Плоскостная хроматография. 
Методы исследования материалов и процессов

Различают два варианта плоскостной хроматографии: тонкослойную и хроматографию на бумаге.

Тонкослойная хроматография (ТСХ)

Этот наиболее простой метод в техническом обеспечении, достаточно оперативный и в настоящее время занимает одно из ведущих мест среди методов анализа органических и биоорганических соединений. Продолжительность разделения здесь исчисляется минутами, поэтому ТСХ часто применяют при экспресс-анализах.

Процесс тонкослойной хроматографии заключается в следующем: поверхность стеклянной пластинки покрывают тонким слоем адсорбента (наносят слой суспензии и жидкость испаряют). Адсорбентом чаще всего служит силикагель, несколько реже — оксид алюминия. Иногда применяют и смешанные неподвижные фазы (для определения микроколичеств пестицидов используют силикагель с крахмалом, силикагель с гипсом или оксид алюминия с гипсом). Промышленность выпускает готовые к употреблению пластинки практически для всех типов анализа.

На стартовую линию наносят анализируемые вещества и их смеси. Край пластинки, ниже стартовой линии, погружают в растворитель. По мере продвижения жидкости по пластинке происходит разделение веществ смеси на адсорбенте.

Границу подъема жидкости отмечают, пластинку сушат и проявляют для поиска веществ в виде окрашенных пятен. Измеряют расстояние от линии старта до центра пятна каждого компонента. На рис. 5.6 это L и L₂. Определяют также расстояние от стартовой линии до линии подъема жидкости — В. Отношение Rj =Ц!В является характеристикой для каждого анализируемого вещества на данном адсорбенте, оно зависит от ряда факторов: толщины слоя адсорбента, природы растворителя, количества нанесенного вещества и т. д. Часто для анализа применяют метчики — «свидетели». Наносят на пластинку известное вещество — «свидетель» и разделяемую смесь веществ. Rf исследуемых вещества в этом случае определяют как отношение Li к расстоянию, пройденному «свидетелем».

Очень важно при проведении тонкослойной хроматографии нанести оптимальное количество анализируемого вещества или смеси.

Избыточный объем дает чересчур большие пятна неправильной формы, которые сливаются с соседними пятнами, имеющими близкое значение R/.

Рис. 5.6. Хроматограмма тонкослойной хроматографии: Z.] и L₂ — расстояния от центра пятна до линии старта;

В — расстояние от линии старта до фронта растворителя; 1 и 2 — места нанесения веществ 1 и 2.

Хроматографирование осуществляют следующим образом. Исследуемую смесь веществ растворяют в эфире, хлороформе или в каком-либо другом подходящем растворителе. На хроматографической пластинке на расстоянии 1,5 см от нижнего края простым карандашом намечают стартовую линию и на одинаковом расстоянии от нее осторожным прикосновением капилляра, чтобы слой не нарушался, наносят анализируемый раствор (0,1−50 мкл). Диаметр пятна при этом не должен превышать 5−7 мм, расстояние между отдельными пятнами — не менее 1 см. Затем пластинку помещают в растворитель. В зависимости от направления подачи растворителя на пластинку различают методы восходящей, нисходящей и горизонтальной хроматографии.

Хроматографию называют восходящей, если растворитель поступает на пластинку снизу вверх (под действием капиллярных сил). Растворитель или смесь растворителей наливают в хроматографическую камеру в таком объеме, чтобы поставленная вертикально пластинка с нанесенным веществом погружалась примерно на 5 мм. Для насыщения камеры парами растворителя рекомендуется на ее заднюю стенку прикреплять смоченный растворителем лист фильтровальной бумаги, доходящий до дна сосуда.

Хроматографию называют нисходящей, если растворитель поступает на пластинку сверху. В некоторых случаях для лучшего разделения веществ с близкими значениями R/ применяют проточную хроматографию. Она осуществляется при непрерывном поступлении свежего растворителя на пластинку. Он продвигается по адсорбенту до конца пластинки и стекает с нее или просто испаряется.

Обычно растворитель пропускают вдоль пластинки с адсорбентом один раз. Однако для лучшего разделения компонентов смеси часто проводят повторное хроматографирование (с другим или тем же самым растворителем). В случае применения многокомпонентных смесей используют и двухмерную хроматографию, здесь повторное хроматографирование осуществляется движением растворителя в направлении, перпендикулярном первоначальному.

Выбор растворителя для ТСХ, как правило, производится эмпирически с учетом полярности разделяемых компонентов и растворителей. При оценке полярности растворителей обычно руководствуются элюотропным рядом Шталя, в котором растворители расположены в порядке возрастания их диэлектрической проницаемости. Принимается, что адсорбционная способность соединений, содержащих функциональные группы, увеличивается в следующей последовательности:

Если в. молекуле вещества одновременно присутствует несколько заместителей, то указанная закономерность может изменяться.

Для детектирования на хроматограмме бесцветных веществ чаще всего используют явление флуоресценции. Так, для обнаружения веществ, поглощающих в УФ-области спектра, применяют слои адсорбента, содержащие флуоресцирующее вещество, или опрыскивают раствором такого вещества хроматограмму после анализа. При освещении данной хроматограммы УФ-светом анализируемые вещества обнаруживаются в виде темных пятен.

Часто для обнаружения веществ на хроматограмме пластинки опрыскивают окрашивающими реагентами, последние бывают двух типов:

• • реагенты общего назначения, взаимодействующие с целым рядом соединений различного типа (пары йода, фосфорномолибденовая кислота, родамин В и т. д.);
• • специфические реагенты, указывающие на присутствие лишь определенного соединения или функциональной группы.

Так, для обнаружения хлорорганических соединений обычно применяют раствор азотнокислого серебра и 2-феноксиэганола или аммиака в ацетоне с последующим УФ-проявлением. Такая методика позволяет обнаружить до 0,1−0,5 мкг препарата. Кроме указанного реактива для детектирования пятен хлорорганических пестицидов применяют также 0,1 М раствор марганцовокислого калия, дифениламин, пары йода, спиртовые растворы о-толидина или о-дианизидина. Для обнаружения фосфорорганических соединений, содержащих серу, применяют смесь бромтимолсинего и азотнокислого серебра, хлористый палладий, 2,6-дихлор-Мхлорхинонамид.

Методы количественного анализа хроматограмм в тонком слое можно разделить на две группы.

В первой — разделенные вещества анализируют непосредственно на слое адсорбента. Здесь получило наибольшее распространение визуальное сравнение размера пятна и интенсивности его окраски с пятнами стандартных растворов. Для этого на одной пластинке с пробой анализируемых веществ хроматографируют пробы эталонных образцов, с известным количеством. Такой метод визуального сравнения пятен достаточно оперативен и не требует специального оборудования, но точность данного анализа невелика и обычно его применяют лишь для оценки содержания веществ в смесях.

Иногда проводят измерение площади пятна с помощью планиметра или переносят хроматограмму на миллиметровую бумагу и находят число покрытых пятнами клеточек. Далее строят калибровочную кривую в координатах: количество вещества (мт) — площадь пятна (мм²). Из нее, зная площадь пятна анализируемого вещества, определяют его содержание в пробе. Иногда вместо калибровочной кривой для каждой концентрации определяемого соединения изготовливают шаблоны, вырезанные из фольги или миллиметровой бумаги. Шаблоны разных площадей накладывают на пятно до их совпадения.

Во второй — исследуемые вещества вымывают из слоя адсорбента и далее определяют их количество тем или иным методом. Здесь для проведения количественного анализа вещества вымывают из слоя адсорбента. Полученные таким образом растворы анализируют тем или иным физико-химическим методом, например, спектрофотометрически или с помощью масс-спектрометра.