Пропускание раствора и проявление хроматограммы

В подготовленную воронку осторожно вносят раствор исследуемого вещества. При адсорбционной и распределительной хроматографии раствор должен быть возможно более концентрированным и занимать объем, не превышающий 1/10 объема колонки. Если вещество недостаточно растворяется в выбранной подвижной фазе, его растворяют в другом растворителе, растирают с частью носителя и высушивают в вакууме. Пропитанный таким образом носитель суспендируют в небольшом количестве подвижной фазы и вносят в верхнюю часть готовой колонки.

При ионообменной хроматографии можно добавить в колонку больше растворителя, так как чистые неионизированные растворители не вызывают расширения зон. По этой же причине можно вводить также разбавленные исследуемые растворы и концентрировать их на сорбенте. Для проявления хроматограммы применяют растворитель, под действием которого зоны перемещаются вниз по слою сорбента с небольшой скоростью.

Как и в адсорбционной хроматографии, в распределительной подбирают смесь растворителей, в которой и малоподвижные зоны тоже приходят в движение. Например, органические кислоты разделяют смесью бутилового спирта и хлороформа, непрерывно увеличивая содержание бутилового спирта в смеси.

При разделении неокрашенных и нефлуоресцирующих веществ результат разделения определяют, исследуя вытекающий из колонки раствор (элюат). Очень удобен автоматический прибор (коллектор) для отбора фракций элюата порциями по 0,5—10 мл. Фракции отбирают одинакового объема или одинаковой массы или через равные промежутки времени. Разделяя простые смеси, можно отбирать фракции элюата вручную.

Обнаружение при хроматографировании на колонках. Методы обнаружения можно разделить на три основные группы:

1) наблюдение вещества непосредственно на колонке; 2) регистрация веществ непосредственно после выхода из колонки; 3) обнаружение веществ в отобранных фракциях элюата.

Обнаружение вещества непосредственно на колонке — наиболее простой и удобный метод. Если разделяемые вещества окрашены (например, динитрофенильные производные аминокислот), то по мере разделения смеси веществ в колонке появляются окрашенные зоны. Обнаружить вещество на колонке можно в УФ-свете. Вещества кислотного характера легко обнаружить, если перед хроматографированием носитель пропитать небольшим количеством подходящего индикатора.

Для регистрации вещества в момент выхода из колонки существует несколько способов. Для веществ кислотного характера можно использовать цветную реакцию с индикатором. Более эффективен и не вызывает загрязнения элюата метод, при котором элюат по выходе из колонки направляют в микрокювету. Там его непрерывно анализируют потенциометрическим, рефрактометрическим, спектрофотометрическим или колориметрическим методом. Наиболее распространен метод обнаружения веществ анализом каждой из точно отмеренных фракций элюата. Чаще всего хроматографируют в тонком слое каждую фракцию элюата или используют химические превращения с последующим исследованием продуктов реакции.

Хроматография на бумаге. В настоящее время получили развитие следующие виды хроматографии на бумаге: одномерная, двумерная, круговая и электрофоретическая. Одномерную и двумерную выполняют в двух вариантах (рис. 79): восходящим и нисходящим потоком растворителя.

Рис. 79. Бумажная хроматография: а — восходящая; б — нисходящая Одномерная восходящая хроматография (рис. 79, а). 1—5 мкл исследуемого раствора капилляром наносят на полосу хроматографической бумаги в 2 см от нижнего края. Если неподвижная фаза — вода, то бумагу специально не обрабатывают, так как воздушно-сухая бумага содержит до 20—22% влаги. Подвижную фазу, насыщенную неподвижной, наливают на дно сосуда для хроматографирования (в цилиндр или пробирку). Полосу бумаги нижним краем опускают в жидкость, а верхний край закрепляют так, чтобы бумага свободно свисала вниз, не касаясь стенок сосуда. Под действием капиллярных сил подвижная жидкость поднимается вверх по бумаге и разделяет компоненты смеси, которые при различных значениях R_{ движутся по слою бумаги с неодинаковыми скоростями. Опыт считается законченным, когда фронт подвижной фазы почти достигнет верхнего края бумажной полосы. После этого хроматограмму извлекают из сосуда, отмечают линию фронта, высушивают и проявляют.

Ширина полосы обычно 2—5 см в случае нанесения одной пробы. Длина ее определяется условиями разделения. При одновременном хроматографировании ряда растворов берут широкую полосу бумаги; вдоль ее нижнего края проводят линию старта, на которую наносят капилляром исследуемые растворы на расстоянии 2—3 см друг от друга.

Одномерная нисходящая хроматография. В верхней части цилиндра (см. рис. 79, б) укрепляют небольшую ванночку, в которую наливают подвижный растворитель, насыщенный неподвижным. На дно цилиндра помещают бюкс с неподвижным растворителем, насыщенным подвижным. Это создает в цилиндре атмосферу насыщенных паров, предотвращающих испарение растворителя с бумаги.

На полоску бумаги на расстоянии 5 см от верхнего края наносят каплю исследуемого раствора; край полоски погружают в ванну с подвижной фазой. Растворитель из ванны стекает под действием капиллярных сил и силы тяжести вниз по бумаге. Опыт считается законченным, когда фронт растворителя достигнет 3—5 см от нижнего края бумаги.

Круговая хроматография. Для получения круговой хроматограммы в центр круга хроматографической бумаги вносят каплю исследуемого раствора. Работу удобно проводить в эксикаторе. Диаметр бумажного круга должен быть на 2—3 см больше диаметра нижней узкой части эксикатора. Круг укладывают над узкой частью эксикатора, в которую налита смесь неподвижного и подвижного растворителей. Для подачи растворителя в круге вырезают полоску от края до центра («фитиль»), отгибают и опускают в растворитель. На хроматограмме разделяемые вещества образуют концентрические круги.

Двумерная хроматография. Если одним растворителем разделить сложную смесь не удается, применяют последовательно два растворителя с разными коэффициентами распределения.

Для двумерной хроматографии применяют квадратные листы бумаги размером 20×20, 30×30, 40×40 см. В начале опыта исследуемый раствор наносят на бумагу в ее левом углу на расстоянии 5 см от левого и от нижнего краев. После высушивания пятна бумагу помещают в сосуд для хроматографирования, опускают нижний край в один из выбранных растворителей и хроматографируют по восходящему методу. После высушивания бумагу, повернув на 90° против часовой стрелки, помещают в новый сосуд для хроматографирования, содержащий второй растворитель, и хроматографируют по восходящему методу. После проявления получают двумерную хроматограмму.

Бумага для хроматографирования. В распределительной хроматографии к бумаге предъявляются следующие требования: она должна быть химически чистой, химически и адсорбционно нейтральной, однородной по плотности, обеспечивать определенную скорость движения растворителя. В России выпускают четыре сорта хроматографической бумаги: N° 1, 2, 3, 4. Каждый номер отличается от другого по плотности, а следовательно, и по скорости движения растворителя. Бумага N° 1 и 2 называется «быстрой», а N° 3 и 4 — «медленной». Хроматографическая бумага должна содержать достаточное количество неподвижной фазы. Обычные сорта бумаги гидрофильны, поэтому в случае применения воды в качестве неподвижной фазы не требуется специально увлажнять бумагу.

Для разделения некоторых смесей нерастворимых в воде органических соединений целесообразно гидрофильную бумагу превратить в гидрофобную. Для этого бумагу ацетилируют, обрабатывая 10 г бумаги смесью 9 мл уксусного ангидрида, 100мл петролейного эфира и 8—10 капель концентрированной серной кислоты. После ацетилирования бумагу пропитывают различными гидрофобными веществами (1%-й раствор парафина в петролейном эфире, 0,5%-й раствор каучука в бензоле и т. п.). Первостепенное значение для разделения смеси хроматографическим путем на бумаге имеет правильный выбор растворителей. В табл. 7 приведены подвижные фазы, наиболее часто применяемые в бумажной хроматографии для разделения смесей (неподвижная фаза — вода).

Проявление бумажных хроматограмм. В большинстве случаев хроматограмма на бумаге после высушивания остается бесцветной. Поэтому полученные хроматограммы проявляют. Для этой цели служат растворы различных веществ, при взаимодействии которых с компонентами анализируемой смеси образуются окрашенные соединения. Качественно обнаружить вещества в проявленной хроматограмме можно и по люминесценции в ультрафиолетовом свете.

Идентификации компонентов смеси. Для идентификации компонентов смеси на хроматограмме применяют метод «свидетелей». Этот метод основан на том, что коэффициент распределения R_f практически не зависит от присутствия посторонних веществ. Поэтому, если параллельно с каплей анализируемой смеси нанести на бумагу каплю смеси с известными веществами, то после проявления можно, сравнивая положение пятен на хроматограмме, идентифицировать вещества неизвестной смеси.

Таблица 7. Подвижные фазы, наиболее часто применяемые в бумажной хроматографии для разделения смесей (неподвижная фаза — вода).