методы должны быть пригодны для массовых обследований.

В данной работе рассматриваются методики определения выше перечисленных соединений и применение данных методик в практике Научно-исследовательского центра и кафедры генетики Медицинской академии последипломного образования, Клиники нервных болезней Военно-Медицинской академии, кафедры неврологии Педиатрического университета и Центра «Мозг и иммунитет» .

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТ.

Аминокислоты (АК) являются важнейшими субстратами метаболизма азота в гетеротрофных организмах. От АК берут начало белки, ферменты, пуриновые и пиримидиновые основания, порфирины, гормоны и ряд других соединений. При необходимости АК могут служить источником энергии, главным образом — за счет окисления их углеродного скелета.

В живых организмах АК образуют пул, величина которого у взрослого индивидуума в физиологически нормальных условиях остается постоянной. В зависимости от особенностей синтеза, АК, входящие в состав белков, делятся на заменимые, то есть те, которые могут синтезироваться в организме из других аминоили кетокислот (цистин, тирозин, пролин, ОН-пролин, аланин, глицин, глутаминовая и аспарагиновая кислоты), и незаменимые — те, которые синтезироваться организмом не могут и должны поступать извне. Для человека это валин, лейцин, изолейцин, лизин, метионин, треонин, фенилаланин, триптофан и, в определенных условиях, аргинин и гистидин.

По своей химической природе АК — это алифатические, ароматические или гетероциклические соединения, содержащие, по крайней мере, одну аминои одну карбоксильную группу. В АК белков аминогруппа находится у а-углеродного атома.

СООН I.

И-СН.

В зависимости от химической природы радикала II АК подразделяются на алифатические (гли, ала, вал, лей, иле), ароматические (фал, тир) и гетероциклические (трп, про, ОН-про, гис).

Помимо карбоксильной и ааминогруппы АК могут содержать вторую карбоксильную группу (аспарагиновая и глутаминовая кислоты), аминогруппу (лиз), карбоксиамидную (глутамин, аспарагин), гуанидиновую (аргинин), гидроксильную (серин, тирозин), атом серы (цистеин, таурин, метионин, гомоцистин).

Все природные АК, за исключением глицина, оптически активны. АК высших организмов принадлежат к Ь-ряду.

АК содержат, по меньшей мере, 2 ионизируемые группы: карбоксильную, с рК, лежащим в интервале 1.7 — 3.0, и ааминогруппу с рК около 10. В растворе с рН от 4 до 9 АК существуют в виде цвиттериона, в котором ионизованы и карбоксильная, и аминогруппа.

Кроме этих двух групп в состав некоторых АК входят и другие группы, способные к ионизации (Ш2-, СООН-, ОН-, БН-, гуанидиновая, имидазольная группы). Кривые титрования основной АК (лизина) и кислой (аспарагиновой кислоты) приведены на Рис. 1 [12], а значения рН ионизации различных групп, присутствующих в кислотах — в Таблице 1 [12].

Рис. 1. Кривые титрования основной и кислой аминокислот на примере лизина и аспарагиновой кислоты (кривые 1 и 2, соответственно) [12].

Характерными реакциями для АК являются: переаминирование, дезаминирование, декарбоксилирование, модификация боковой цепи и полимеризация. Большинство реакций превращения АК в организме млекопитающих протекают в печени. Это синтез и распад белков, азотсодержащих соединений, заменимых АК.

Анализ АК осуществляется с помощью качественных реакций (тесты Феллинга, Гат-ри, цианопруссидный и т. д.) [1], с помощью полуколичественных микробиологических методов [13], с помощью методов, основанных на использовании ауксотрофных мутантов микроорганизмов, например штаммов Е. соН [14], различными хроматографическими методами: с помощью бумажной [10], тонкослойной [10,13, 14,15], ионообменной [16, 17], газовой [18, 19], высокоэффективной жидкостной хроматографии [20,21,22]. В последнее время для разделения АК стали применять метод капиллярного электрофореза [23].

Основной проблемой, с которой всегда приходится сталкиваться при анализ АК, являются их низкие коэффициенты поглощения в УФ областях спектра. Поэтому для повышения чувствительности детектирования АК необходимо либо измерять поглощение на очень коротких длинах волн (< 200 нм), либо использовать процедуру предили постколоночной дериватизации.

2 4 6 8 1о Щ рН.

Таблица 1.

Ионизация групп, присутствующих в аминокислотах [12].

Ионизованная группа 1-Карбок-сил 4- или 5-Карбоксил Имидазол а-Амино 8-Амино Фенольный гидроксил Сульфгидрильная (тиольная) Гуани-динная.

Соединен&trade-, содержащие группу а-Амино-кислоты Аспарагино-вая, глута-миновая кислота Гистидин а-Амино-кислоты Лизин Тирозин Цистеин Аргинин.

Ионизация R—СНСООН н1-+ R—СНСОО-1 Щ R— СООН Н+ + R—СОСГ -4NH V 1 Н 11 -'N + 1-Г V 1 Н R—СНСООН к+ Н* + R—СНСООН 1 R— NHj4 н+ + R— NH, P^Q-OH н-+ R—3−1 + R— Snh2cnhr nh2+ н+ + NH-CNHR II NH рН 1.7−2.6 4.3 6.1 9−10.7 10.5 10.1 8.1−8.3 12.5.

Наиболее широко применяемыми реагентами для модификации АК с целью получения продуктов реакции, обладающих более высокими коэффициентами поглощения или флуоресценции, являются [10, 17, 24, 25,26]: Нингидрин:

О «о.

Продукты реакции окрашены в синий или пурпурный цвета, пролин и ОН-пролин окрашены в желтый цвет.

2,4-динитрофторбензол (ректив Сенгера): ю2.

В результате реакции получаются производные, окрашенные в желтый цвет. Фенилизотиоцианат (реактив Эдмана): дающий фенилтиогидантоиновые производные (ФТГ-производные), поглощающие при 254 нм.

Этот реактив с успехом применяется в аминокислотных анализаторах Pico-Tag System (Millipore).

4-хлор-7-нитробензо-2−1,3-оксадиазол (НБД-С1): CI реагирует с первичными и вторичными алифатическими аминами с образованием производных, флуоресцирующих в области 550 нм при облучении УФ с длиной волны 480 нм. 4-фтор-7-нитробензо-2−1,3 оксадиазол (НБД-F) — аналогично НБД-С1.

Ортафталевый диальдегид (ОФДА): с—н с—н о реагирует с первичными аминами в щелочной среде с образованием флуоресцирующих при 430 нм производных. Длина волны облучения 350 нм.

DABS* - 4-диметиламиноазобензен-4-сульфонил хлорид: реагирует с АК с образованием производных, поглощающих в области УФ — 254 нм, и в видимой — 436 нм. *.

DABITC — 4-диметиламиноазобензен-изотиоцианат:

C-S реагирует с АК с образованием производных, поглощающих при 254,269,436 нм. Fluram* - флуорескамин: О реагирует с аминосоединениями с образованием производных, флуоресцирующих в области 490 нм при облучении УФ с длиной волны 390 нм.

Флуородинитрофенилаланинамид (ФДНФ АА):

— Ч /Ш2.

0-СН—с—н.

—с—ш2.

Ш2 II.

9-флуоренилметилхлорформиат (ФМОК, АМШО-ТАй*) [27]: сн2—о—С. I О используется обычно в сочетании с ОФДА. Дает производные АК, поглощающие при 455 нм.

З-бензоил-2-нафтальдегид [28], З-бензоил-2-хинолинкарбоксальдегид [29] - были предложены специально для детектирования с помощью лазерных флуориметрических детекторов на основе Не-Сё лазера. реагирует с первичными и вторичными аминами, фенолами, имидазолами с образованием производных, флуоресцирующих в области 530 нм при облучении УФ с длиной волны 330 нм.

1-диметиламинонафталин-5-сульфонил хлорид (ДНС-С1): о.

ВАИЗУЬ-СГ — 1-дибутиламинонафталин-5-сульфонил хлорид:

ЖС4Н9)2 О бс^С!

Коммерческое название реагирует с первичными и вторичными аминами, фенолами, имидазолами с образованием производных, флуоресцирующих в области 540 нм при облучении УФ с длиной волны 254 и 365 нм.

Этот реагент был синтезирован Вебером для флуоресцентной дериватизации белков в 1952 г. [30]. Методика дериватизации была модифицирована Греем и Хартли [31] и Шуль-цем [32].

Простота процедуры дериватизации в сочетании с сильной флуоресценцией продукта дансилирования принесли ДНС-С1 широкое признание, как одному из наиболее чувствительных реагентов для дериватизации АК.

Во всех видах жидкостной хроматографии АК могут использоваться методы преди пост-колоночной дериватизации. Постколоночная дериватизация, как и опрыскивание пластин для тонкослойной хроматографии или бумажных хроматограмм, служит только для повышения чувствительности детектирования. Метод постколоночной дериватизации требует дополнительного оборудования, удлиняет время определения, приводит к дополнительному размыванию пиков и, главное, не снимает одну из основных проблем определения АКсложности разделения смеси, состоящей из компонентов с ярко выраженными различиями в степени полярности.

Преимуществом предколоночной дериватизации является возможность придания АК большей гидрофобности, что приводит к улучшению селективности их разделения и, как следствие, к уменьшению времени определения.

В настоящее время в лабораторной практике для определения АК широко используются методы тонкослойной хроматографии (ТСХ), ионообменная хроматография с постколоночной дериватизацией нингидрином или ОФДА (аминокислотные анализаторы), высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) производных АК, реже — газовая хроматография (ГХ). Все эти методы имеют свои преимущества и недостатки.

ТСХ АК или их производных является простым, дешевым полуколичественным методом. Недостатками его являются невысокая чувствительность и низкая точность. Переход к количественной ТСХ требует использования сканирующего оборудования, по стоимости сравнимого с оборудованием для ВЭЖХ.

Аминокислотные анализаторы позволяют проводить определение АК в автоматичеQ ском режиме с чувствительностью порядка 10 моль для постколоночной реакции с нингидрином (например, LKB ALFA PLUS или HITACHI 835) и до 10″ 11 моль для реакции с ОФДА.

Недостатками этого метода являются высокая стоимость оборудования и расходных материалов, особенно колонок, и высокая длительность анализа, в сочетании с временем регенерации колонки намного превосходящая продолжительность анализа в ВЭЖХ. Так, даже для «скоростного» аминокислотного анализатора фирмы HITACHI время определения АК белкового гидролизата (т.е. смеси 20 компонентов) составляет 1 час, а физиологической смеси АК — 4 ч- 6 часов [33, 34].

Метод ГХ АК в лабораторной практике применяется реже, чем ВЭЖХ, несмотря на достаточно высокую чувствительность. Большой интерес представляет метод ГХ в сочетании с масс-спектрометрией (МС). Но этот метод требует дорогостоящего оборудования и непригоден для рутинных анализов. Более простой вариант ГХ применяется для определения АК в виде их алкилированных или ацилированных производных [18, 19], т.к. сами АК недостаточно летучи для прямого определения методом ГХ. Алкилирование проводят с использованием метанола, диазометана, пропанола и др. в присутствии в качестве катализатора хлористого водорода, бромистого водорода и др. В качестве ацилирующих агентов применяют уксусный, трифторуксусный и др. ангидриды в различных растворителях, например этилаце-тате, дихлорметане.

Недостатками метода ГХ применительно к определению АК являются низкая устойчивость полученных производных, длительное время пробоподготовки, применение высокотоксичных катализаторов и реагентов, что затрудняет их использование в клинической биохимической лаборатории.

В настоящее время одним из самых универсальных методов разделения сложных смесей является ВЭЖХ. Широкий диапазон молекулярных масс анализируемых веществ, мягкость условий разделения, быстрота анализа, точность, чувствительность, возможность применения высокоселективных детекторов и предварительного концентрирования непосредственно в колонке, позволяющие определять микроколичества веществ в сложных смесях, делают ВЭЖХ незаменимой при определении широчайшего спектра соединений.

При определении АК методом ВЭЖХ возникают, как было ранее отмечено, две основные проблемы: сложность разделения многокомпонентной смеси веществ, имеющих ярко выраженные различия в степени полярности, и низкие коэффициенты поглощения большинства АК. Решение обеих проблем достигается применением предколоночной дериватизации. В литературе описано большое количество методик разделения производных АК. Подавляющее большинство их описывает разделение АК белковых гидролизатов, т. е. 18−20 компонентов. Это, например, разделение ФТГ-производных [35, 36], ОФДА [37], ОФДА-ФМОК [27], ДНС-производных [40, 41], и др.

Количество методических работ, описывающих разделение АК физиологических жидкостей, значительно меньше, и спектр применяемых дериватизирующих агентов уже. Так, популярные в определении белковых гидролизатов ФТГ-производные применяют преимущественно при определении первичной структуры белка по методу Эдмана. Применение ОФДА при определении АК физиологических жидкостей ограничивается тем, что в реакцию с ним не вступают вторичные амины, а следовательно, не детектируются пролин и ОН-пролин[38, 39]. Чувствительность определения цистеин-содержащих компонентов низкая. Сочетание ОФДАи ФМОК-дериватизации, применяемое, например, фирмой Нелу1е1:-Раскагс!, позволяет проводить определение и первичных, и вторичных АК, но требует детектирования в двух диапазонах длин волн: 230/455 и 266/313 нм, что практически трудно осуществимо при использовании стандартного хроматографического оборудования.

Для большей наглядности сравнения различных реагентов для предколоночной дериватизации можно воспользоваться таблицами 2−4 [44].

Таблица 2.

Сравнение реагентов, применяемых для предколоночной дериватизации аминокислот белковых гидролизатов [44].

Параметр ФИТЦ ОФДА ФМОК ФДНБ ФДНФАА ДНС.

Длительность реакции дериватизации, мин 20 0.5 5 30 50 30.

Необходимость удаления реагента высушиванием + - - + +.

Экстракция растворителями — - + - ;

Возможность определения вторичных аминов + - + + + +.

Количественный квантовый выход флуоресценции + + + + + +.

Стабильность производных + - + + + *.

Побочные продукты реакции, мешающие идентификации — - - + + +.

Детектирование 254 нм Флуор. Флуор. 365 нм 340 нм Флуор.

Чувствительность определения пико-моль фемто-моль фемто-моль пико-моль пико-моль ПИКО-МОЛ1.

Наложение примесей в элюенте +. +.

Длительность хроматографического анализа (для а. к. белкового гидролизата), мин 15 18 30 70 110 30.

Как видно из таблиц, для предколоночной дериватизации первичных АК (кроме цис-тина) преимущества ОФДА неоспоримы. Однако, необходимо отметить, что ОФДА-производные нестабильны, что затрудняет его использование для предколоночной дериватизации. Для вторичных АК можно рекомендовать флуоренилметил хлорформиат, или его сочетание с ОФДА, или дансилхлорид. Для случаев, когда необходимо анализировать цис-тин/цистеин-содержащие смеси, стоит рекомендовать дансилхлорид [44].

Таблица 3.

Определение свободных аминокислот методом ВЭЖХ: сравнение четырех методов дериватизации [44].

Параметр ОФДА ФМХлФ ФИТЦ дне.

Предел детектирования, пикомоль (соотношение сигнал/шум = 2.5) 0.8 1.0 5.0 1.5.

Ошибка метода, % (по двухкратному измерению) 1.0−4.7 1.1−5.9 3.6 — 7.0 1.7−4.5.

Воспроизводимость, % 0.4 — 2.2 1.9−4.6 2.6 — 5.5 1.5−4.1.

Стабильность продукта — + + +.

Возможность детектировать вторичные амины/цистин -/- +/- +/+ +/+.

Трудоемкость — +++ ++ +.

Сложности при дериватизации Аэр, Тгр Шэ, Тгр Оги, Тгр, Шв (СУ8)2 ЕКв, Аэр

Таблица 4.

Сравнение специальных ВЭЖХ-параметров реагентов для предколоночной дериватизации [44].

Предел детектирования ОФДА > дансил = дабсил > ФТГ = ФТК.

Точность, воспроизводимость дансил > ФТГ = ФТК > дабсил > ОФДА.

Стабильность ФТК = ФТГ > дансил = дабсил > ОФДА.

ВЭЖХ-разрешение ФТК > ФТГ > ОФДА > дансил = дабсил.

Длительность анализа ФТГ = дабсил < дансил < ОФДА < ФТК.

Одним из наиболее удобных и широко применяемых реагентов в определении АК физиологических жидкостей является ДНС-С1.

Процедура дериватизации в применении к белкам и АК белковых гидролизатов была подробно изучена [31, 32,40,42, 43, 45]. Было показано, что при реакции ДНС-С1 со свободной АК в качестве побочных продуктов образуется 1-диметиламинонафталинсульфоновая кислота (ДНС-ОН), 1-диметиламинонафталинсульфониламид (ДНС-МН2), СО и альдегид или кетон, содержащий на один углеродный атом меньше, чем АК.

На реакционную способность веществ по отношению к ДНС-С1 влияют их основность, стерические факторы, температура и рН среды. Оптимизация условий реакции подразумевает выбор таких параметров, когда скорость реакции образования ДНС-производных намного превышает скорость побочных реакций, т.к. продукты этих реакций способствуют уменьшению выхода ДНС-производных и мешают идентификации исследуемых соединений. Изучение влияния рН среды на выход ДНС-производных АК показало, что для полного протекания реакции дансилирования белков необходимо поддерживать рН в интервале 8.0 — 9.0, а для свободных АК оптимальным является рН 9.0 -10.0. Поэтому большинство исследователей предлагает использовать для проведения реакции 0.1Н раствор гидрокарбоната натрия с рН 8.0 — 9.0. Реакция обычно проводится в водно — ацетоновых растворах, т.к. ацетон подавляет ионизацию аминогрупп, является хорошим растворителем для ДНС-С1 и снижает скорость его гидролиза. ТариЫ и соавт. [45] был предложен в качестве буфера карбонат лития, а реакция проводилась в водно-ацетонитрильном растворе с рН 9.5. В этих условиях разложение ДНС-производных АК и образование ДНС-амида подавляются и не нужен большой избыток реагента для полного дансилирования. Изменения объема реакционной среды не происходит, что улучшает воспроизводимость выхода реакции.

Важным параметром, определяющим выход ДНС-АК, является концентрация реагента в реакционной смеси. При достаточном избытке его полнота превращения АК практически не зависит от исходной концентрации реагента. Но во всех работах, посвященных данному вопросу [40 — 45], рассматривались случаи, когда концентрация АК в образце приблизительно известна. При этом авторы предлагают использовать 5- [40] -ь 500- [41] кратный молярный избыток ДНС-С1. Сложность проведения исследований при диагностике энзимо-патий в том, что концентрация одной или нескольких АК может превышать норму в 10 и более раз, а при генерализованной гипераминоацидурии концентрации всех АК превышают норму в 5 -г-15 раз. При недостаточном молярном избытке реагента наблюдается не только неполное превращение АК в ДНС-производные, но и появление моно-дансильных производных вместо ди-дансильных у таких АК, как лизин, орнитин, гистидин, тирозин, аргинин, цитруллин. То есть вместо, например, ди-дансил-лизина мы получаем три компонента: дидансил-, s-дансил-, а-дансил-лизин. Это затрудняет идентификацию компонентов физиологических жидкостей и препятствует диагностике. Таким образом, этот процесс требует дальнейшего изучения.

Среди факторов, определяющих полноту реакции дансилирования, следует отметить влияние температуры и времени. Повышение температуры, с одной стороны, ускоряет образование ДНС-производных, а с другой — способствует ионизации аминогрупп и воды, что вызывает появление побочных продуктов реакции [42, 43]. Авторы предлагают проводить реакцию при самых разных условиях: от 24 часов при 0° С до 5 ч- 30 минут при 90° С.

Полученные производные в высушенном виде стабильны в течении многих месяцев при хранении в темноте при температуре ниже 0° С. Это делает ДНС-С1 очень удобным реагентом при проведении клинических исследований.

ДНС-АК были разделены с помощью ВЭЖХ впервые Bayer [49] в 1976 г. Разделение осуществлялось с помощью двух колонок с LiChrosorb Si60 (5 мкм) при 65° С. С тех пор было предложено много вариантов разделения ДНС-производных АК белкового гидролизата [50−55]. В большинстве этих методик разделение производится на обращенно-фазовых сорбентах, в основном Ci8: Spherisorb ODS [50], Nucleosil Cig [55], ixBondapack Cis [50], Hypersil Ci8 [51], Ultrasphere ODS [40]. Иногда использовался сорбент типа Cs, например LiChrosorb RP8 [49, 57].

Размеры колонок, как правило, составляли 4,6×250 мм, но иногда использовались более длинные или короткие [51].

Разделение проводилось обычно при комнатной температуре, хотя в некоторых случаях использовалась и более высокая, например 50° С [51, 54, 57].

В качестве элюента обычно используется ацетонитрил и водный буфер. Метанол используется реже, т.к. для достижения аналогичного времени удерживания требуется более высокая концентрация метанола, чем ацетонитрила, а это нежелательно из-за повышения вязкости элюента. Tapuhi ввел в подвижную фазу тетрагидрофуран и триэтиламин [51]. Последнее необходимо для того, чтобыы свести к минимуму влияние доступных силанольных групп сорбента. Тип буфера используется самый разный, но чаще это фосфаты или ацетаты с pH от 4.0 до 7.0.

Во многих работах рассматривались факторы, влияющие на время удерживания ДНС-АК на обращенно-фазовых сорбентах. Это, во-первых, pH буфера [40, 50, 58]. ДНС-АК имеют, по меньшей мере, две группы, способные ионизироваться. Это диметиламиногруппа с рК 4.07 и акарбоксильная группа с рК 3.50. Удерживание ДНС-производных АК зависит от степени ионизации этих двух групп. Влияние рН буфера на время удерживания ДНС-АК на октадецильных сорбентах исследовалось подробно в работах [40, 50, 54]. Полученные зависимости приведены на Рис. 2.

Как и ожидалось, ДНС-АК максимально удерживаются при рН буфера около 3.7 [40]. к',.

АО.

8 рН О.

Рис. 2. Зависимость коэффициента емкости К1 ДНС-аминокислот от рН элюента.

Было показано, что, в общем, ДНС-АК элюируются в порядке возрастания их гидро-фобности, независимо от рН. Исключения составляют производные АК, имеющие дополнительные ионизирующиеся группы (ДНС-амид, ДНС-Арг, е-ДНС-Лиз) [40, 56]. Эти АК обычно сильнее удерживаются на колонке, элюируются более широкими пиками. Их относительное время выхода может варьироваться от колонки к колонке, но не зависит от рН в интервале 5.5 — 8.0 [40]. Это, вероятно, отражает взаимодействие основных групп со свободными силанольными радикалами на поверхности силикагеля, количество которых варьируется у сорбентов различных фирм-производителей, а у некоторых фирм может варьироваться даже от партии к партии.

Поведение а-ДНС-гистидина также аномально и обусловлено ионизацией имидазоль-ной группы при рН ниже 6.0 [50].

Возрастание ионной силы буфера также увеличивает время удерживания полярных компонентов при хроматографии на обращенно-фазовых сорбентах [50, 58]. Этому правилу подчиняются и ДНС-АК, за исключением ДНС-Арг и ДНС-амида.

Предел детектирования ДНС-АК, как правило, составляет 10'12 моль при применении флуориметрического детектора.

Время разделения 20 АК белкового гидролизата при применении современных жидкостных систем высокого давления составляет 30 4- 60 минут.

Таким образом, из литературных данных видно, что основы хроматографического поведения ДНС-АК изучены достаточно подробно, и, казалось бы, не составляет труда подобрать условия разделения для сложной смеси. Но в действительности оказывается, что практически все работы посвящены разделению 20 АК белкового гидролизата, и лишь отдельные работы — анализу физиологических жидкостей, т. е. разделению 25 -30 компонентов [57, 59, 60]. Как правило, при работе с физиологическими жидкостями исследователи ограничиваются сокращенным спектром АК, необходимым только для решения их узкой задачи, например аминокислотные нейромедиаторы [61, 62] или АК, связанные с диагностикой ФКУ [48], или гомоцистинурии [46]. Для определения полной смеси АК, особенно в генетических исследованиях, продолжают применяться практически только аминокислотные анализаторы [34, 64] или их ВЭЖХварианты [63]. Время анализа образца на них составляет 2-^5 часов, а с учетом регенерации колонки — до 4 -е- 8 часов.

На сегодняшний день опубликованы методики только двух групп исследователей [39], позволяющие с помощью ВЭЖХ определять более 40 компонентов, т. е. пригодные, хоть и не в полной мере, для диагностики наследственных патологий [59,60]. Но авторы в обоих случаях используют для предколоночной дериватизации ОФДА, что делает невозможным определение Про и ОН-Про, а, значит, и ограничивает возможности применения данных методик. Так, например, из рассмотрения выпадает большая группа Марфано-подобных заболеваний и становится невозможной дифференциальная диагностика синдрома Марфана и гомоцистинурии.

При анализе физиологических жидкостей серьезные проблемы существуют не только при подборе условий разделения многокомпонентной смеси, но и в процессе пробоподготов-ки, в частности при депротеинизации образца [44,47, 64].

Для отделения белков используют кислоты, органические растворители, ультрафильтрацию или ультрацентрифугирование. Последний метод очень дорог и применяется редко. Ультрафильтрация в последнее время применяется все чаще при пробоподготовке физиологических жидкостей, но возникают серьезные трудности при фильтрации образцов с высоким содержанием липидов, т.к. поры мембраны блокируются необратимо [44].

Наиболее часто для депротеинизации плазмы используется 5-сульфосалициловая кислота (5-ССК), для тканей — хлорная, трихлоруксусная, пикриновая кислоты.

5-ССК наиболее удобна при работе с аминокислотными анализаторами, т.к. фильтрат, получаемый после обработки плазмы, имеет рН 1.0 + 2.0, что удобно для ионообменной хроматографии. Обычно используют 100 мг твердой 5-ССК на 1 мл плазмы. Но возникают сложности при работе с объемами плазмы 10 ^ 50 мкл. Большие концентрации 5-ССК серьезно затрудняют разделение некоторых групп АК, например, при ионообменной хроматографии — групп треонина и серина [44].

Остальные кислоты используются одинаково часто. По мнению некоторых авторов [64], использование кислоты для депротеинизации ведет к увеличению количества триптофана из-за высвобождения Трп, связанного с альбумином.

Многие авторы [34, 44, 63, 64] исследовали выход свободных АК при депротеинизации плазмы и сыворотки различными кислотами и органическими растворителями (ацетон, метанол, этанол, ацетонитрил). Однако данные, приводимые ими, противоречивы. Одни отдают предпочтение 5-ССК и хлорной кислоте, считая, что при использовании органических растворителей выход свободных АК ниже и выше степень деградации аспарагина и глутами-на. Другие придерживаются обратного мнения. Авторы [44] указывают на возможность интерференции пиков 5-ССК и пиков аспарагиновой и глутаминовой кислот, более низкие выходы аспарагиновой и глутаминовой кислот, гистидина, аргинина, валина, лейцина, изолей-цина и ненормально высокий выход пролина и глицина.

Несовпадение приводимых результатов указывает на необходимость дополнительного изучения данного вопроса.

Таким образом, является актуальной задача разработки методики, позволяющей анализировать сложную смесь АК, необходимую для диагностики энзимопатий, методом ВЭЖХ, и пригодной для обследования больших групп детского населения, а в перспективедля скрининговых обследований новорожденных, преи перенатальной диагностики.

Разработка методики должна включать в себя исследование вопросов пробоподготов-ки (депротеинизация, дериватизация) и выбора оптимальных условий разделения производных АК.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОДУКТОВ МЕТАБОЛИЗМА ТРИПТОФАНА. Триптофан: н.

С—СН,—(2—СООН II 1 I сн I ш2.

— незаменимая АК, источником которой служат белки пищи. В организме триптофан используется не только для синтеза белков, но часть его подвергается сложным метаболическим превращениям, в результате которых образуются продукты, участвующие в различных видах обмена и необходимые для функционирования многих органов и систем организма.

Преобразование триптофана идет по трем основным направлениям: серотониновому, кинурениновому и индольному (Рис. 3) [1,100].

Распад триптофана обеспечивается целым рядом ферментных систем и находится в тесной зависимости от концентрации витамина Вб в крови. Наследственные дефекты какого-либо из ферментов метаболического пути превращений триптофана, или синтеза биологически активной формы витамина Вб (пиридоксаль-5- фосфата), или экзогенная недостаточность витамина Вб, или гиповитаминоз Вб, вызванный патологическим состоянием (стресс, дисбак-териоз, гипертермия, беременность, физические нагрузки и др.), приводят к нарушению нормального метаболизма триптофана и тяжелым последствиям, вызванным накоплением тех или иных его метаболитов в организме. Токсическое влияние их на нервную, эндокринную, сердечно-сосудистую системы организма может привести к смерти или тяжелой умственной отсталости (нанизму). С нарушением обмена триптофана связано более 10 синдромов (Гартнепа, Тада, Прайса, «голубых пеленок», Кнаппа-Кромвера и др.).

Роль такого метаболита триптофана, как серотонин, в организме трудно переоценить. Являясь нейромедиатором, серотонин участвует в регуляции многих физиологических процессов — от работы желудочно-кишечного тракта до высшей нервной деятельности.

В связи с важностью серотонина в жизнедеятельности организма, определению его содержания в физиологических жидкостях было посвящено достаточное количество работ, начиная с тридцатых годов. Уровень серотонина определяли с помощью фотоэлектрокало-риметра после концентрирования [65], позже — с помощью спектрофотометра или спектроф-луориметра. Позднее стали использовать реакцию серотонина с ОФДА с последующим измерением флуоресценции продукта реакции [66−68]. Однако в образцах физиологических жидкостей и экстрактах тканей кроме серотонина присутствуют и другие физиологические метаболиты триптофана, причем некоторые — в концентрациях, значительно более высоких, чем серотонин, что затрудняет его количественное определение. Да и чувствительность этих методов была такова, что для определения серотонина требовалось 2 — 5 мл сыворотки или плазмы, т. е. 5 -15 мл крови.

Рис. 3. Схема основных путей метаболизма триптофана.

С развитием ВЭЖХ, естественно, стали появляться и методики определения серото-нина в физиологических жидкостях. Определению остальных индольных метаболитов триптофана в крови внимание уделяли в значительно меньшей степени. Работы по созданию методик определения серотонина проводились в двух основных направлениях. Во-первых, с детектированием его нативной флуоресценции [69−77]. Для этого образец анализируемой пробы депротеинизировали добавлением хлорной или трихлоруксусной кислоты и после центрифугирования супернатант вводили в колонку. Длительность хроматографического анализа составляла 25 40 мин. Как правило, использовали колонки длиной 200 — 350 мм и внутренним диаметром 2.1 -г- 4.6 мм, упакованные обращенно-фазовым сорбентом (С 18) с диаметром частиц 5 -н 10 мкм. В качестве подвижной фазы брали смесь ацетонитрила или метанола с различными буферными растворами с рН 3.5 ^ 4.5. Детектирование флуоримет-рическое при длинах волн возбуждения от 200 до 285 нм. Предел детектирования при этих условиях составлял не менее 1 нмоля в пробе. При том, что содержание серотонина в сыворотке крови здорового человека составляет около 40 нг/мл, а при некоторых патологических состояниях может быть снижено на порядок, такой чувствительности для проведения анализов с диагностической целью или для контроля хода лечения, явно не достаточно.

Данные методики позволяют сравнительно быстро определять содержание серотонина, иногда — 5-ОН-триптофана или 5-ОН-индолуксусной кислоты. Но объемы плазмы крови, необходимые для анализа, достаточно велики. Остальные многочисленные метаболиты триптофана, как индол-содержащие, так и не индольные, в перечисленных выше работах не определяются. Не принимается во внимание также и то, что некоторые метаболиты тирозина, например, гомованилиновая (ГВК) и ванилилминдальная (ВМК) кислоты, находятся в физиологических жидкостях в сравнимых с серотонином количествах и могут детектироваться по нативной флуоресценции в тех же условиях, что и серотонин.

Делались попытки определить содержание серотонина в ликворе, используя детектирование по нативной флуоресценции, но полученные данные явно недостоверны, т.к. разница в приводимых концентрациях составляет два порядка [78, 79].

Хроматографическое поведение 24 индоламинов исследовалось в работе [80]. Но поскольку целью работы было изучение содержания триптамина в мозговой ткани, то авторы решали задачу селективного отделения его от других соединений и разделению остальных компонентов внимания не уделяли.

Большое количество работ было посвящено изучению индоламинов в моче. Особенное внимание уделялось определению 5-ОН-индолуксусной кислоты, в связи с ее ролью при диагностике карциномы [69, 73, 100], а также эумеланин-связанных индольных производных, в связи с их ролью в развитии меланомы и наследственных дефектов пигментации [81, 83, 100]. В работах последнего времени было показано, что с точки зрения диагностики и дифференцирования различных типов опухолей наиболее важным является определение экскреции серотонина и 5-ОН-триптофана, а не только 5-ОН-индолуксусной кислоты [100].

Второй не менее распространенный метод определения серотонина связан с электрохимическим детектированием [72, 80, 82−86]. В этом случае образец, как правило, центрифугировали с добавлением трилона Б, разбавляли подвижной фазой [82, 85, 86], или обрабатывали хлороформом [83] или смесью бутанол — гептан [80]. После этого аликвоту водной фазы центрифугата вводили в колонку. Использовали колонки длиной 100 ч- 250 мм с внутренним диаметром 3 ч- 4.6 мм, упакованные обращенно-фазовым сорбентом, обычно С18, 5 ч- 10 мкм. Подвижная фаза обычно состояла из смеси метанола или ацетонитрила с водными буферными растворами. Детектирование производилось стеклоуглеродным электродом с хлорсереб-ряным электродом сравнения. Время хроматографического анализа 15 ч- 30 минут. Предел детектирования 0.01 нмоль.

Известен метод определения серотонина с помощью ГХ с масс-спектрометрическим детектированием (МСД) [87], но он вряд-ли получит широкое распространение в клинических лабораториях из-за высокой стоимости оборудования. Вместе с тем следует отметить, что в последние годы метод ГХ-МСД стал применяться в Австрии в Национальном Онкологическом центре для определения 5-ОН-индолуксусной, гомованилиновой и ванилилмин-дальной кислот для скрининга новорожденных на предрасположенность к заболеванию ней-робластомой [198].

Предложены были методики определения серотонина и других биогенных аминов в виде ДНСи ОФДА-производных [88−90]. Во всех трех работах предлагается проводить сначала дериватизацию образца цельной крови, гомогената ткани, мочи, а затем экстрагировать производные этилацетатом или с помощью твердофазной экстракции. Но нецелесообразность такого подхода очевидна из-за высокого содержания аминосоединений других классов, также вступающих в реакцию дериватизации с ДНС-С1 или ОФДА, таких, как, например, АК, концентрация которых в плазме крови или моче в 1000 раз выше, чем концентрация серотонина. В методике определения серотонина в виде ДНС-производного [90] не учитывается также возможность образования ди-дансил серотонина, на что было указано в работе [91].

Таким образом, несмотря на большое количество опубликованных работ, связанных с определением индоламиновых метаболитов триптофана в физиологических жидкостях, оказывается, что они в большинстве случаев посвящены определению одного — трех компонентов мочи. Практически нет методик определения 3-индол-лактата, -пирувата иацетата, 14-ацетилсеротонина, и о возможности их появления в крови или ЦСЖ при патологиях обмена триптофана нигде не упоминается.

Второй важный с точки зрения генетических исследований путь метаболизма триптофана — кинурениновый. Кинуреновая кислота (I) и ксантуреновая кислота (II) — неиндольные метаболиты триптофана:

По данным Knapp [92], нарушения цикла кинуренина — ксантуреновой кислоты встречаются значительно чаще, чем фенилкетонурия, и обнаруживаются у 0.5 -1% населения. Клинические проявления ксантуренурии полиморфны и заключаются в проявлениях неврологических расстройств (от склонности к истерии до нарушений интеллекта и психики) в сочетании с проявлениями аллергии (дерматиты, астма и пр.). Но с точки зрения развития методов определения продуктов этого метаболического пути триптофана наблюдается значительное отставание по сравнению с определением АК и серотонина.

Встречаются упоминания об определении кинуренина и, значительно реже — других метаболитов в плазме крови, моче, ЦСЖ методом ВЭЖХ с фотометрическим, флуориметри-ческим детектированием [93−95], электрохимическим детектированием [96], методом ТСХ [97], ГХ с детектором электронного захвата — МСД [98].

Но наибольшее число исследований посвящено определению кинуренина и 3-ОН-кинуренина, являющихся антагонистами глицина и глутаминовой кислоты. Их роль при возникновении нервно-психических заболеваний (болезнь Гентингтона, эпилепсия, шизофрения, булемия, анорексия), офтальмологических (катаракта), изменениях при беременности, ВИЧ-инфекциях, кардиологических патологиях изучается во многих медицинских центрах. Анализу же ксантуреновой и кинуреновой кислот посвящено очень мало работ [94, 95, 98].

В работе [95] предложено разделение шести метаболитов триптофана в моче в изо-кратическом режиме на обращенно-фазовой колонке при элюировании смесью ацетонитрила и ацетатного буфера с pH 7.4 (4: 96) с градиентом скорости от 0.8 до 2.0 мл/мин и спектроО О I.

II фотометрическим детектированием на трех длинах волн (254, 280, 325 нм). В работе [98] предлагается определять триптофан и его семь метаболитов с помощью ГХ или ВЭЖХ в двухдетекторном режиме с детекторами электронного захвата — МСД. Процедура пробопод-готовки, включающая в себя модификацию и получение производных, длительная и дорогостоящая.

Было бы очень заманчиво разработать единую методику определения всех метаболитов триптофана и включить в нее индольные метаболиты тирозина (циклы эумеланина и феомеланина) в физиологических жидкостях и анализировать одновременно смесь из 15 — 20 компонентов. И если говорить о возможности разделения такой смеси стандартов, то это представляется вполне реальным. Но, в действительности, создание такой методики не имеет смысла из-за огромной разницы в физиологических концентрациях (например, триптофан присутствует в сыворотке крови в концентрациях 45 65 нмоль/мл, а мелатонин, даже в ночное время — в концентрациях 25 н- 120 пг/мл) и различий в физиологических и спектральных характеристиках. Так, кинуренин и 3-ОН-кинуренин обладают очень низкой флуоресценцией по сравнению с другими метаболитами, а ксантуреновая и кинуреновая кислоты не растворимы в кислой среде.

К сожалению, любая клиническая диагностическая лаборатория сталкивается с необходимостью делать выбор — что анализировать, как, и каковы при этом будут затраты [100]. Поэтому в данных исследованиях нами были выбраны группы метаболитов, объединенные диагностическими требованиями и сравнимыми величинами диагностических концентраций.

Так, было предложено в физиологических жидкостях определять одновременно триптофан, 5-ОН-триптофан, серотонин, 5-ОН-индолуксусную кислоту, К-ацетил-серотонин и индол-молочную, индол-пировиноградную, индол-уксусную кислоты. Совместно с метаболитами триптофана была реализована возможность определения тирозина и двух его метаболитов — ВМК и ГВК.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МЕТАБОЛИТОВ ТИРОЗИНА.

Тирозин: Н нсмО)—сн2—^—соон ш2.

— заменимая аминокислота, получающаяся в организме в результате воздействия фермента ароматазы на фенилаланин [12, 13].

В упрощенном виде метаболизм тирозина представлен на Рис. 4 [12, 113, 114].

Рис. 4. Упрощенная схема основных путей метаболизма тирозина. Катехоламины (КА) — это 1−11−3,4-дигидроксибензолы: где Л — радикал, содержащий аминогруппу: снз—ш2 (I), —сн—да (II), либо —сн—сн—ш2 (Ш) он он сн3.

Под действием тирозингидроксилазы тирозин превращается в 3,4- дигидроксифенилаланин (ДОФА), который под действием декарбоксилазы ароматических АК превращается в КА: норадреналин (НА), адреналин (А), дофамин (ДА) (И = I, II, III, соответственно), которые, в свою очередь, под действием специфических ферментов превращаются в нейтральные, кислые или основные производные, или выводятся в виде глюкуронидов или сульфатов. Таким образом, только на «катехоламиновом» пути метаболизма тирозин имеет более 30 метаболитов.

С точки зрения проводимых нами исследований наибольший интерес представляют собой КА А, НА, ДА и их метаболиты — ВМК и ГВК. Они важны при диагностике онкологических (феохромоцитомы, нейробластомы, меланомы), неврологических, психических заболеваний, стрессовых состояний, а также в нейрофармакологии и нейроэндокринологии [113, 115,116,117].

По современным данным, в плазме крови они содержатся в следующих концентрациях: А — 35 пг/мл, НА — 257 пг/мл, ДА — < 35пг/мл, ВМК -10 нг/мл, ГВК — 15 нг/мл. Наибольшую сложность представляет определение катехоламинов.

Первые методы определения in vivo катехоламинов, описанные еще в 1939 г. [118], были основаны на измерении их биологического действия на органы, а позже — на колориметрии [119, 120]. Различные методы определения подробно описаны в многочисленных книгах и обзорах, например [121].

Первыми методами, основанными на превращении катехоламинов во флуоресцирующие производные, были тригидроксииндольный и этилендиаминовый [148, 157]. Эти методы были недостаточно селективны и малочувствительны, особенно для измерения уровня катехоламинов в плазме крови.

Были предложены также радиохимические методы (изотопного разбавления, имму-ноферментные, радиоиммунные [114, 122]), но предел детектирования (50 пг) был достаточно высок, и они не нашли широкого применения. Позже эти методы были усовершенствованы [123]. Чувствительность достигла 1 пг для, А и НА и 6 пг для ДА. Этот метод лег в основу наборов для СОМТ — CAT-A-Kit (Upjohn, MI, USA), широко используемых в лабораторной практике.

Но, несмотря на высокую чувствительность и малый объем крови, необходимый для анализа, эта процедура имеет существенные недостатки — сложность и длительность проведения анализа, высокую частоту межлабораторных и внутрилабораторных ошибок [124], необходимость анализировать одновременно большое количество проб.

ГХ с применением ионизационнопламенного детектора (ДИП), детектора электронного захвата или МСД [125, 126] позволила понизить предел детектирования до 0.1 — 2 пг. Пробоподготовка, обычно, включает в себя депротеинизацию, адсорбцию на окиси алюминия с последующей дериватизацией трифторуксусным или пентафторпропионовым ангидридом. Преимущества ГХ — МСД, несмотря на длительное время пробоподготовки, сложное и дорогое оборудование, очевидны при необходимости идентифицировать неизвестное соединение, что нередко требуется в клиническом анализе. Но в рутинном лабораторном анализе этот метод, естественно, распространения не получил.

Наиболее удобным и широко используемым методом для определения катехоламинов и их метаболитов в лабораторной практике является ВЭЖХ. Начиная с середины 70-х годов бурное развитие ВЭЖХ привело к созданию большого количества методов определения катехоламинов и их метаболитов с использованием флуоресцентной пости предколоночной дериватизации или электрохимического детектирования, в которых разделение осуществлялось в режиме обращенно-фазовой, нормально-фазовой или ион-парной хроматографии. При этом подробно рассматривались вопросы забора и хранения физиологического материала, пробоподготовки, оптимизации и автоматизации хроматографического анализа. На эти темы опубликованы сотни статей, множество обзоров [114,115,128,129], ряд книг, например, [121,127]. Однако ежегодно в ведущих журналах мира публикуется ряд новых статей, посвященных определению катехоламинов.

Сложность их определения заключается не столько в достижении хроматографического разделения, сколько в процессе правильной подготовки образца, включая забор физиологической пробы, ее хранение, транспортировку, экстракцию катехоламинов из матрицы. Проблемы возникают при трактовке клинических результатов и в вопросах достоверности и сходимости межлабораторных экспериментов. Это связано с низкими физиологическими концентрациями катехоламинов и низкой стабильностью соединений. Проблемой является также реакция организма на взятие крови. Даже этот небольшой стресс может увеличить нормальную концентрацию НА у взрослого здорового человека до 600 пг/мл [115]. На уровень катехоламинов сильно влияет питание (сыр, томаты, ананасы, бананы, шоколад, ванилин, кофе, чай, кока-кола) [130]. Влияет и положение тела при заборе крови и даже небольшая физическая нагрузка.

Разброс «нормальных» концентраций катехоламинов, определяемых в разных лабораториях, очень велик (средние значения нормы колеблются для НА от 165 до 311 пг/мл, для, А — от 16 до 59 пг/мл, верхние значения колеблются для НА от 250 до 620 пг/мл, для, А — от 38 до 129 пг/мл [115]). Это усложняет трактовку результатов определения и проведение межлабораторных исследований [132].

Для установления нормальных значений концентраций катехоламинов в плазме крови здорового волонтера кровь должна быть взята у человека, свободно лежащего на спине, не ранее, чем через 20−30 минут после введения венозного катеттера. На практике такое осуществить, обычно, не удается, особенно в отношении детей.

КА в плазме крови могут быть стабильны в течение нескольких часов при комнатной температуре [133], хотя многие авторы настаивают на применении антиоксидантов при сборе крови. КА ЦСЖ разлагаются моментально, поэтому сбор ликвора необходимо осуществлять сразу в пробирку, охлаждаемую сухим льдом.

Для экстракции катехоламинов было предложено несколько вариантов одноступенчатых и многоступенчатых процедур. Например, в работах [138, 139] предлагается использовать только депротеинизацию трихлоруксусной или хлорной кислотой, но это не дает достаточной очистки образца от сопутствующих соединений и не позволяет повысить концентрацию исследуемых соединений в пробе. Жидкостная экстракция н-бутанолом, диэтиловым эфиром или этилацетатом с реэкстракцией в водную фазу (соляную или хлорную кислоты) [134−137], или система, содержащая гексан-н-октанол-тетраоктиламмоний бромид, экстрагирующая КА в присутствии дифенилбората [140], не исключают одновременной экстракции сопутствующих эндогенных соединений. Для количественного определения КА экстрагируются таким методом из двух миллилитров плазмы девятью миллилитрами органических растворителей [140].

Предложены были процедуры экстракции катехоламинов на катионообменных смолах, например Bio-Rex 70, Toyopack SP, Toyopack IC-SPS, Toyopack DEAE-S, CM Sephadex C25, Amberlite CG50 Type 1 [141−143]. HO катионообменные смолы удерживают только КА и их нейтральные метаболиты. Спиртовые и кислые метаболиты катехоламинов, в том числе ГВК, ВМК, ДОФА не удерживаются на катионообменнике. Выход исследуемых компонентов после экстракции составляет около 60% по каждому компоненту для всех типов катионообменных смол, кроме Toyopack SP (более 85%) [141].

В 1977 г. для выделения катехоламинов была предложена аффинная хроматография на фенилборатном геле [144]. Несколько типов боратных гелей стали коммерчески доступны (Affigel 601, Amicon 30). Эти гели удерживают катехоловые соединения за счет образования комплексов борной кислоты и гидроксильных групп катехолов при низких pH. Элюирование может проходить при ступенчатом повышении pH [142,145].

На основании принципа аффинной хроматографии на фенил-боратных сорбентах были предложены несколько автоматизированных методов определения катехоламинов и некоторых их метаболитов, в том числе ВМК и ГВК. Образец физиологической жидкости вносится непосредственно в колонку, анализируемые соединения сорбируются прямо на ней, а затем производится переключение потока элюента на вторую, а иногда последовательно и на третью колонку, и образец хроматографируется. Подобные методики описаны для определения А, НА, ДА, ДОФУК, ВМК, ГВК [146, 147].

Наиболее широко используемая методика экстракции и очистки катехоламинов была предложена Anton и Sayere [148] - это экстракция на активированной окиси алюминия. В ходе процедуры экстракции в образец вносят окись алюминия при рН > 8.0, либо вносят образец в колонку с окисью алюминия. При щелочном рН происходит адсорбция катехолов за счет гидроксильных групп на поверхности сорбента. Окись алюминия промывают водой, а КА смывают кислотой. При этом не сорбируются ВМК, ГВК, норметанефрин (НМ), мета-нефрин, 3-метокситирамин, метоксифенилэтиленгликоль. Эти соединения смываются водой. На окиси алюминия удерживаются НА, А, ДА, ДОФА, диоксифенилэтиленгликоль, дигид-роксифенилуксусная кислота, дигидроксиминдальная кислота. Катехолы нестабильны при высоких рН, поэтому процедура экстракции должна проходить как можно быстрее. Десятки работ посвящены оптимизации процедуры экстракции и увеличению выхода катехоламинов. Но результаты этих работ часто противоречат друг другу. Так, в работе [149] утверждается, что только три фактора критичны для данной процедуры: сорт окиси алюминия, ее количество и рН ее непосредственно перед десорбцией. Авторы работ [150,151] утверждают, что количество окиси алюминия не определяет выход катехоламинов при экстракции. Авторы работ [148,150] утверждают, что время, проходящее до смешения окиси алюминия и образца, должно быть как можно меньше, а продолжительность адсорбции — не более 5 минут. Но в работе [149] не наблюдали разницы в выходе катехоламинов при длительности процедуры от 15 до 60 минут. Разночтения наблюдаются в вопросах количества Трис-буфера, объеме воды, необходимой для промывки, и длительности промывки окиси алюминия, молярности и типе кислоты, используемой при десорбции катехоламинов, температуре и длительности возможного хранения образцов, необходимости антиоксидантных добавок в физиологические жидкости и их типе [148 — 153]. Средние коэффициенты экстракции при применении данной процедуры составляют для НА, А, ДА, соответственно, 60, 68, 95%. Но, к сожалению, этот показатель очень сильно зависит от марки окиси алюминия и его партии.

Были предложены также методы ультрафильтрационной депротеинизации, дающие выход 70 — 80% для катехоламинов и их метаболитов, но в предложенных вариантах методик это приводило к разбавлению образца [141].

В связи с важностью определения катехоламинов в клинической лабораторной практике делались попытки стандартизировать соответствующие методикиособенно это касалось правил пробоподготовки, хранения и забора образца [154,155].

Большая часть анализов для определения катехоламинов и их метаболитов в клинических лабораториях развитых стран мира производится с помощью хроматогафических методов. По данным Коллегии американских патологов, более 50% определений катехоламинов и более 30% определений метаболитов в клинических лабораториях производится с помощью ВЭЖХ, и доля их за последние 10 лет выросла во много раз [115].

Разделение катехоламинов методом ВЭЖХ может осуществляться на колонках различных типов — нормально-фазовых [156], ионообменных [151, 157−162], обращенно-фазовых [163]. Причем в последнее время используется, в основном, обращенно-фазовая или ион-парная обращенно-фазовая хроматография.

Впервые обращенно-фазовая хроматография для разделения катехоламинов была предложена Molnar и Horvath [164], а ион-парная обращенно-фазовая — Eksborg и Schill [165]. С тех пор были опубликованы десятки работ, посвященных оптимизации разделения катехоламинов и их метаболитов путем подбора состава подвижной фазы, увеличения эффективности колонок [166−168]. Подробно исследовалось влияние pH, ионной силы буфера, типа и концентрации модификаторов, температуры, марки октадецильного сорбента, концентрации органического растворителя (обычно — ацетонитрила или метанола), возможности применения градиента pH без добавления ион-парных реагентов. В работе [166] предложен вариант компьютерной программы оптимизации подвижной фазы по шести параметрам: содержание ацетонитрила, октилсалициловой кислоты, этилендиаминтетрауксусной кислоты, диэтила-мина в элюенте, температура, pH цитратного буфера. В результате многочисленных экспериментов удалось добиться одновременного разделения 17 моноаминов за 22 минуты на колонке, упакованной Nucleosil Ci8, 5 мкм, размерами 4.6×170 мм.

Детектирование разделенных с помощью ВЭЖХ катехоламинов и их метаболитов может проводиться различными способами:

Спектрофотометрическое детектирование в УФ области пригодно только для определения некоторых компонентов в моче, например ВМК, ГВК или метоксигидроксифенилэти-ленгликоля (МГФЭГ) [121, 127,128]. Для компонентов плазмы чувствительности недостаточно, даже при применении методов концентрирования пробы.

Флуориметрическое детектирование нативной флуоресценции катехоламинов и их метаболитов возможно благодаря флуоресценции катехольной группы при УФ возбуждении на длине волны 285 нм с X эмиссии в интервале 325 -f 340 нм. Этот метод широко применяется для изучения тканевых экстрактов, а при применении предварительного концентрирования пригоден и для анализа некоторых компонентов плазмы и ЦСЖ [170−174], особенно в сочетании с электрохимическим детектированием [172]. Предел детектирования составляет около 400 пг [114].

Гидроксииндольный метод состоит в окислении катехоламинов до флуоресцирующих тригидроксииндолов (А и НА) и дигидроксииндола ДА с помощью гексацианоферрата (III).

Он был предложен как метод постколоночной дериватизации Imai [169] и усовершенствован Mori [153, 158]. Этот метод очень селективен и чувствителен по отношению к, А и НА и применялся для анализа образцов плазмы, мочи, тканей мозга.

Предколоночная дериватизация флуорескамином позволяет определять ДА, НА, НМ и 3-метокситирамин (ЗМТ), но не А, т.к. с, А флуорескамин не реагирует [175].

Предколоночная дериватизация дансил-хлоридом [176, 177] позволяет определять КА и их метилированные метаболиты, но чувствительность определения невелика (500 пг), и, кроме того, определение дансилированных катехоламинов осложняется возможностью образования монои ди-дансил-производных, что затрудняет идентификацию и количественное определение.

Предколоночная и постколоночная дериватизация ОФДА дает метод, чувствительный к ДА и НА, но, А не определяется [178], т.к. не реагирует с ОФДА.

Конденсация с этилендиамином используется в качестве постколоночной дериватизации для определения ДОФА, ДА, НА, А. Предел детектирования 20 — 40 пг [179]. Были предложены также постколоночная дериватизация глицил-глицином [162] и периодатом [180, 181], пригодные для определения компонентов мочи, но недостаточно чувствительные для плазмы.

Nohta с соавторами [182] предложили использовать 1,2-дифенилэтилендиамин (ДФЭД) для предколоночной дериватизации катехоламинов. В реакцию вступают А, НА, ДА, норметилендиамин (Н-МДА) и изопротренол (ИП) (последние два используются как внутренние стандарты), т. е. реагент является высокоизбирательным в отношении именно катехоламинов и продукты реакции имеют очень высокий выход флуоресценции. Предел детектирования составляет 2 фемтомоля при вводе пробы объемом 100 мкл и разделении на обращенно-фазовой колонке. Метод пригоден для определения ДА, А, НА в моче, плазме [183−186], эритроцитах. Синтез ДФЭД осуществляется по методике, описанной в [187].

В вышеперечисленных работах рассматривались условия разделения ДФЭДкатехоламинов и проведения реакции дериватизации: влияние на скорость реакции различных органических добавок (глицин, этанол, ацетонитрил), концентрации феррицианида калия, концентрации ДФЭД, температуры и длительности реакциистабильность производных, тип и молярность буфера (был предложен 1.75 M бициновый буфер) при разделении компонентов смеси.

Разделение ДФЭДкатехоламинов осуществлялось на обращенно-фазовых сорбентах в элюентах, содержащих ацетонитрил или метанол и водный буфер (Трис, ацетат, цитрат) с рН 7.0. Детектирование флуориметрическое с длиной волны возбуждения 345 нм и флуоресценцией производных при 485 нм. Разделение осуществлялось за 8 — 15 мин в зависимости от выбранного внутреннего стандарта. Данные о стабильности производных противоречивы, но ясно, что ДФЭДпроизводные быстро разлагаются на свету (убыль флуоресценции — 20% за 6 часов).

К недостаткам этого метода относится необходимость проведения реакции катехола-минов с ДФЭД в слабо-щелочной среде, в которой сами КА нестабильны. Сложность при попытке воспроизведения методики возникает и в связи с необходимостью использовать бициновый буфер, дорогой и труднодоступный .

В работе [189] было предложено стабилизировать КА с помощью боратного буфера, учитывая стойкость этих комплексов. Этот подход имеет преимущество еще и потому, что не требуется депротеинизация образца кислотой, приводящая, по мнению некоторых авторов, к частичному высвобождению катехоламинов из сульфатных комплексов, что приводит к завышению определяемых концентраций свободных катехоламинов. Было сокращено также время реакции до 5 минут и предложена процедура очистки и концентрирования образца после реакции на колонке размером 10×4 мм с 10 мкм полимерным сорбентом с пришитыми бутильными группами (CQH-3BS, Mitsubishi Chem. Inc., Japan). Все эти нововведения позволили сконструировать модель автоматического анализатора катехоламинов. Время полного анализа образца составило 15 минут, время хроматографического разделения — 8 минут. Предел детектирования — 0.6- 0.9 и 2.0 пг/мл для НА, А и ДА, соответственно.

Наиболее широко применяемым методом детектирования катехоламинов в настоящее время является электрохимический, предложенный Adams в 1969 г. Используются два типа электродов — стеклоуглеродные плоского типа или матричного (кулонометрический). Чувствительность второго намного выше, но соотношение сигнал/шум ухудшается со временем. Электроды первого типа можно очистить и отполировать, а электроды второго типа — нельзя. Стоимость вторых намного выше, но можно использовать их, соединив подряд несколько штук при различных потенциалах, и таким образом добиваясь улучшения детектирования исследуемых компонентов [114,190].

Вопросам оптимизации подвижной фазы с учетом чувствительности электрохимического детектирования посвящены десятки статей, например [191−194]. Электрохимический детектор (ЭХД) остается в настоящее время наиболее широко применяемым типом детектора для определения катехоламинов, но его использование имеет свои особенности — нестабильность показаний во времени, особенно при смене элюента, наличие широкого пика в начале хроматограммы, часто мешающего определению НА, появление пика, коэлюирующегося с ДА (по-видимому, кофеиновая кислота). Чувствительность ЭХД не одинакова по отношению к катехоламинам и их метаболитам, в том числе — ВМК и ГВК. Поэтому для их одновременного детектирования были предложены двухдетекторные хроматографические системы (ЭХД — УФ или ЭХД — флуориметр) [170, 172, 199].

И все же, несмотря на перечисленные выше недостатки, ВЭЖХ — ЭХД остается в настоящее время наиболее широко применяемым методом определения катехоламинов в клинических лабораториях развитых стран мира.

В нашей стране проблема определения катехоламинов в физиологических жидкостях практически не решена. Если для определения катехоламинов в моче Дзержинским ОКБА выпускается, хотя и малочувствительный и ненадежный, анализатор катехоламинов, то определение катехоламинов в крови проводится только единичными лабораториями [160], в основном — научно-исследовательских институтов. В лабораторной практике продолжает применяться старый флуориметрический метод, пригодный только для анализа мочи.

Таким образом, остается актуальной проблема разработки высокочувствительной методики для определения катехоламинов.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГИСТАМИНА.

Гистамин.

— это гормон, образующийся при декарбоксилировании гистидина при участии пиридоксаль-фосфата. В физиологических жидкостях и тканях встречается в связанном состоянии в соединениях с гепарином, гетерополисахаридами, ацетоном и др.

Гистамин расширяет кровеносные сосуды, понижает кровяное давление. Уровень гис-тамина регулируется адреналином, норадреналином, ацетилхолином, гормоном роста и др. При избытке гистамина может наступить гистаминовый шок. Уровни гистамина и серотони-на являются важнейшими показателями при изучении тяжести состояния и прогнозе хода течения аллергических, неврологических заболеваний, заболеваний желудочно-кишечного тракта.

Первые методы определения гистамина связаны были с использованием биологической активности органов [101], а позже были предложены колориметрические методы [102], спектрофотометрические [103], спектрофлуориметрические [104]. Но, как и серотонин, и КА, гистамин присутствует в крови в очень низких концентрациях по сравнению с другими соединениями — менее 1 нг/мл в норме, что затрудняет его определение.

С развитием ВЭЖХ были предложены методики определения гистамина в виде ОФДА-производных с флуориметрическим [105−108] и электрохимическим [109] детектированием, ДНС-производных [90, 91, 110], производных с флуорескамином [111], методом ГХМСД [112].

В большинстве работ экстракция гистамина проводилась из депротеинизированного образца органическими растворителями в присутствии NaOH и NaCl (для связывания АК) с реэкстракцией в кислоту. Разделение производных осуществлялось методом обращенно-фазовой ВЭЖХ, обычно — на колонках с октадецильным сорбентом с диаметром частиц 5 -н 10 мкм. В качестве подвижной фазы использовалась, обычно, смесь ацетонитрила и водного буфера. Чувствительность при флуориметрическом детектировании ОФДА-гистамина при облучении светом с длиной волны 335 -s- 356 нм и флуоресценции в области 430 -г 450 нм составляла в лучшем случае 100 пмоль/мл [108], в остальных работах была значительно хуже. Для анализа требуется от 1 до 5 мл сыворотки, т. е. 3 + 15 мл крови.

Процедура экстракции органическими растворителями длительная и требует большого их объема. Так, для двукратной экстракции пятикратным избытком бутанола из 2 мл сыворотки требуется 20 мл растворителя, а из 5 мл — соответственно, 50 мл.

Время, необходимое для экстракции гистамина по описанным выше методикам, составляет от 2.5 до 4 часов. А поскольку гистамин является быстро разлагающимся соединением, то такое длительное время подготовки пробы резко снижает воспроизводимость и точность определения.

Поскольку при контроле хода лечения гистамин определяется неоднократно совместно с метаболитами триптофана, стероидными гормонами и др., то большое количество крови, необходимое для каждого анализа при использовании стандартных методик определения, плохо отражается на состоянии пациента.

В связи с вышеперечисленным остается актуальной проблема разработки более чувствительной, менее длительной и менее трудоемкой методики определения гистамина.

ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ.

В настоящее время многими исследователями отмечается все возрастающая роль ВЭЖХ в биохимических и биомедицинских исследованиях [17, 203, 204]. Все больше фирм выпускают приборы для ВЭЖХ, комплектующие изделия, сорбенты, колонки. В мире издается множество журналов, посвященных применению ВЭЖХ, в том числе и специализированные журналы, посвященные ее биомедицинскому применению.

Следует выделить несколько причин быстрого развития ВЭЖХ:

— большой диапазон молекулярных масс веществ, которые можно определять с помощью ВЭЖХ — от единиц до десятков миллионов;

— мягкость условий проведения определения, что особенно важно для лабильных соединений, в частности — биологически активных веществ;

— эффективность разделения, которую уже сейчас дает ВЭЖХ, составляет до 150 тысяч теоретических тарелок на метр, что позволяет проанализировать самые сложные смеси соединений, в том числе и биологические жидкости;

— высокая скорость анализа;

— чувствительность, достигаемая в ВЭЖХ, особенно — благодаря применению селективных высокочувствительных детекторов, позволяет определять иногда даже фемтограммы вещества.

Основные требования, предъявляемые к хроматографии, можно свести к трем группам проблем, связанным:

— с удовлетворительным разделением компонентов анализируемой смеси,.

— с идентификацией основных компонентов смеси,.

— с количественной оценкой отдельных компонентов смеси.

Совокупность этих вопросов называют «общей задачей хроматографического элюи-рования» или оптимизацией процесса разделения и обнаружения компонентов [207].

Повышение удерживания веществ в хроматографической колонке ведет к улучшению разделения, но одновременно и к снижению максимальной концентрации компонентов в подвижной фазе. Зависимость изменения концентрации определяемого компонента (Ст) от времени (1) в конце хроматографической колонки длиной Ь выражается следующим образом:

— точностьгде Ш- - общее количество 1 -го компонента, введенного в хроматографическую колонкуРт — объемная скорость потока подвижной фазыН — высота, эквивалентная теоретической тарелкегя — время удерживанияI — время.

Исходя из этого уравнения, можно определить концентрацию компонента в максимуме пика, т. е. при I = гя" .

С) = (2) тах Ршгя2*Н Оптимизация хроматографического процесса в целом должна предусматривать как улучшение разделения компонентов смеси, так и уменьшение размывания пиков. Параметр, учитывающий оба эти требования и служащий критерием оптимизации процесса разделения, называется коэффициентом разрешения (Кя). Его определяют как отношение расстояния между максимумами двух соседних пиков к среднему арифметическому их ширины на нулевой линии.

Кк = 2(*к2 «*К1> (3) со х + (О 2.

Учитывая, что при полном разрешении пиков Кр=1, для Гауссовых пиков (со = 4а) равной высоты с пренебрежимо малой разницей в стандартных отклонениях (см = стг) уравнение (3) преобразуется в следующее:

К = - (4).

4сг.

С учетом того, что О^^ш) = 1о (к2 — к^, а = к2/ к!, где к =^^0)/ ^ - коэффициент емкол сти, го — время выхода пика несорбируемого компонента, п = О^/а), где п — число теоретиче.

9 О ских тарелок, а — селективность колонки, N =(Гя/сО — число эффективных теоретических тарелок [207],.

1 сг — 1 к I— 1 а — 1 Гхт~'.

К&bdquo- =—• -л/п =—лЖ (5) к 4 а к +1 4 а.

Подбирая условия хроматографического разделения, этими тремя переменными можно в определенной степени варьировать. Число теоретических тарелок К= Ь/Н. Учитывая это при анализе выражения (5), получаем, что коэффициент разрешения пропорционален корню из Ь, то есть увеличивая длину колонки и, соответственно, время анализа, например, в 4 раза, мы увеличиваем разрешение только в 2 раза. При этом увеличивается и размывание.

1 П пиков, пропорциональное (НЬ). Аналогичная зависимость наблюдается и между Кя и Нуменьшение Н в 4 раза приводит к увеличению Кя только в 2 раза [14]. Улучшение разрешения путем увеличения коэффициента емкости ведет, во-первых, к увеличению времени удерживания, а значит, и длительности анализа, а во-вторых, при сильном увеличении к величина к/(к+1) стремится к 1 и при к > 5 увеличивается слабо. Основная роль принадлежит, а — коэффициенту разделения (селективности колонки), который можно увеличивать при соответствующем выборе подвижной и неподвижной фаз и условий разделения.

Основное преимущество ВЭЖХ перед ГХ заключается в возможности изменения коэффициентов емкости и селективности путем изменения состава подвижной фазы. Практически, для пары веществ, пики которых на хроматограмме мало отличаются по высоте, удовлетворительным считается Kr=1.0. Для очень точных анализов требуется значение Kr=1.5. Дальнейшее увеличение Kr приводит лишь к увеличению длительности анализа. Если же высоты пиков сильно отличаются, то Kr должен быть «1.5. В противном случае сильно возрастает ошибка при количественном определении минорного компонента [207].

На практике оптимизацию хроматографического процесса проводят для большого числа компонентов. При этом вводят критерий, определяющий пиковую емкость [210] - прчисло пиков на хроматограмме, разрешенных с определенным коэффициентом Kr, например, KR=1. np = 1 + 0.6 N½ lg (1 + k’n), (6) где k’n — фактор емкости последнего пика. Очевидно, что селективность колонки, а должна быть такой, чтобы обеспечить разделение максимального числа пиков на хроматограмме при заданных Kr, N, и k’n [205]. Для обеспечения этого требования необходимо использовать программирование состава элюента или других хроматографических параметров. При разделении многокомпонентной смеси, как правило, ориентируются на наиболее трудно разделяемые пары компонентов.

При использовании одной подвижной фазы (изократического элюирования) для сложных смесей компоненты, элюирующиеся первыми, разделяются плохо, а последние долго удерживаются в колонке и сильно размываются. В этом случае следует менять полярность подвижной фазы в ходе разделения, т. е. применять градиентное элюирование.

Рассмотрению вопросов качества (performance) хроматографической системы посвящены сотни публикаций. Разработке теории микроколоночной жидкостной хроматографии большое внимание уделяли коллективы авторов во главе с Исии [208], Новотным [206], Беленьким [205] и др. Ими были разработаны теоретические основы оптимизации капиллярной жидкостной хроматографии. Этот метод особенно актуален для нашей страны, т.к. у нас с середины 70-х годов выпускались серийно микроколоночные хроматографы с детекторами различных типов — УФ, СФ, ЭХД, рефрактометрическим, флуориметрическим, лазерными флуориметрическим и рефрактометрическим детекторами, предназначенные для работы с колонками диаметром 0.5 — 2 мм. В ряде исследовательских центров накоплен большой опыт использования микроколоночной ВЭЖХ для анализа объектов самой разной природы.

При разработке теории микроколоночной жидкостной хроматографии особое внимание уделялось оптимизации по скорости, по чувствительности, подробно рассматривался вклад экстраколоночного размывания и формулировались требования к оптимизации капиллярных хроматографических систем [205]. Подробно рассматривались проблемы конструирования аппаратуры для капиллярной жидкостной хроматографии и способы их технического решения. Так, даже в самом простом случае, когда используется колонка с внутренним диаметром 1 мм, необходимо иметь быстродействующий детектор с ячейкой 0.3 — 0.5 мкл, уметь воспроизводимо вводить в колонку образец того же объема и обеспечивать стабильную подачу растворителя со скоростью 1−100 мкл/мин в изократическом или градиентном режиме. При этом считается, что размыванием в соединительных капиллярах можно пренебречь, т.к. разработаны способы соединения колонки с детектором и дозирующим устройством без промежуточных капилляров [205]. Хроматографическое оборудование, совместимое с набивными микроколонками диаметром 0.5 — 1 мм в настоящее время выпускается многими фирмами, хотя некоторые проблемы до сих пор решены не до конца. Это, прежде всего, проблемы сохранения концентрационной чувствительности детекторов при уменьшении объема ячейки и воспроизводимости формирования градиента в области 0−10%и90−100% концентрации стартового растворителя при скоростях элюирования порядка единиц мкл/мин.

В последние годы микроколоночная хроматография привлекает к себе все больший интерес еще и по соображениям экономическим — стоимость высокоочищенных растворителей, реагентов, мелкодисперсных сорбентов очень велика. Снижение только расхода элюен-та в 20 раз при переходе от колонки с внутренним диаметром 4.6 мм к колонке в 1 мм при той же линейной скорости анализа сильно удешевляет проведение серийных анализов и научных исследований. Нельзя сбрасывать со счета и проблему утилизации органических растворителей. В развитых странах мира стоимость утилизации органического растворителя зачастую превосходит стоимость его покупки. Регенерация растворителей часто не дает желаемого эффекта, да и стоимость необходимого оборудования, расход электроэнергии также очень велики. Для клинической биохимической лаборатории крайне важны также токсическая и пожарная безопасность, которые обеспечивает применение микроколоночной ВЭЖХ.

По эффективности микроколоночная ВЭЖХ не уступает обычной [205, 206]. Главное достоинство микроколоночной ВЭЖХ — возможность работать с микроколичествами вещества. Это особенно важно при обследовании детей и при проведении многопрофильных исследований, особенно при патологических состояниях новорожденных. Однако для того, чтобы потеря эффективности, связанная с дозировкой образца, не превышала 3%, максимальный объем пробы для колонок с внутренним диаметром 1 мм должен составлять 0.3 1.4 мкл [205]. Инжекторы с внутренней или наружной петлей объемом 1 мкл выпускаются различными фирмами, но часто их недостатком является большая разница между дозируемым объемом пробы и тем объемом, который необходим для заполнения всех коммуникаций.

В связи с этим большой интерес вызывает возможность вводить в колонку большие объемы проб и концентрировать их в верхней части колонки при использовании растворителя, обеспечивающего большую емкость сорбции.

Этот прием используют и с целью повышения чувствительности определения, если при прямом вводе пробы концентрация исследуемого вещества ниже предела обнаружения при максимальной чувствительности детектора. Тогда для определения это вещество необходимо накопить. Накопление можно осуществить путем сорбции компонентов анализируемой пробы на форколонке, сорбционном патроне для твердофазной экстракции или непосредственно в аналитической хроматографической колонке. В последнем случае в колонку вводится большой объем пробы, растворенной в неэлюирующей подвижной фазе. При этом компоненты пробы, находящиеся в ней в ничтожно малых количествах, накапливаются на входе в колонку. После изменения состава подвижной фазы проводится хроматографический анализ [207]. Различные способы ввода пробы в микроколонки и конструкции устройств, используемых с этой целью, подробно описаны в работе [205].

Следует отметить однако, что микроколоночная ВЭЖХ имеет и серьезные недостатки. Это худшие показатели воспроизводимости удерживаемых объемов, особенно для слабо удерживаемых соединений, что связано с меньшей точностью подачи элюента при скоростях элюирования в несколько мкл/мин из-за сложностей механической обработки деталей насосовменьший срок службы колонок, т.к. относительный объем пробы, вносимой в микроколонку, значительно превышает этот показатель для колонки нормального размера. Время анализа, особенно при введении пробы большого объема, больше на микроколонке по сравнению с временем того же анализа на обычных колонках. Но часть из этих отрицательных моментов можно преодолеть, совершенствуя технические характеристики приборов, подбирая соответствующую процедуру пробоподготовки и способ элюирования.

В связи с этим, по мнению многих ученых, расширение области применения микроколоночной ВЭЖХ представляет большой научный и практический интерес [203−209], особенно в клинической биохимии.

Качественная идентификация разделяемых компонентов в хроматографии основана на характеристиках удерживания, которые являются термодинамическими функциями. Они являются постоянными величинами для данного компонента в данной хроматографической системе, но не являются специфическими для данного компонента. То есть тождественность времени удерживания определяемого компонента и стандарта еще не доказывает их идентичности.

Для повышения надежности идентификации применяют селективные детекторы (МСД, ИК, УФ с диодной матрицей). Повышают надежность идентификации и используя спектрофотометрические, спектрофлуориметрические и электрохимические детекторы, и применяя специфические дериватизирующие реагенты, которые к тому же могут улучшать параметры разделения, если применяется предколоночная дериватизация, и повышать чувствительность количественного определения компонентов смеси.

Снижение предела обнаружения остается одной из важнейших проблем для микроко-. лоночной хроматографии, т.к. для сохранения эффективности хроматографической системы кювета детектора должна иметь объем, равный долям микролитра. Это приводит к возникновению серьезных технологических проблем при конструировании кювет детекторов для микроколоночных хроматографов, особенно спектрофотометрических и рефрактометрических. Флуориметрические детекторы могут иметь предел детектирования в 100−1000 раз ниже, чем фотометрические. И особенно следует отметить преимущества лазерных флуоримет-рических детекторов для микроколоночной хроматографии. Благодаря высокой мощности лазерного излучения (до 10 Вт), малому радиусу лазерного луча, возможности фокусировки луча в микрокювету, монохроматичности удается не только сохранить, но и превысить характерную для флуориметрии высокую чувствительность регистрации [205]. Например, разработанный в Институте физики АН Белоруссии флуориметрический детектор на основе Не-Сс1 лазера совместим с микроколонками с внутренним диаметром 0.5 мм, имеет освещаемый.

1 Я объем ячейки 0.1−0.4 мкл и предел обнаружения по флуоресцеину 10 г [205].

В клинической лабораторной практике применяются анализы двух типов: скрини-рующие и специальные высокоселективные. Первые пригодны для качественного или полуколичественного определения каких-либо компонентов физиологических жидкостей у больших групп пациентов. Эти методы должны быть, в первую очередь, высокоскоростными, простыми в исполнении, дешевыми. Для таких анализов чаще всего используют цветное окрашивание, иммуноферментные, радиоиммунные методы, ТСХ.

С другой стороны, разрабатываются специальные методики анализа многокомпонентных смесей с высокой селективностью, необходимые для тонкой диагностики, контроля хода лечения. Эти анализы требуют специального оборудования, высокой квалификации персонала.

При этом следует учитывать, что эти анализы могут выполняться от нескольких раз до нескольких десятков раз в неделю, и иметь специальный хроматограф для каждого анализа не в состоянии ни одна самая крупная клиническая лаборатория. Поэтому в большинстве лабораторных центров пришли к необходимости создания комплекса методик анализов, объединенных такими общими параметрами, как способ детектирования, размер колонки, тип сорбента, состав элюента, способ элюирования (изократический или градиентный) и т. п. [100,203]. В данном направлении ведутся работы и в Научно — исследовательском центре СПб МАПО совместно с ИВС РАН.

В настоящей работе рассматривается ряд методик, разработанных для микроколоночного хроматографа со спектрофлуориметрическим детектором, фторопластовыми колонками 0.5×200 — 300 мм, упакованными сорбентом МискоэП^-С^, выполняемых в режиме градиентного элюирования в системе: ацетонитрил — водный буфер, которые необходимы для диагностики патологий обмена различного типа.

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА В КЛИНИЧЕСКОМ ЛАБОРАТОРНОМ АНАЛИЗЕ.

Проблема контроля качества имеет общий характер для многих видов деятельности, связанных с проведением измерений. ГОСТ 16 263–70 определяет ряд критериев качества измерений, как общих (точность, воспроизводимость, правильность, сходимость), так и специфических для клинической лабораторной практики.

В биологическом материале, с которым имеют дело лаборатории, невозможно установить точную величину измеряемого параметра. Для многих веществ определяемая величина зависит от используемого метода. Это особенно важно для ферментов, гормонов и белковых фракций. Так, например, при определении кортизола радиоиммунным методом верхняя граница «нормы» в 4 раза превышает значение, получаемое при использовании метода ВЭЖХ, т.к. радиоиммунный метод не является селективным по отношению к кортизолу, а определяет кортикостероиды суммарно. При использовании ВЭЖХ разделяют кортизол, кортизон, их дезоксии дигидропроизводные, что и влияет на величину «нормы». Некоторые вещества существуют в различных формах, могут быть связаны с другими веществами, или находиться в свободной форме. Связывание может быть разрушено при одних методах анализа и не разрушено при других. Поскольку абсолютная величина измеряемого параметра не известна, то принимается, что средняя величина результатов из референтных (экспертных) лабораторий, использующих один и тот же метод, является истинной величиной, если новая информация не отвергает эту гипотезу [214, 217−219].

Ошибки, встречающиеся в клинических лабораториях, можно разделить условно на внелабораторные (канцелярские, ошибки при взятии пробы, при ее транспортировке и хранении, при подготовке пациента к взятию пробы, при трактовке результатов анализа) и внут-рилабораторные (систематические и случайные ошибки).

Ошибки первой группы необходимо учитывать при трактовке результатов анализов. Для того, чтобы их избежать, необходимо четко формулировать требования к процессу забора пробы. Это должно касаться подготовки пациента — отмены принимаемых лекарственных и витаминных препаратов, которые могут изменить уровни определяемых веществ, изменений в диете (например, при определении КА или серотонина на их концентрации влияет употребление в пищу таких продуктов, как бананы, ананасы, томаты, ванилин, шоколад, чай, кофе, какао, сыр, кока-кола и многие другие продукты питания). Необходимо четко определить способ сбора физиологической жидкости, вплоть до положения тела пациента. Так, например, уровни верхней границы «нормы» для КА в положении «лежа — сидя — стоя» составляют, соответственно, для НА: 410 — 680 -700- для А: 50 — 60 — 900. Важно указать время сбоpa (например, для кортикостероидных гормонов максимум наблюдается в 8 утра, а к 10 часам их концентрации снижаются в несколько раз), и время последнего приема пищи.

Необходимо указать тип консерванта и его количество. Например, при сборе суточной мочи для определения катехоламинов необходимо добавление кислоты, чтобы избежать их окисления, а для определения ксантуреновой кислоты кислая среда противопоказана, т.к. ксантуреновая кислота в кислой среде нерастворима. Для определения КА необходимо использовать плазму крови, а, следовательно, производить забор крови с использованием консерванта. Если же для анализа используется сыворотка крови, то консервант исключается. Крайне важны также условия центрифугирования, время, прошедшее до отделения сыворотки, гемолиз и т. д.

Очень важно учитывать и психологическое состояние пациента при заборе крови, особенно при определении нейромедиаторов различных классов. На некоторые биохимические показатели оказывают влияние даже смена сезона и климата.

Все эти и многие другие факторы необходимо учитывать при формулировке требований к забираемому образцу и при трактовке результатов анализов, т.к., по данным Американского общества патологов, до 70% всех ошибок анализов составляют ошибки внелабо-раторные, а до 7.5% лабораторных ошибок влекут за собой реальную опасность для пациента [216].

Результаты лабораторных исследований подвержены влиянию биологической и аналитической вариации. Если аналитическая вариация зависит от условий выполнения эксперимента, то общая биологическая вариация исследуемых веществ обусловлена внутриинди-видуальной (наблюдающейся у одного и того же человека под влиянием биологических ритмов) и межиндивидуальной (определяющейся эндогенными и экзогенными факторами, в т. ч. расой, полом, возрастом, циклом питания, социальной средой, профессиональными особенностями и др.) вариациями [218, 219].

Нормальные" физиологические величины, которыми, в основном, пользуются в лаборатории, включают общую биологическую вариацию без учета отдельных факторов, что снижает диагностическую ценность лабораторных тестов. Поэтому на смену понятию «нормальная величина» приходит концепция референтных величин. Это означает, что результаты лабораторного исследования сравнивают с референтными (эталонными) величинами, полученными в строго определенных условиях, с учетом отдельных факторов, влияющих на биологическую вариацию. Референтные величины установлены на сегодняшний день для ограниченного числа компонентов (около 150) [214].

Аналитическая вариация, зависящая от применяемого метода и условий выполнения теста, расширяет пределы нормальных величин и этим ограничивает диагностическую ценность лабораторного исследования. Стремление уменьшить аналитическую вариацию связано с дополнительными экономическими затратами, поэтому существенным является вопрос, до каких пределов целесообразно уменьшать аналитическую погрешность. Большинство авторов сходится на том, что целесообразно применять пределы Тонкса, т. е. допустимый предел ошибки (ДПО) не должен превышать 1/8 диапазона нормальных величин [214].

Внутрилабораторные ошибки (случайные и систематические) оцениваются с помощью целого ряда контрольных процедур, определенных требованиями лабораторной квали-метрии, введенными приказами Министерства Здравоохранения и методическими рекомендациями. Это применение контрольных материалов (сывороток), составление контрольных карт (например, карт Шухарта, Леви и Дженнингса или Вестгарда), периодичность метрологической поверки измерительных приборов, пипеток, мерной посуды, участие программах внешней оценки качества (межлабораторные тесты) и т. д. Однако при разработке новых методик, при использовании новых методов анализа исполнитель часто сталкивается с отсутствием стандартизованных контрольных материалов и с отсутствием других лабораторий, применяющих тот же метод, что исключает возможность проведения межлабораторных тестов. В связи с этим встает вопрос о дополнительных мерах по обеспечению внутрилабора-торного контроля качества.

Оценка случайной составляющей погрешности производится, согласно ГОСТ 8.1 090 «ГСИ. Методики выполнения измерений», по величине среднеквадратичного отклонения на рабочих пробах контролируемого материала, или с применением стандартных образцов. Для оценки систематической составляющей погрешности в отсутствии аттестованных смесей и референтных материалов в клинической лабораторной практике используются метод добавок, метод разбавления и метод смешения проб [210−215]. Для контроля сходимости и воспроизводимости в отсутствии готовых контрольных материалов применяется сливная сыворотка. Способ ее приготовления описан подробно в работе [214].

Применение метода хроматографии для проведения анализа имеет свою специфику с точки зрения метрологии [210]:

1- хроматографическому измерению должны предшествовать этапы идентификации и градуировки;

2 — само измерение является косвенным, т.к. измеряется непосредственно не число частиц того или иного вида, а некоторые физические параметры, пропорциональные массе;

3 — при хроматографическом анализе измеряется состав многокомпонентных систем, поэтому измерения состава осложняются эффектом взаимного влияния компонентов, что выражается в частичном наложении и перекрывании пиков нескольких компонентов.

В результате хроматографические измерения отягощены погрешностями, тем более значительными, чем сложнее состав анализируемой пробы. Отсюда вытекает принципиальная невозможность приготовления единого стандартного образца на заданный компонент безотносительно к остальному составу анализируемой пробы [210, 214]. Сложность доказательства правильности результатов хроматографического анализа и особенно его применения в клинической практике состоит еще и в том, что этот метод является более селективным, чем аттестованные методики, использующие другие методы определения. Поэтому часто уровни «нормы», получаемые при использовании ВЭЖХ, существенно отличаются от значений, получаемых другими методами. Существуют и серьезные трудности при заполнении контрольных карт по результатам хроматографического анализа, когда определяется несколько десятков компонентов и длительность анализа составляет более часа. В связи с этим вопрос метрологической аттестации и контроля качества при использовании метода хроматографии в клинической лабораторной практике требует дополнительного обсуждения в каждом конкретном случае.

ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАКТИВЫ ОБОРУДОВАНИЕ.

1. Микроколоночный жидостный хроматограф ХЖ-1311 (ОПП НТО АН СССР, г. Минск), имеющий в составе спектрофлуориметрический детектор, два шприцевых микронасоса, блок управления градиентом, Т-образный смеситель, кран — дозатор со сменной наружной петлей объемом 10 — 220 мкл, кран — дозатор с внутренней петлей объемом 1 мкл, фторопластовые колонки с внутренним диаметром 0.5 мм и длиной 200 — 300 мм, упакованные сорбентом Nucleosil-5-Ci8, самописец ЛКС, блок связи с ПЭВМ IBM PC,.

2. Детектор лазерный флуориметрический на основе He-Cd лазера (Институт Физики БРАН, г. Минск).

3. Насос микрошприцевой (НТО РАН).

4. Центрифуга настольная УПн-8УХЛ4−2 (г. Йошкар-Ола).

5. рН-метр рНМ85 («Радиометр», Копенгаген).

6. Насос вакуумный СНВР-5ДМ.

7. Морозильная камера «Минск» .

8. Весы аналитические АДВ-200М, 2кл.

9. Ультратермостат У-1 (ГДР).

10. Автоматические пипетки (Plastomed).

11. Микрошприцы МШ-10 (з-д «Газохром») и 100 мкл («Hamilton»).

12. Фильтры мембранные Millex — HV, 0.45 мкм, (Millipore).

13. Смеситель вибрационный для микропробирок (мастерские МАПО).

РЕАКТИВЫ.

1. Ацетонитрил ОСЧ, сорт 0 («Криохром», СПб).

2. Набор 20 белковых АК (Serva, Щвеция).

3. Набор 20 редких АК (Serva, Щвеция).

4. Серотонин креатинсульфат (Reanal, Венгрия).

5. Гистамин солянокислый (Fluka Chemie AG, Buchs, Швейцария).

6. Набор 20 ДНС-АК (Sigma, США).

7. Смесь физиологических АК для аминокислотного анализатора (Sigma, США).

8. Кинуреновая кислота (Sigma, США).

9. Ксантуреновая кислота (Sigma, США).

10. Гомованилиновая кислота (Sigma, США).

11. Ванилилминдальная кислота (Sigma, США).

12. 5-гидрокситриптофан (Sigma, США).

13. 5-гидроксииндолуксусная кислота (Sigma, США).

14. Норадреналин (Sigma, США).

15. Адреналин (Sigma, США).

16. Дофамин (Sigma, США).

17. N-ацетилсеротонин (Sigma, США).

18. Индолуксусная кислота (Sigma, США).

19. Индолмолочная кислота (Sigma, США).

20. Индолпировиноградная кислота (Sigma, США).

21. Дансилхлорид (Fluka Chemie AG, Buchs, Швейцария).

22. Ортафталевый диальдегид (Serva, Швеция).

23. Соляная кислота ОСЧ (Реахим, Россия).

24. Трихлоруксусная кислота Ч (раствор 7,5% для анализа глюкозы) (Реахим, Россия).

25. Хлорная кислота ЧДА (Реахим, Россия).

26. Серная кислота Ч (Реахим, Россия).

27. Муравьиная кислота ХЧ (Реахим, Россия).

28. Формиат натрия ОСЧ (Реахим, Россия).

29. Хлористый натрий ОСЧ (Реахим, Россия).

30. Едкий натр ЧДА (Lachema, Чехия).

31. Едкое кали ЧДА (Lachema, Чехия).

32. Карбонат лития Ч (Реахим, Россия).

33. Ацетат натрия ОСЧ (Реахим, Россия).

34. Углекислый калий ОСЧ (Реахим, Россия).

35. Калий железосинеродистый ОСЧ (Реахим, Россия).

36. Этанол ХЧ (для хроматографии) (Реахим, Россия).

37. Н-бутанол ЧДА (Реахим, Россия).

38. Бензол ЧДА (Реахим, Россия).

39. Метанол ЧДА (Реахим, Россия).

40. Ацетат аммония ЧДА (Реахим, Россия).

41. Бензальдегид ЧДА (Реахим, Россия).

42. Аммиак водный ЧДА (Реахим, Россия).

43. Петролейный эфир ЧДА (Реахим, Россия).

МЕТОДИКИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ЭКСПЕРИМЕНТА.

1. Забор исследуемого материала.

Забор крови производили из локтевой (по возможности) вены пациента утром, не ранее, чем через час после легкого завтрака, одноразовым шприцом.

Для получения сыворотки кровь переносили в центрифужную пробирку без консерванта, отстаивали 15 -г 20 мин до образования сгустка и центрифугировали 15 мин при 6000 об/мин.

Для получения плазмы кровь переносили в центрифужную пробирку с гепарином или трилоном Б, отстаивали 20 мин и центрифугировали 20 мин при 1500 -г- 2000 об/мин.

Для определения метаболитов Трп и Тир (кроме кинуреновой и ксантуреновой кислот) в моче использовали суточную мочу, собранную с 6 Н НС1 (10 мл/л) в качестве консерванта, хранившуюся во время сбора при 4° С.

Для определения АК, кинуреновой и ксантуреновой кислот мочу использовали суточную, собранную без консерванта, хранившуюся во время сбора при 4° С. ЦСЖ собирали в охлаждаемые сухим льдом пробирки.

Аликвоту плазмы, сыворотки крови, мочи, ЦСЖ отбирали автоматической пипеткой с одноразовым наконечником и переносили во фторопластовую пробирку (типа «Эпендорф»). Образцы физиологических жидкостей анализировали немедленно, или хранили в морозильной камере до 6 месяцев при -70° С, или до 2 недель при -20° С.

2. Приготовление растворов и калибровочных смесей.

В ходе проведения экспериментов готовили следующие растворы:

— хлорной кислоты — 2.4 Н, 0.4 Н, 0.25 Н, 0.025 Нсерной кислоты — 0.1 Н — разведением концентрированных кислот;

— соляной кислоты — 0.1 Н — из фиксанала;

— трихлоруксусной кислоты — 2.5% - разведением готового раствора;

— буферные растворы формиата натрия, ацетата натрия, карбоната лития — растворением точной навески и доведением рН до необходимой величины соответствующей кислотой или щелочью. При использовании буферных растворов в составе элюентов для лазерного флуо-риметрического детектирования их очищали от примесей, пропуская через патрон с сорбентом БПаБогЬ С18,10 мкм;

— растворы ДНС-хлорида, ДФЭД в ацетонитриле, ОФДА в 85% водном ацетонитриле — растворением точной навески;

Калибровочные смеси АК, метаболитов тирозина, триптофана гистамина готовили согласно пункту 1.5 ГОСТ 8.505−84 (типовая методика приготовления смесей, применяемых для метрологической аттестации и контроля точности методик выполнения хроматографиче-ских измерений в случае отсутствия государственных стандартных образцов).

Для определения АК готовили эквимолярные калибровочные смеси с концентрациями 10,20, 30, 40, 50 пмоль/мкл в 0.1 Н НС1.

Для определения метаболитов Тир и Трп готовили калибровочные смеси с концентрациями 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50 нг/мл — для метаболитов Трп и концентрациями 0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0, 30.0 мкг/мл — для метаболитов Тир в 0.025 Н хлорной кислоте.

Для определения кинуреновой и ксантуреновой кислот готовили их калибровочные растворы с концентрациями 1.0, 3.0, 5.0, 8.0,10.0 мкг/мл в 0.2 М формиате натрия с рН 5.7.

Для определения катехоламинов готовили калибровочные смеси с концентрациями 10,20, 30,40, 50 пг/мл в 0.025 Н хлорной кислоте. Сразу после приготовления калибровочные смеси разливали в одноразовые фторопластовые пробирки (аликвоты по 100 мкл) и хранили их до использования в морозильной камере при — 20° С в течении 1 месяца или в термосе с жидким азотом до 6 месяцев.

Для определения гистамина готовили калибровочные растворы с концентрациями 0.1,0.5, 1.0,5.0,10.0 нг/мл в 0.1 ННС1.

3. Идентификация компонентов.

Идентификацию компонентов смеси при хроматографическом разделении проводили согласно их временам удерживания. В случае сложности при идентификации компонента в анализируемом образце проводили повторное хроматографическое разделение компонентов с добавлением аликвоты раствора индивидуального стандарта или аликвоты полной калибровочной смеси.

4. Построение калибровочных зависимостей.

Построение калибровочных зависимостей производили по методу абсолютной калибровки с учетом процедуры пробоподготовки. Для определения случайной составляющей погрешности проводили обработку калибровочной смеси и ее хроматографическое разделение по соответствующей методике не менее 5 раз. Определяли средние значения площадей и высот пиков и среднеквадратичные отклонения (СКО), соответствующие определяемым компонентам, по формулам [210−213]: х = (7) п.

Б =.

V п — 1 (8) где: Х| - величина отдельного результата, х — среднее значение, п — число результатов, 8 -среднеквадратичное отклонение.

Для определения влияния матрицы проводили определение коэффициента извлечения с помощью метода добавок. К аликвоте физиологической жидкости (сыворотки, плазмы крови, мочи, ЦСЖ) добавляли калибровочные смеси стандартов 5 определенных концентраций и проводили обработку проб с добавленными калибровочными смесями и без них по соответствующим методикам. Определяли коэффициент извлечения и строили калибровочные графики для каждого компонента. По графикам определяли диапазоны линейности и коэффициенты пропорциональности, с учетом которых в дальнейшем проводили расчет концентраций определяемых компонентов в физиологической жидкости. Все процедуры статистической обработки результатов проводили с использованием пакета программ «Statgraphics» .

2И].

5. Обеспечение внутрилабораторного контроля качества.

В связи с отсутствием аттестованных смесей стандартов и контрольных материалов для исследуемых соединений и невозможностью проведения межлабораторного контроля для внутрилабораторного контроля качества использовались слитые сыворотки и метод смешивания проб [214].

Слитые сыворотки готовили следующим образом: остатки исследованных в лаборатории сывороток, за исключением сывороток больных заразными болезнями, гемолизиро-ванных, желтушных, липемических, собирали в сосуд объемом 100 мл, тщательно перемешивали, фильтровали через стерильный бактериологический фильтр и разливали в одноразовые пробирки аликвотами по 20, 50, 100, 200 мкл. Пробирки замораживали и хранили при температуре — 20° С или — 70° С до использования. Аналогичным образом готовили контрольные материалы других физиологических жидкостей. Такие контрольные материалы применялись в лаборатории для контроля сходимости и воспроизводимости исследований [214].

Определение содержания компонентов в сыворотке (или другой физиологической жидкости), приготовленной таким образом, проводили одновременно с построением калибровочных зависимостей и определением коэффициентов извлечения, повторяя определение не менее 5 раз для каждого образца. В дальнейшем еженедельно проводили контрольные определения и на основании полученных данных заполняли контрольные карты установленного образца.

Ежедневно проводили проверку прибора по калибровочным смесям стандартов, а для анализа гистамина — 2 раза в день, в начале и в конце рабочего дня.

Повторную калибровку во всем диапазоне определяемых концентраций проводили при замене источника излучения детектора, после длительного перерыва в работе на данном приборе, или в случае отклонения результатов анализа контрольной сыворотки более, чем на 10%.

Для внутрилабораторного контроля качества использовали «метод смешивания проб» [214], согласно которому исследованные пробы двух пациентов смешивали в соотношениях 1: 1- 1: 2- 1: 3 и выдавали сотруднику в качестве неизвестных проб для анализа. Определенные значения концентраций компонентов в полученных образцах сравнивали с расчетными. Если СКО превышало 10%, то проводили анализ всего хода работы с целью исключения систематической ошибки.

В случае, если результат анализа позволял предположить наличие генетической патологии или онкологического заболевания, проводился повторный забор проб и их обработка с целью исключения внелабораторной ошибки. В случае повторения результата пациенту назначались дополнительные исследования или нагрузочные пробы.

ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ В ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ.

ЖИДКОСТЯХ.

В современной литературе описано большое количество методик определения АК. Но при детальном рассмотрении выясняется, что практически все они посвящены определению АК белковых гидролизатов, т. е. разделению смеси из 18−20 АК. Единичные работы посвящены определению АК физиологических жидкостей (23 — 25 АК), а для определения АК при генетических патологиях (35 -50 АК) используются автоматические аминокислотные анализаторы, длительность анализа на которых, с учетом регенерации колонки, составляет 4 — 6 часов.

Количество дериватизирующих реагентов, пригодных для определения АК физиологических жидкостей, также заметно сокращается. Так, например, популярный в определении АК белковых гидролизатов ОФДА неприменим при анализе физиологических жидкостей, т.к. не вступает в реакцию с вторичными аминами, и, следовательно, не детектирует пролин и ОН-пролин. Низка и чувствительность детектирования с помощью ОФДА цистеин-содержащих соединений. В анализе физиологических жидкостей наиболее целесообразно применение ДНС-С1 в качестве реагента для предколоночной дериватизации. И хотя процедура получения ДНС-производных в применении к АК белковых гидролизатов подробно изучена, использование его в анализе физиологических жидкостей при генетических патологиях требует проведения более подробных исследований. Это связано, во-первых, с присутствием в анализируемом образце не только АК, но некоторых дии трипептидов, условия проведения реакции для которых не совпадают с условиями для АК. Во вторых — с возможностью гипераминоацидемии или генерализованной гипераминоацидурии, когда концентрации одной или всех АК повышаются в 5 -е- 50 раз. Это может привести к недостаточному молярному избытку реагента, и в результате — не только к неполному образованию ДНСпроизводных, но и к образованию моно-дансильных производных вместо ди-дансильных у таких АК, как лизин, гистидин, орнитин, аргинин, цитруллин, тирозин. Это затрудняет идентификацию компонентов в физиологических жидкостях и препятствует диагностике. Литературные данные, касающиеся времени и температуры реакции, крайне разноречивы. В связи с этим были проведены исследования зависимости выхода ДНС-АК от длительности реакции и температуры.

112 ВЫВОДЫ.

1. Разработана методика определения свободных АК в физиологических жидкостях (плазме сыворотке крови, моче, ЦСЖ), позволяющая идентифицировать и количественно определять 38 АК и дипептидов в виде ДНС-производных методом микроколоночной обращенно-фазовой хроматографии с флуориметрическим детектированием. Разработанная методика не имеет аналогов по совокупности параметров: аналитической чувствительности (для проведения анализа необходимо 10 мкл сыворотки крови или 100 мкл ЦСЖ), продолжительности полного анализа (для определения 38 компонентов смеси необходимо 70 мин с учетом регенерации колонки), при низком расходе элюента — 350 мкл на 1 анализ.

2. Разработана методика определения 12 метаболитов Трп (индольного цикла) и Тир, позволяющая проводить анализ проб объемом 200 мкл сыворотки крови или ЦСЖ, или 10 мкл мочи.

3. Разработана методика хроматографического определения кинуреновой и ксантуреновой кислот методом микроколоночной обращенно-фазовой хроматографии в пробе физиологической жидкости объемом 10 мкл.

4. Разработана методика определения катехоламинов плазмы крови в виде ДФЭДпроизводных методом микроколоночной обращенно-фазовой хроматографии с лазерным флуориметрическим детектированием, позволяющая определять их без предварительного концентрирования с пределом обнаружения 0.2 пг при объеме пробы 200 мкл.

5. Разработана методика определения гистамина в пробе сыворотки крови объемом 200 мкл в виде ОФТпроизводного методом микроколоночной обращенно-фазовой хроматографии с пределом обнаружения 0.01 нг/мл.

Все разработанные методики применяются в Научно-исследовательском центре и на кафедре медицинской генетики МАПО, в Клинике нервных болезней ВМА, Центре «Мозг и иммунитет» для проведения научных исследований и серийных анализов для клинической лабораторной диагностики.

С помощью разработанных методик обследованы более 1000 больных с такими патологиями нервной системы, как рассеяный склероз, боковой амиотрофический склероз, эпилепсия, детский церебральный паралич, отставание в умственном, речевом, физическом развитии и многие другие.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Таким образом, был разработан комплекс хроматографических методик для определения АК и их моноаминовых метаболитов (более 50 биологически активных соединений) в физиологических жидкостях методом микроколоночной обращенно-фазовой ВЭЖХ с флуо-риметрическим детектированием, позволяющий проводить диагностику нескольких десятков первичных и вторичных энзимопатий, для чего требуется 550 мкл плазмы или сыворотки крови.

Разработанные методики отличаются низким пределом обнаружения, сравнительно малой продолжительностью хроматографического разделения, простотой пробоподготовки.

Применение микроколоночной ВЭЖХ для анализа физиологических жидкостей не только дало возможность использовать микролитровые количества образцов, но и снизить расход элюентов и реагентов. Так, для определения АК, метаболитов Тир и Трп, гистамина и Ка необходимо, соответственно, 350, 500, 300 и 600 мкл элюента, что важно при проведении серийных анализов в клинической лаборатории.

Пригодность разработанных методик к применению в клинических исследованиях была продемонстрирована при использовании в течении ряда лет в Научно-исследовательском Центре и на Кафедре медицинской генетики Медицинской Академии последипломного образования, в Клинике нервных болезней Военно-Медицинской академии, Центре «Мозг и иммунитет», при проведении серийных анализов для отделений патологии новорожденных и детской неврологии и реанимации различных клиник г. Санкт-Петербурга. Методика определения АК, применяемая для диагностики, подбора терапии и контроля хода лечения, легла в основу патентуемого метода лечения аминокислотами при детских неврологических патологиях и патологиях развития.

С помощью перечисленных выше методик были исследованы биохимические показатели крови, мочи, ЦСЖ при таких патологиях нервной системы, как рассеяный склероз, боковой амиотрофический склероз, эпилепсия, детский церебральный паралич, наследственная ксантуренурия, заболевания желудочно-кишечного тракта различного генеза, при выяснении причин задержки умственного, речевого, физического развития детей, и др.