Возрастные особенности энзиматического барьера тонкой кишки при экстремальных воздействиях

Актуальность проблемы. В тонкой кишке существуют многочисленные и взаимосвязанные системы защиты организма от поступления во внутреннюю среду чужеродных веществ, особенно белковой природы. Энзиматический барьер тонкой кишки представлен ферментными системами, осуществляющими последовательную деполимеризацию пищевых полии олигомеров до мономеров, способных к утилизации. Он состоит. из ряда пространственно разделенных барьеров, образованных ферментами полости тонкой кишки, пристеночно^ слизи, гликокаликса, а также энтероцитов — мембранными, внутриклеточными и лизосомальными. В лаборатории физиологии питания Института физиологии им. И. П. Павлова РАН под руководством академика A.M. Уголева впервые было осуществлено препаративное разделение стенки тонкой кишки у белых крыс линии Вистар на три слоя: эпителиальный, стромальный и мышечно-серозный, что было документировано морфологически. В этих слоях были выявлены три группы ферментов, активность которых максимальна в эпителиальном (мембранные ферменты), в стромальном (глицил-1-лейциндипептидаза), и в мышечно-серозном слое (глицилглициндйпептидаза). Это привело' к обнаружению неизвестных ранее фундаментальных характеристик тонкой кишки как структуры, реализующей не только пищеварительно-транспортные (что было известно ранее), но и барьерные функции. На основании данных о распределении пищеварительных ферментов между слоями тонкой кишки A.M. Уголевым была выдвинута гипотеза о существовании наряду с эпителиальным ферментным барьером субэпителиального энзиматического барьера, осуществляемого за счет ферментов субэпителиальных слоев и повышающего надежность трансформационной системы тонкой кишки (Громова и др., 1991 (б) — Уголев и др., 1992 (а) — Тимофеева, 1993; Тимофеева и др., 1996 (б) — Иезуитова, Тимофеева, 1996; 1999 и др.).

С возрастом существенно меняются структурно-функциональные ¦ -,. 7 характеристики тонкой кишки (Адапт.-комп. процессы, 1991). Доказано влияние различных стрессорных факторов на активность ферментов эпителиального слоя (Уголев, 1963, 1967, 1985, 1991; Уголев и др., 1992 (а) — Тимофеева, 1995 (а) — Koldovsky, 1969; Henning, 1981; 1987). Известно, что пищеварительные ферментные системы способны к значительным перестройкам при изменении условий функционирования (голодание, иммобилизация, высокая и низкая температура и др.) (Егорова и др., 1992; Ватаева и др., 1994; Никитина и др., 1994; Тимофеева, и др., 1994; Малышев, Манухина, 1998; Кассиль и др., 2000; Timofeeva et al., 1993). Ранее было показано участие ферментов постэпителиальных., слоев, особенно пептидазного пула, в ответной реакции на то или иное экстремальное воздействие (оперативные вмешательства на тонкой кишке, голодание, нитратная интоксикация) (Иезуитова и др., 1993; Тимофеева, 1995 (а) — 1996). Было продемонстрировано, что совершенное и надежное выполнение барьерных функций структурами тонкой кишки выполняется благодаря взаимодействию ферментных систем ее эпителиального и субэпителиальных слоев. Однако возрастные особенности ферментных систем субэпителиальных слоев тонкой кишки, также как и их функциональная роль при различных воздействиях (иммобилизация, белковое голодание) у животных разных возрастных групп не изучались. Изучение функций субэпителиального энзиматического барьера у животных разного возраста может быть полезным при рассмотрении многих форм патологии желудочно-кишечного тракта, при которых часто нарушается проницаемость мембран щеточной каймы энтероцитов. Постэпителиальный энзиматический барьер способен выполнять в этих условиях защитную роль за счет повышения активности ферментов пептидазного пула, способных гидролизовать нерасщепленные пептиды, предотвращая их поступление в кровеносную систему вследствие снижения мембранного гидролиза белков.

Цель и задачи исследования

Целью работы было изучение возрастных особенностей ферментных систем субэпителиального барьера тонкой кишки и их участиев адаптивных рёакциях на различные стрессорные воздействия (иммобилизацию и белковую депривацию>).

Были поставлены следующие задачи:

1. Выявить различия в уровне активности аминопептидазы М и глицил-Ьлейциндипептидазы в эпителиальном, стромальном и мышечно-серозном слоях тощей и подвздошной кишки у молодых, зрелых и старых животных.

2. Сопоставить изменения активности ферментов пептидгид-ролазного пула в эпителиальном и субэпителиальных слоях тощей и подвздошной кишки спустя 24 и 72 часа после иммобилизационного стресса у животных трех возрастных групп (молодые, зрелые, старые).

3. Изучить влияние белковой депривации молодых, зрелых и старых крыс на активность пептидгидролаз (аминопептидазы М и глицил-1-лейциндипептидазы) эпителиального и субэпителиальных слоев тощей и подвздошной кишки.

Научная новизна. 1. Впервые обнаружены различия в уровне активности ферментов пептидгидролазного пула на примере аминопептидазы М и глицил-1-лейциндипептидазы в субэпителиальных слоях тощей и подвздошной кишки у крыс разного возраста (молодые, зрелые, старые). Наиболее высокая активность ферментов отмечена в слоях тощей и подвздошной кишки у молодых крыс по сравнению со зрелыми и старыми животными, что, по-видимому, важно для увеличения мощности энзиматического барьера тонкой кишки у молодых неполовозрелых животных, у которых еще не завершено формирование структурных элементов тонкой кишки.

2. Впервые обнаружены изменения активности ферментов пептидгидролазного пула не только эпителиального, что было ранее известно, но также стромального и мышечно-серозного слоев тонкой кишки на стрессорное воздействие (иммобилизация в течение 3 ч). Такие реакции ферментных систем слоев тонкой кишки позволяют судить об участии субэпителиальных слоев в реализации адаптивных возможностей организма.

•. — «•/. .

3. К белковой депривации оказались наиболее устойчивыми ферментные системы молодых и зрелых животных. У старых крыс в условиях белкового голодания резко увеличивалась активность ферментов пептидгидролазного пула в слоях тонкой кишки, что, по-видимому, является способом защиты организма от проникновения чужеродных белков, которые могут привести к патологическим последствиям.

Таким образом, нами получены новые данные, расширяющие представление об энзиматическом барьере не только эпителиального, но и субэпителиальных (стромального и мышечно-серозного) слоев тонкой кишки. Показана различная чувствительность ферментных систем V пептидгидролазного пула в слоях (особенно субэпителиальных) тонкой кишки у этих групп животных при стрессорных воздействиях. 4.

Научно-практическая ценность работы. Выяснение возрастных особенностей в распределении ферментов, особенно пептидгидролазного пула, между эпителиальным, стромальным и мышечно-серозным слоями тонкой кишки, а также их ответных реакций на стрессорные воздействия (иммобилизации, белкового голодания) важно для развития фундаментальных представлений о барьерных и адаптивных функциях тонкой кишки. Наши данные впервые позволяют приблизиться к пониманию роли энзиматического барьера разных слоев тонкой кишки при экстремальных воздействиях. С нарушением функций субэпителиального энзиматического барьера, возможно, связаны некоторые заболевания пищеварительной системы, которые сопровождаются увеличением проницаемости энзиматического барьера для белков и пептидов (болезнь Крона, малдигестия, целиакия, хирургические травмы кишечника и др.). Полученные данные могут быть полезными в разработке лечебного питания и в создании новых сбалансированных полноценных диет при патологии желудочно-кишечного тракта, особенно в детском и пожилом возрасте. Результаты работы могут быть использованы в научно-исследовательской работе и в курсах лекций по физиологии и патфизиологии.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы.

•. •/ докладывались на:

• 52-ой конференции молодых ученых и студентов СПГАВМ, посвященной 190-летию высшего ветеринарного образования в России и 100-летию со дня организации первого научно-производственного учреждения в Петербурге, 1998 г.;

• Всероссийской научной конференции, с международным участием, посвященной 150-летию со дня рождения акад. И. П. Павлова, Санкт-Петербург, 1999 г.;

• Научно-практической конференции «Приоритеты культуры и экологии в образовании», Ставрополь, 2003 г.

Восьмом международном конгрессе «Парентеральное и энтеральное питание», Москва, 2004 г.;

Публикация результатов исследования. Основные материалы диссертации опубликованы в 8 научных работах (из них 4 статьи).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 182 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора ВЫВОДЫ.

1. Обнаружена активность ферментов, осуществляющих гидролиз белков и пептидов (аминопептидаза М и глицил-Ьлейциндипептидаза), не только в эпителиальном слое, что было известно ранее, но и в I стромальном и мышечно-серозном слоях тонкой кишки у крыс линии Вистар разных возрастных групп (молодые, зрелые, старые). Показано, что сахараза присутствует только в эпителиальном слое тонкой кишки, что позволило использовать ее в качестве маркера для оценки чистоты разделения этих слоев.

2. Активность аминопептидазы М в эпителиальном слое тощей и подвздошной кишки значительно выше у молодых (в 2.7 раза, Р<0.05) и старых (в 1.7 раза, Р<0.05) животных по сравнению со зрелыми. В стромальном и мышечно-серозном слоях активность фермента составляла 10−20% от суммарной активности всех слоев. В подвздошной кишке у молодых животных она была выше (в 2 раза, Р<0.05), чем у зрелых.

Более высокий уровень активности глицил-Ьлейциндипептидазы у молодых животных по сравнению со зрелыми и старыми продемонстрирован не только в эпителиальном слое тощей и подвздошной кишки, но также в стромальном и мышечно-серозном слоях.

3. Иммобилизация в течение 3 ч. вызывала у зрелых животных увеличение активности Аминопептидазы М в субэпителиальных слоях тощей (в 2 раза, Р<0.05) и подвздошной (в 3 раза, Р<0.05) кишки через трое суток, а ппицил-1-лейциндипептидазы, — в каждом из слоев обоих отделов тонкой кишки через одни (в 1.5−2 раза, Р<0.05) и трое (в 2 — 5 раз, Р<0.05) суток после прекращения действия стрессорного фактора.

У старых крыс активность аминопептидазы М снижалась (на 40−50%, Р<0.05) в каждом из слоев обоих отделов тонкой кишки спустя сутки и полностью восстанавливалась до уровня активности у контрольных крыс через трое суток после стрессорного воздействия. Активность дипептидазы уменьшалась (почти в 2 раза, Р<0.05) в эпителиальном слое тощей и подвздошной кишки через сутки, но существенно увеличивалась (в 2−3 раза, Р<0.05) в субэпителиальных слоях через трое суток после действия иммобилизационного стресса. Реакция ферментных систем слоев тонкой кишки молодых животных была менее выраженной по сравнению со зрелыми и старыми. *.

4. В условиях 10-суточной белковой депривации наблюдалось увеличение активности аминопептидазы М (в 2.5 — 4 раза, Р<0.05) и глицил-Ьлейциндипептидазы (в 4 — 8 раз, Р<0.05) у старых крыс во всех слоях тощей и подвздошной кишки. У зрелых животных реакция пептидгидролаз была менее выражена, а у молодых — отсутствовала.

5. Полученные данные свидетельствуют, что энзиматический барьер тонкой кишки включает ферментные системы не только эпителиального слоя, но и субэпителиальных (стромального и мышечно-серозного) слоев, 1 что подтверждается их неоднозначной реакцией на стрессорные воздействия. Благодаря этому увеличивается мощность кишечного энзиматического барьера и затрудняется проникновение во внутреннюю среду веществ белковой и пептидной природы, обладающих гормональной и антигенной активностью.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ Несколько лет назад A.M. Уголевым была выдвинута гипотеза о существовании энзиматимеского барьера в тонкой кишке (Уголев, 1985; 1991; Уголев и др., 1992(a)). Было осуществлено определение активности различных пищеварительных ферментов в каждом из слоев тонкой кишки и обнаружено, что активность максимальна либо в эпителиальном слое (мембранные ферменты), либо в стромальном (глицил-L-лейциндипептидаза), либо в мышечно-серозном (глицилглицин-дипептидаза). Это привело к обнаружению неизвестных ранее фундаментальных характеристик тонкой кишки, как структуры, реализующей не только пищеварительно-транспортные, но и барьерные функции. На основании данных о распределении пищеварительных ферментов между слоями тонкой кишки, A.M. Уголев выдвинул гипотезу о существовании наряду с комплексом ферментов энтероцитов, образующих эпителиальный ферментный барьер, постэпителиального (субэпителиального) ферментного барьера, в значительной степени повышающего надежность трансформационной системы тонкой кишки. Суть ее заключается в том, что ферментные системы не только эпителиального слоя тонкой кишки, что было известно и ранее, но и ее субэпителиальных (стромального и мышечно-серозного) слоев, выполняют функцию барьера, препятствующего проникновению веществ белковой и пептидной природы во внутреннюю среду организма (Громова и др., 1991(6)). Эта ¦ гипотеза нашла подтверждение в последующих экспериментальных исследованиях кишечных ферментов в различных слоях тонкой кишки при экстремальных ' воздействиях (оперативные v вмешательства на тонкой кишке, иммобилизационный стресс, голодание, возобновление кормления и т. д.) (Фурдуй, 1986; Громова и др., 1991(a) — Егорова и др., 1992; Уголев и др., 1992(а, б) — Тимофеева, Иезуитова, 1993;

Никитина, и др., 1994; Тимофеева и др., 1994, 1996(a) — Макнелли, 1998; Ludden et al., 2002; Debray et al., 2003; Menard, 2004;).

Однако возрастные особенности распределения пищеварительных ферментов между эпителиальным, стромальным и мышечно-серозными слоями тонкой кишки при различных воздействиях на организм остались неясными. Это послужило поводом для исследования этих процессов у животных различных возрастных групп (молодые, зрелые и старые).

Известно, что с возрастом существенно меняются структурно-функциональные характеристики тонкой кишки. При переходе от молочного питания к дефинитивному у большинства. млекопитающих происходят изменения ферментного спектра тонкой кишки, что связано с необходимостью ассимиляции новых и важных компонентов пищи (Никитина и др. 1990; Рахимов, 1991; Tsuboi et al., 1985; Freund et al., 1991; Sklan et al., 2003). Старение организма также сопровождается значительными изменениями ферментативных свойств слизистой оболочки тонкой кишки (Уголев и др., 1992(6) — Тимофеева, 1995 (б) — Невмывак, Тимофеева, 1999 (a)—-Jang et al., 2000).

Нами обнаружено, что у крыс разного возраста существуют различия в уровне активности пептидаз в разных слоях тонкой кишки. Продемонстрировано, что активность аминопептидазы М максимальна в эпителиальном слое у крыс всех возрастных групп, что согласуется с ранее полученными данными (Уголев и др., 1992(a)). При этом важно отметить, что активность ферментов в эпителиальном слое как тощей, так и подвздошной кишки значительно выше у молодых и старых крыс, чем у крыс зрелого возраста. В стромальном слое также обнаружена высокая активность аминопептидазы М, которая в тощей кишке у крыс всех возрастных групп практически одинакова, а в подвздошной кишке почти в два раза выше у молодых, чем у зрелых и старых животных.

Нами обнаружены также существенные различия между активностью глицил-Ьлейциндипептидазы в разных слоях тощей и подвздошной кишки у животных различных возрастных групп. Наиболее высокая активность фермента наблюдалась в каждом из слоев тощей и подвздошной кишки у молодых крыс. У зрелых и старых крыс активность дипептидазы в эпителиальном слое обоих отделов тонкой кишки была существенно ниже, чем у молодых животных. Следует отметить, что ранее также было показано снижение активности этого фермента на поверхности слизистой оболочки тонкой кишки при старении (Уголев и др., 1992(6)). Более высокая активность глицил-Ь-лейциндипептидазы была также обнаружена в стромальном и мышечно-серозном слоях тощей и подвздошной кишки у молодых крыс по сравнению со зрелыми и старыми. У молодых животных активность дипептидазы в слоях тонкой кишки распределена более равномерно вдоль кишки, в то время как у крыс зрелого и старого возраста имело место ее преобладание в каждом из слоев подвздошной кишки. У молодых крыс отмечена более высокая активность ферментов в слоях проксимального и дистального отделов тонкой кишки: аминопептидазы М в эпителиальном слое, а глицил-Ь-лейциндипептидазы во всех слоях (эпителиальном, стромальном и мышечно-серозном).

Активность сахараз’ы, которую мы определяли в качестве маркера чистоты разделения слоев тонкой кишки (фермент присутствует только в эпителиальном слое), также выше в эпителиальном слое тощей и подвздошной кишки у молодых животных по сравнению со зрелыми и старыми.

По-видимому, обнаружение более высокого уровня ферментативных активностей в слоях тонкой кишки у молодых неполовозрелых животных можно объяснить тем, что у них еще не завершено формирование структурных элементов этого органа. В связи с этим более высокие уровни пептидазных активностей не только в эпителиальном, но и субэпителиальных слоях тонкой кишки, по-видимому, особенно важны в качестве барьера для предотвращения проникновения во внутреннюю среду организма белков и пептидов.

В то же время хорошо известно, что при. старении сокращается время полного обновления кишечного эпителия, происходит нарушение процессов дифференциации клеток кишечного эпителия (Мищенко, 1975; Зарипов и др., 1983; Мазо и др., 1989; Уголев и др., 1992(6) — Метельский, 2004; Penzes, 1974). Показано, что гипертрофия слизистой оболочки оставшихся после резекции отделов тонкой кишки у молодых животных выражена сильнее, чем у старых. Напротив, атрофия слизистой оболочки в нефункционирующих участках кишечной трубки (после их изоляции) была выше у старых животных, чем у молодых. (Уголев и др., 1992(6)).

По-видимому, способность тонкой кишки к гомеостазису, т. е. поддержанию постоянства структуры и функции независимо от повышения или понижения функциональной нагрузки при старении организма ослабевает. Эту точку зрения поддерживают и наши данные о возрастных особенностях распределения ферментов пептидазного пула между слоями тонкой кишки. Вероятно, возможности энзиматического барьера тонкой кишки с возрастом снижаются.

В настоящее время накоплен обширный материал о влиянии различных стресс-факторов (голодания, иммобилизации, высокой и низких температур и т. д.) на ферментативные и транспортные функции тонкой кишки (Уголев, 1972; 1985; Егорова и др., 1992; Уголев и др., 1992(6) — Ватаева и др., 1994; Никитина и’др., 1994; Тимофеева, 1995 (б) — Малышев, Манухина, 1998; Кассиль и др., 2000; Henning, 1985; 1987; Lebenthal, Young, 1986; Timofeeva et al., 1993; Vataeva et al., 1998; Hannelore Daniel, 2000; Gonzaler et al., 2001; Kroesen et al., 2002; Kushak et al., 2002; Ludden et al., 2002; Iji et al., 2003; Susbilla et al., 2003).

Стресс характеризуется общим адаптационным синдромом, состоящим из неспецифически обусловленных изменений в физиологических системах организма при действии чрезвычайных раздражителей, так называемых стрессоров. По существу стресс представляет собой биологический феномен адаптации и защиты. Стрессорная реакция сопровождается сложными взаимодействиями различных систем организма, в том числе и пищеварительной системы. Особое место занимает нейроэндокринная реакция, вызывающая усиление секреции передней доли гипофиза, а затем и коры надпочечников. При исследовании пищеварительных функций тонкой кишки под влиянием различных стрессорных воздействий обнаружено ослабление мембранного гидролиза пептидов и дисахаридов (Уголев, 1972; Никитина и др., 1994). Кроме того, было показано изменение распределения пептидаз между слоями тощей и подвздошной кишки у крыс-самцов Спрэг-Доули после иммобилизации на фоне голода (Никитина и др., 1994). Однако неизвестна реакция ферментов пептидазного пула различных слоев тонкой кишки, особенно стромального и мь^шечно-серозного, у крыс разных возрастных групп (молодые, зрелые, старые) на стрессорные воздействия. Выяснение этого вопроса важно с учетом гипотезы A.M. Уголева о постэпителиальном энзиматическом барьере тонкой кишки, выполняющем защитную роль на пути проникновения во внутреннюю среду организма чужеродных субстанций. Нами в качестве стрессирующего фактора была выбрана иммобилизация животных с последующим определением активности ферментов эпителиального, стромального и мышечно-серозного слоев тощей и подвздошной кишки у крыс разного возраста через 24 и 72 ч после стрессорного воздействия.

Следует отметить, что ранее было показано, что сразу после прекращения стрессорного воздействия обнаружить изменения активности ферментов, реализующих мембранное пищеварение, не удается.

Никитина и др., 1994). Вероятно, ответная реакция ферментов на воздействие стрессора формируется позднее, когда уже происходит смена популяции энтероцитов. Поэтому мы определяли активность ферментов спустя одни и трое суток после прекращения иммобилизации.

Наиболее чувствительными к стрессорному воздействию оказались ферментные системы слоев тощей и подвздошной кишки молодых крыс. У молодых животных после действия иммобилизационного стресса наблюдалось существенное снижение активности сахаразы в эпителиальном слое тощей и подвздошной кишки в оба> срока исследования. Также — можно отметить снижение активности аминопептидазы М спустя 3 суток, а глицил-1-лейциндипептидазы в оба срока исследования в эпителиальном слое тощей кишки. Эти данные согласуются с ранее полученными результатами (Тимофеева, 1995 (б)). В субэпителиальных слоях тонкой кишки у молодых крыс существенных изменений активности пептидаз не было обнаружено.

В наших опытах у зрелых крыс после действия стресс-факторов было обнаружено увеличение активности ферментов пептидазного пула как в эпителиальном, так и в субэпителиальных слоях. Так, активность аминопептидазы М увеличивалась в стромальном и мышечно-сёрозном слоях тощей и подвздошной кишки спустя трое суток после прекращения действия иммобилизации. Можно отметить существенное увеличение активности глицил-Ь-лейциндипептидазы в каждом из слоев тощей и подвздошной кишки в оба срока исследования. Причем, увеличение активности было наиболее значительным спустя трое суток после прекращения иммобилизации. Активность сахаразы также возрастала в эпителиальном слое обоих отделах тонкой кишки зрелых животных через 72 ч после действия стрессирующего фактора.

При иммобилизации старых крыс имело место снижение активности всех исследованных ферментов в каждом из слоев тонкой кишки спустя одни сутки после прекращения стрессорного воздействия. Через трое суток активность сахаразы и аминопептидазы М восстанавливалась до контрольных величин, в то время как активность глицил-L-лейциндипептидазы в стромальном и мышечно-серозном слоях тощей и подвздошной кишки превышала ее уровень у контрольных животных.

Таким образом, нами обнаружены существенные изменения после стресса активности ферментов пептидазного пула не только в эпителиальном слое, что было показано ранее и другими авторами, но также в стромальном и мышечно-серозном слоях, что продемонстрировано впервые. Реакции ферментов. слоев тощей и подвздошной кишки на стрессорное воздействие: у крыс разного возраста были неидентичуыми.

Известно, что при стрессе происходит усиление активации перекисного окисления липидов. Образующиеся при этомв значительном количестве гидроперекиси и свободные радикалы разрушают мембраны клеток, в том числе, очевидно, и клеток кишечного эпителия (энтероцитов) (Горизонтов и др., 1983; Панин, 1983).

Не исключено, что в этих условиях превалирует парацеллюлярный транспорт нутриентов, что способствует проникновению нерасщепленных пептидов во внутреннюю среду организма. Это наблюдается при гиперосмотических состояниях в желудочно-кишечном тракте (Gardner, 1988). При стрессе возможно также снижение лизосомального про1-еолиза вследствие разрушения лизосомальных мембран (Panizar et al., 1993). Кроме того, известно, что при стрессе происходит срочная мобилизация лимфоидных клеток, обладающих пептидазной активностью, и их расселение по органам и тканям для обеспечения подготовки организма к ответу на любое нарушение гомеостаза. На лимфоидную ткань в тонкой кишке приходится примерно 25% от ее массы (Уголев, 1991; Rothkotter et а1., 1994). Ранее при изучении пищеварительных функций тонкой кишки после стрессорных воздействий были обнаружены значительные изменения синтеза и деградации энтеральных ферментов, реализующих мембранное пищеварение, а также их транслокации на поверхность мембран щеточной каймы энтероцитов (Уголев, 1972).

Стресс, как правило, сопровождается усилением катаболизма.

• «< белков, приводящих к отрицательному азотистому балансу. Вполне вероятно, что лежащий в основе патогенеза стрессорной реакции сдвиг азотистого баланса в сторону катаболизма может быть вызван не только усилением секреции глюкокортикоидов и увеличением интенсивности дезаминирования эндогенных аминокислот, но также и недостаточным поступлением аминокислот вследствие снижения уровня мембранного гидролиза белков. Мы также уже через сутки после прекращения стрессорного воздействия наблюдали значительное снижение содержания белка в каждом из слоев обоих отделов тонкой, кишки у зрелых крыс, которое нарастало через трое суток. У молодых крыс снижениеуровня белка имело место лишь в мышечно-серозном слое тощей кишки и в эпителиальном и мышечно-серозном слоях подвздошной, причем через трое суток после прекращения иммобилизации имело место полное восстановление содержания белка. В мышечно-серозном слое тощей кишки оно также возрастало, но не достигало уровня контрольных животных. Обращает на себя внимание тот факт, что содержание белка в каждом из слоев тощей и подвздошной кишки было, как правило, меньше у стрессированных животных всех возрастных групп, но из-за разброса величин стандартной ошибки снижение белка не всегдабыло достоверным. «*.

Ранее было высказано предположение, что увеличение активности пептидаз в субэпителиальных слоях тонкой кишки можнб рассматривать как защитную адаптационно — компенсаторную реакцию на возможное.

1 152 • - наличие в субэпителиальном пространстве нерасщепленных низкомолекулярных пептидов вследствие усиления катаболизма белков и поступления образованных пептидных субстратов через поврежденные мембраны клеток кишечного эпителия во внутреннюю среду (Уголев и др., 1992 (а) — Тимофеева, 1995 (б)).

Реакция ферментных систем эпителиального, стромального и мышечно-серозного слоев тонкой кишки у молодых животных на стрессорное воздействие была иной, чем у зрелых и старых. Возможно, у молодых животных происходит йарушение соотношения скоростей синтеза и деградации ферментов в слоях тонкой кишки при стрессорных воздействиях. Это указывает на то, что ферментные системы тонкой кишки молодых крыс менее способны к защитным адаптационным реакциям на стрессорное воздействие. По-видимому, это обусловлено незрелостью структурных элементов тонкой кишки у молодых неполовозрелых животных.

Таким образом, нами обнаружены новые факты о роли ферментных систем, особенно пептидазного пула, субэпителиальных слоев тонкой кишки у животных разного возраста (молодые, зрелые, старые), за счет которых в ряде случаев увеличивается адаптируемость ее в цедом, что способствует лучшей защищенности организма от проникновения чужеродных субстратов, особенно белковой природы (зрелые и старые крысы). У молодых животных наблюдается другая картина. При этом могут развиваться патологические реакции, связанные с нарушением проницаемости кишечного барьера для белков и пептидов, а также снижением уровня пептидазных активностей. Кроме того, эти данные расширяют наши представления о пищеварительно-барьерных функциях тонкой кишки в онтогенезе.

Из анализа данных1 литературы и данных, полученных нами. в этой работе, можно прийтик заключению, что активность ферментов пептидазного пула неодинакова в различных слоях тонкой кишки у крыс разного возраста. Кроме того, различна чувствительность ферментных систем тонкой кишки к, стрессорным воздействиям, в том числе к белковому голоданию (Тимофеева и др., 1994; Невмывак, Скопичев, 1999; Невмывак, Тимофеева, 1999 (б) — 2002).

В качестве экстремального воздействия на организм была использована белковая депривация с применением безбелковой диеты, на которой крысы трех возрастных групп (молодые, зрелые, старые) содержались в течение 10 суток. Была изучена возрастная динамика активности пептидгидролаз в эпителиальном и субэпителиальных слоях тонкой кишки у исследуемых групп крыс в условиях белковой депривации.

Для жизнедеятельности любого организма и его устойчивости к воздействиям окружающей среды особое значение имеют белки пищи. Известно, что белки необходимы для построения клеточных структур, они обладают гормональной, ферментативной, транспортной активностью и многими другими функциями. Недостаток белка в пище 'сопровождается значительными изменениями обмена веществ (Wildman et al., 2000).

Исходя из теории субстратного регулирования, следовало ожидать снижения активности пептидгидролаз, так как известно, что ферментативная активность меняется специфически в ответ на изменение состава пищи. Ограничение субстрата или его отсутствие сопровождается снижением синтеза соответствующего ферментного белка. Белковая депривация приводит также к снижению скорости синтеза 'РНК и обновления белков клетки, включая энтероциты (Спирин, 1984; 'Адапт.-комп. процессы, 1991; Тимофеева и др., 2000(а, б) — Тимофеева и др., 2003 (а, б) — Ferraris et al., 1992; Gangopadhya et al., 2002; Panx et’al., 2002).

Белковое голодание привело к увеличению активности сахаразы в эпителиальном слое тощей и подвздошной кишки у крыс всех возрастных групп. Это объясняется тем, что в безбелковой диете существенно повышен углеводный компонент (крахмал) по сравнению с контрольной диетой. Образующаяся в результате гидролиза крахмала в значительных количествах мальтоза индуцирует синтез ферментного комплекса сахараза-изомальтаза.

В нашей работе мы часто не наблюдали уменьшения активности пептидгидролаз в ответ на снижение в пище специфического субстрата (белка), в то время как ранее такая реакция этих ферментов была 7 обнаружена (Тимофеева и др., 1994; Тимофеева, 2000; Тимофеева и др., 2003 (б)). Как правило, не наблюдалось изменений активности обеих пептидгидролаз в обоих отделах тонкой кишки молодых крыс. Активность аминопептидазы М в эпителиальном слое тощей и подвздошной кишки несколько превышала таковую у контрольных животных.

У зрелых животных, получавших безбелковую диету, в эпителиальном слое тощей и подвздошной кишки, а также в стромальном слое подвздошной было обнаружено увеличение (в 1.5 — 2 раза) активности аминопептидазы М и глицил-Ьлейциндипептидазы по сравнению с крысами, получавшими полноценное питание. ,.

В отличие от этих групп животных у старых крыс наблюдалось значительно большее увеличение (в 4−7 раз) ферментативной активности пептидгидролаз во всех слоях тонкой кишки после белкового голодания по сравнению с молодыми и зрелыми животными. Важно отметить, что в нашей работе после белкового голодания имело место существенное снижение содержания белка в каждом из слоев тонкой кишки, особенно выраженное у старых крыс. При этом у старых крыс наблюдалось и большее увеличение удельной активности аминопептидазы М и глицил-1-лейциндипептидазы во ' всех? слоях тонкой кишки после белкового голодания по сравнению со зрелыми и молодыми животными. <

По-видимому, повышение пептидгидролазной активности в слоях тонкой кишки после белкового голодания, скорее 'всего, следует рассматривать как адаптивно — защитную реакцию организма в ответ на образование значительного количества низкомолекулярных пептидов вследствие катаболизма белков в энтероцитах. Более, устойчивыми к действию белковой депривации оказались молодые и зрелые животные. Вероятно, у старых крыс в условиях белкового голодания увеличивается проницаемость мембран клеток кишечного эпителия и межклеточных соединений, что способствует большему проникновению пептидов во внутреннюю среду организма. Однако организм реагирует на это повышением активности пептидгидролаз и этим самым защищается от проникновения биологически активных веществ, которые могут приводить к нежелательным последствиям. Тем более известно, 4to при старении происходит неуклонное нарастание инволютивных процессов в слизистой оболочке различных отделов желудочно-кишечного' тракта, что обусловлено, вероятно, изменением темпов регенерации (Валенкевич, Уголев, 1982; Анисимов, 2000; Тимофеева и др., 2004 (а, б) — Friedrichsen et al., 2001). При этом развиваются дистрофические и атрофические процессы, которые могут привести к нарушению проницаемости клеток кишечного эпителия и проникновению нерасщепленных пептидных субстратов в субэпителиальное пространство.

Таким образом, полученные нами результаты подтверждают.

• < гипотезу, выдвинутую академиком A.M. Уголевым, о существовании постэпителиального энзиматического барьера в тонкой кишке. Наши г данные продемонстрировали, что совершенное и надежное выполнение функций физиологического барьера структурами тонкой кишки достигается, во многом благодаря взаимодействию ферментных систем эпителиального, стромального и мышечно-серозного слоев, которое в большой мере зависит от возрастных особенностей организма.