Актуальность исследования.
Герпесвирусные инфекции занимают одно из первых мест среди хронических инфекций человека по: распространенности, сложности диагностики и лечения. Клинические симптомы этих инфекций перекрываются с множеством других заболеваний, поэтому, большое значение имеет разработка диагностических систем, позволяющих дифференцировать инфекционный агент. Сложность иммунодиагностики этих вирусов обусловлена значительным серологическим сходством не только внутри семейства, но и с другими вирусами (например ВИЧ) (Root-Bernstein, 2005).
Цитомегаловирус вызывает различные формы инфекции — субклиническую, хроническую и острую. Цитомегаловирусная инфекция может вызывать, как системные заболевания (мононуклеоз, генерализованная цитомегалия), так и поражение отдельных органов (печень, легкие, головной мозг, сердце, мочеполовые органы и др.).
Многочисленные исследования ряда авторов показали возможность передачи вируса «по вертикали», т. е. трансплацентарное проникновение ЦМВ в плод (внутриутробная инфекция), приводящее к формированию тяжелых пороков развития. Внутриутробная инфекция ЦМВ поражает 0,5 — 5% всех новорожденных (Schopfer К, 1978). Частота передачи вируса плоду, при первичной инфекции, во время беременности составляет 15 -50%. В настоящее время установлено, что одной из главных причин врожденных уродств и поздних выкидышей является вирусоносительство или цитомегаловирусная инфекция у беременных женщин, как клинически выраженная, так и скрытопротекаемая (Pass RF, 1999).
Известно, что антитела к цитомегаловирусу появляются значительно раньше клинических проявлений болезней ассоциированных с цитомегаловирусной инфекцией.
Концентрация антител коррелирует с тяжестью протекания заболевания. До проведения нашего исследования, для выявления антител к ЦМВ в крови пациентов, в России использовался твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) на основе нативных антигенов ЦМВ. Анализ состояния проблем в области разработок способов выявления антител к ЦМВ в сыворотках больных показал, что актуальным и принципиально важным является выбор и поиск высокоспецифичных антигенов ЦМВ, в том числе полученных генно-ииженерным способом. Именно этой проблеме и посвящена настоящая работа, в которой предполагалось оценить пригодность рекомбинантных антигенов, содержащих аминокислотные последовательности иммунодоминантных областей белков ЦМВ для создания высокоэффективных тест-систем диагностики ЦМВ — инфекции.
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы являлось получение и сравнительное исследование первичных структур и антигенных свойств некоторых рекомбинантных и нативных белков цитомегаловируса человека для последующей разработки способов диагностики цитомегаловирусной инфекции, основанных на ИФА, ПЦР и методе прямого иммунофлуоресцентного анализа.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
• На основе компьютерного анализа аминокислотных последовательностей белков р52, рр65 и рр150 цитомегаловируса человека выявить в их структуре гипотетические антигенные детерминанты;
• Получить методом ПЦР последовательности ДНК, кодирующие иммунодоминантные фрагменты вирусных белков р52, рр65 и рр150;
• Сконструировать штаммы E. coli, обеспечивающие стабильную экспрессию рекомбинантных белков гр52, грр65 и грр150, содержащих в своем составе аминокислотные последовательности иммунодоминантных областей антигенов р52, рр65 и рр150 ЦМВ соответственно;
• Изучить антигенные свойства полученных рекомбинантных белков методом ИФА и оценить их пригодность для серодиагностики цитомегаловирусных инфекций;
• Осуществить выбор и тестирование олигонуклеотидов-праймеров для специфического выявления ДНК ЦМВ в клинических образцах с помощью ПЦР и оптимизировать условия реакции;
• Получить меченые моноспецифические сыворотки к рекомбинантным белкам грр65 и грр150 и изучить возможность их использования для выявления антигенов ЦМВ.
Научная новизна.
В настоящей работе проведена комплексная оценка иммунодоминантных районов структурных белков рр150, р52 и рр65 цитомегаловируса человека. С помощью компьютерного анализа в выбранных иммунодоминантных районах белков-антигенов выявлены потенциальные антигенные детерминанты, являющиеся специфичными для ЦМВ и перспективными для использования в виде рекомбинантных аналогов в серодиагностике ЦМВ — инфекций.
Сконструирован бактериальный экспрессирующий вектор, кодирующий последовательность из шести гистидипов на С-копце целевого рекомбипаптпого белка, которая является мишенью для аффинной очистки на металлохелатных сорбентах.
Продемонстрирована перспективность использования полученных в данной работе рекомбинантных белков гр52, грр65 и грр150 в качестве специфических антигенов для выявления антител к цитомегаловирусу человека методом ИФА.
Показано, что меченые моноспецифические кроличьи аптисыворотки, полученные к рекомбинантным белкам грр150 и грр65, позволяют с помощью иммунофлуоресцентного анализа диагностировать острую стадию ЦМВ инфекции.
Олигонуклеотидпые праймеры, подобранные к участку гена UL55, кодирующему N-концевой район гликопротеина В ЦМВ, пригодны для специфического выявления геномных ДНК различных штаммов и клинических изолятов цитомегаловируса человека методом ПЦР.
Практическая ценность работы.
В настоящее время в диагностике латентных вирусных инфекций в России главное место принадлежит иммуноферментиому анализу (ИФА), ввиду его общедоступности. Следует отметить, что сертифицировано лишь ограниченное количество отечественных ИФА тест-систем для выявления антител к цитомегаловирусу, а импортные тест-системы имеют очень высокую стоимость. Поэтому практическая ценность данного исследования заключается, прежде всего, в получении рекомбинантных антигенов, пригодных для разработки на их основе более дешевых отечественных диагностических систем, не уступающих импортным аналогам.
Сконструированные в данной работе рекомбинантные антигены в настоящее время используются такими отечественными производителями диагностических наборов, как ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), ЗАО «Медико-биологический союз» (Новосибирск) и ЗАО «Имди» (Новосибирск) (Суслопаров МА, 2000; Суслопаров ИМ, 2005; Ивченко СН, 2005). Разработана, сконструирована и утверждена в ГИСК им. J1.A. Тарасевича стандартная панель сывороток для определения антител класса G к цитомегаловирусу человека (Ивченко СН, 2004).
Олигонуклеотидые праймеры, подобранные к участку гена UL55, кодирующему N-концевой район гликопротеина В ЦМВ, могут быть использованы для создания диагностических ПЦР тест-систем, а также для типирования изолятов цитомегаловируса по генотипам gB.
Положения, выносимые на защиту.
1. Плазмидная конструкция, включающая фрагмент гена UL32 ЦМВ, обеспечивает биосинтез в клетках Е. coli рекомбинантного белка грр150, содержащего иммунодоминантную область главного матричного фосфопротеина рр150 ЦМВ.
2. Плазмидная конструкция, включающая фрагмент гена UL44 ЦМВ, обеспечивает биосинтез в клетках Е. coli рекомбинантного белка гр52, содержащего иммунодоминантную область ДНК-связывающего белка р52 ЦМВ.
3. Плазмидная конструкция, включающая фрагмент гена UL83 ЦМВ, обеспечивает биосинтез в клетках Е. coli рекомбинантного белка грр65, содержащего иммунодоминантную область тегументного фосфопротеина рр65 ЦМВ.
4. Использование рекомбинантных белков гр52, грр65 и грр150 в ИФА позволяет выявлять антитела, специфичные к цитомегаловирусу человека.
5. Флуоресцентные антисыворотки к рекомбинантным белкам грр65 и rppl 50 позволяют детектировать цитомегаловирус в клинических образцах с помощью иммунофлуоресцентпого анализа in situ.
6. Олигонуклеотидные праймеры к гену UL55, используемые в системе ПЦР, позволяют обнаруживать геномные ДНК различных штаммов и клинических изолятов цитомегаловируса человека.
Конкретное участие автора в получении результатов.
Автор принимал личное участие в проведении всех экспериментальных и теоретических исследований, приведенных в диссертации. Кроме того, автор участвовал в совместных работах по иммуноферментному анализу сывороток пациентов с сотрудниками других институтов и производственных фирм.
Апробация работы и публикации.
Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях и симпозиумах:
1. Sousloparov I. М., Sousloparov М. A., Plyasunov I. V., Blinov V. М. «PCR-mediated cloning and sequensing of UL44-gene's fragment encoding the immunedominant region of the pp52 human cytomegalovirus», Abstract, The 22nd International Herpesvirus Workshop, Program & Abstracts, August, 1997, La Jolla, California.
2. Sousloparov M. A., Sousloparov I. M., Plyasunov I. V., Blinov V. M. «Elaboration and receipt of recombinant antigens of the human cytomegalovirus», Abstract, The 22nd International Herpesvirus Workshop, Program & Abstracts, August, 1997, La Jolla, California.
3. Юбилейная конференция, посвященная 30-летию журнала «Молекулярная биология» ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСА ЧЕЛОВЕКА (HCMV). 17−19 декабря 1997 г., Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН, Москва.
4. Advanced Research Workshop «Assessment of Sponsored Biological Research in Russia for the New Millennium», September 2−4,1999, Posters:
• M. A. Sousloparov, I. M. Sousloparov, N. M. Makhova, M. M. Bakhtina, L. E. Slaykovskaya, P. M. Larionov, M. Karaskov, E. E. Litasova «Investigation of herpesviruses role in pathogenesis of atherosclerosis at ischemic disease of heart».
• M. A. Sousloparov, I. M. Sousloparov, M. M. Bakhtina, I. V. Plyasunov, N. M. Makhova «Development the recombinant antigenes and PCRdiagnostics of human herpesviruses».
5. Суслопаров M.A., Суслопаров И. М. «Генетические маркеры герпесвирусов человека». Российская научно-практическая конференция «Генодиагностика инфекционных болезней», Новосибирская обл., санаторий «Сосновка», 25−27 октября 2005 г.
По материалам исследований опубликовано 6 статей в реферируемых научных журналах:
1. Суслопаров МА, Суслопаров ИМ, Плясунов ИВ, Бахтина ММ, Сафропов ПФ, Гришаев МП, Блинов ВМ, Иванькина ТЮ. Получение рекомбинантного антигена белка р52 цитомегаловируса человека (HCMV). Мол генетика микробиол и вирусол 2000; 4: 24−29.
2. Суслопаров ИМ, Суслопаров МА, Махова НМ, Загоруйко ТЮ, Носкова НВ. Выявление ДНК цитомегаловируса человека (Human cytomegalovirus) с помощью ПЦР. Биотехнология 2004; 6: 76−82.
3. Ивченко СН, Суслопаров ИМ, Масычева ВИ, Суслопаров МА, Мезенцев АН. Конструирование жидкой панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса IgG к цитомегаловирусу человека. Вестник Российской академии медицинских наук 2004; 8: 37−39.
4. Суслопаров ИМ, Суслопаров МА, Ивченко СН, Гришаев МП, Смердова МА, Косова ЕЮ, Блинов ВМ, Сараев ДВ, Махова НМ, Носкова НВ. Конструирование рекомбинантного антигена рр65 цитомегаловируса человека и исследование его иммунохимических свойств. Мол генетика микробиол и вирусол 2005; 2: 28−32.
5. Суслопаров МА, Суслопаров ИМ, Махова НМ, Омигов ВВ, Литасова ЕЕ, Леган MB, Слайковская ЛЕ, Мироненко СП, Чернявский AM, Лукьянчикова НЛ. Исследование маркеров герпесвирусных инфекций при ишемической болезни сердца (ИБС). Мол генетика микробиол и вирусол 2005; 4: 36−40.
6. Ивченко СН, Суслопаров ИМ, Масычева ВИ, Суслопаров МА, Лосев MB. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антител в сыворотке крови к цитомегаловирусу человека. Сибирский медицинский журнал 2005; 2(20): 53−55.
Получено 3 патента Российской Федерации:
1. Суслопаров MA, Суслопаров ИМ, Плясунов ИВ. Фрагмент гена UL44 цитомегаловируса человека, кодирующий иммунодомипантную часть ДНК-связывающего белка р52(1СР36), и рекомбинантная плазмидная ДНК pUL44HCMV, обеспечивающая экспрессию фрагмента гена UL44 цитомегаловируса человека в клетках бактерий Escherichia coli. Патент РФ № 2 151 800, БИ № 18,27.06.2000.
2. Суслопаров МА, Суслопаров ИМ. Рекомбинантная плазмидная ДНК pUL83HCMV, обеспечивающая экспрессию в клетках бактерий E. coli рекомбинантного белка, содержащего иммунодоминантную часть фосфопротеина рр65 HCMV и фрагмент бета-галактозидазы. Патент РФ№ 2 218 408, БИ № 34, 10.12.2003.
3. Суслопаров МА, Суслопаров ИМ, Махова НМ, Плясунов ИВ, Бахтина ММ. Синтетические олигонуклеотиды — праймеры, используемые для выявления ДНК цитомегаловируса человека. Патент PONs 2 164 945, БИ№ 10, 10.04.2001.
Работа выполнялась в 1995;2005 г. г. в рамках ряда научно-исследовательских и научно-технических программ ГНЦ ВБ «Вектор». Все экспериментальные работы проводились в рамках научно-исследовательских проектов, утвержденных Этическим комитетом ГНЦ ВБ «Вектор» (IRB 1 360):
1) «Разработка рекомбинантных антигенов и генетических маркеров для диагностики герпесвирусов» (утвержден 03.06.2003),.
2) «Клинико-диагностические особенности течения генитальиой герпетической инфекции в Новосибирске» (утвержден 19.03.2003).
На разных этапах выполнения работы в ней принимали участие сотрудники ГНЦ ВБ «Вектор»: М. А. Суслопаров, С. Н. Ивченко, Н. М. Махова, И. В. Плясунов, М. М. Бахтина, П. Ф. Сафронов, В. М. Блинов. А. А Гуськов и другие, а также врач дерматовенеролог МСЧ 168 Т. Ю Загоруйко. В работе также принимали участие сотрудники производственных фирм: ЗАО «Вектор-Бест" — М. П. Гришаев, М. А. Смердова, Е. Ю. Косова, ЗАО «Медикобиологический союз" — О. Н. Надточий, ЗАО «Имди" — В. Г. Майданюк. Сотрудники НИИ патологии кровообращения им. Академика E.H. Мешалкина: Литасова Е. Е., Леган М. В., Слайковская Л. Е., Мироненко С. П., Чернявский A.M., Лукьянчикова Н. Л. Всем, принимавшим участие в данной работе, автор выражает искреннюю признательность. Автор благодарит всех своих коллег, принимавших участие в работе.
Структура и объем диссертации
.
Диссертация изложена на 134 страницах, содержит 12 таблиц и 42 рисунка. Состоит из введения, обзора литературы, глав «материалы и методы» и «результаты и обсуждение», «заключение», выводов, списка литературы, приложений.
Список литературы
включает в себя 208 источников, из них 185 иностранных.
Выводы.
1. Сконструирован плазмидный вектор, включающий фрагмент гена UL32 ЦМВ, и показано, что он обеспечивает биосинтез в клетках Е. coli рекомбинантного белка грр150, содержащего иммуподоминантную область главного матричного фосфопротеина рр150 ЦМВ.
2. Сконструирован плазмидный вектор, включающий фрагмент гена UL44 ЦМВ, и показано, что он обеспечивает биосинтез в клетках Е. coli рекомбинантного белка гр52, содержащего иммунодоминантную область ДНК-связывающего белка р52 ЦМВ.
3. Сконструирован плазмидный вектор, включающий фрагмент гена UL83 ЦМВ, и показано, что он обеспечивает биосинтез в клетках Е. coli рекомбинантного белка грр65, содержащего иммунодоминантную область фосфопротеина рр65 тегумента ЦМВ.
4. Получены рекомбинантные полипептиды гр52, грр65 и грр150 и показано, что они могут быть использованы для иммуноферментного выявления в исследуемых сыворотках крови антител, специфичных к цитомегаловирусу человека.
5. Получены флуоресцентные моноспецифические кроличьи аитисыворотки к рекомбинантным белкам грр65 и rppl 50 и показана возможность их использования для диагностики ЦМВ инфекции с помощью иммунофлуоресцентного анализа in situ.
6. Олигопуклеотидные праймеры, подобранные к участку гена UL55, кодирующему N-концевой район гликопротеина В ЦМВ, позволяют выявлять геномную ДНК цитомегаловируса человека методом ПЦР.
Заключение
.
В России последнее десятилетие наблюдается рост числа заболеваний вызывающих иммунодефицит. В связи с этим увеличивается необходимость качественной и удобной диагностики оппортунистических инфекций связанных с иммунодефицитом. Такая диагностика полезна для улучшения качества современного акушерства где есть необходимость в уменьшении числа мертворожденных детей и врожденных патологий плода одной из причин которых, является инфекция ЦМВ. Иммунофермептная диагностика становится востребованной в области трансплантологии, в связи с ростом количества трансплантаций в современных клиииках. Поэтому диагностика цитомегаловирусной инфекции становится все актуальнее.
В ходе получения новых знаний о цитомегаловирусной инфекции и появления более тонких и точных методов, диагностика последнее десятилетие тоже активно эволюционировала. Стало ясно, что использование для ИФА анализа нативных антигенов приводит к неоднозначности, и потому должно быть заменено или дополнено более специфичными антигенами. Получение таких антигенов на основе рекомбинантных технологий приобретает все большую популярность среди исследователей. Серологическая диагностика не может являться достаточным критерием оценки инфекционного процесса, и потому, ИФА анализ необходимо дополнить другими прямыми методами выявления патогена и его форм в организме, такими как ПЦР-анализ и другими прямыми методами обнаружения антигенов вируса.
В результате проделанной работы, на основе анализа литературы, был осуществлен выбор белков ЦМВ, видоспецифичных и обладающих выраженными антигенными свойствами для создания на их основе рекомбинантных антигенов. Проведен анализ антигенной структуры этих белков и выбраны участки генов, кодирующие их антигенные детерминанты. Проведено клонирование и получение штаммов-продуцентов Е. СоИ рекомбинантных антигенов ЦМВ. С помощью ИФА, используя референс панели сывороток и образцы от больных с разными формами заболевания, были изучены антигенные свойства полученных рекомбинантных белков. Показано, что созданная комбинация антигенов способна выявлять ЦМВ специфические IgG и IgM в сыворотках крови пациентов с уровнем чувствительности и специфичности 95−99%. Разработан метод иммунофлуоресцентного анализа in situ диагностики острой стадии ЦМВ инфекции с помощью меченных флуоресцентных антисывороток к рекомбинантным антигенам ppl 50 и рр65. Разработаны олигонуклеотиды-праймеры для ПЦР диагностики геномной ДНК цитомегаловируса.
