Основы хроматографическою метода анализа

Сорбция (от лат. sorbeo - поглощаю) — поглощение твёрдым телом или жидкостью какого-либо вещества из окружающей среды. Различают четыре вида сорбции.

Абсорбция (от лат. ab — в и. .сорбция) — поглощение какоголибо вещества из окружающей среды всей массой поглощающего тела (абсорбента).

Процесс растворимости газов в жидкости при данной температуре и невысоком давлении описывает уравнение Генри (W. Henry — английский химик, 1775 — 1836).

где р — парциальное давление газа над раствором; к — коэффициент пропорциональности; С — концентрация растворённого в жидкости газа.

Адсорбция (от лат. ad — на, при и …сорбция) — поглощение вещества из газовой или жидкой среды поверхностным слоем твёрдого тела (адсорбента) или жидкостью.

Равновесные отношения при адсорбции описывает уравнение Ленгмюра (J. Langmuir — американский физик и физико-химик, 1881 — 1957).

где С — равновесная концентрация поглощённого адсорбентом вещества; р — равновесное давление поглощаемого вещества в парогазовой смеси; а, Ъ — эмпирические коэффициенты.

Хемосорбция — поглощение вещества твёрдыми или жидкими сорбентами с образованием химических соединений.

Капиллярная конденсация — образование жидкой фазы в порах и капиллярах твёрдого сорбента при поглощении паров вещества.

Все перечисленные виды сорбции редко встречаются в «чистом» виде, гак как обычно наблюдается сочетание двух или нескольких видов поглощения.

В основу классификации хроматографических методов положены следующие признаки: агрегатное состояние подвижной и неподвижной фаз, механизм взаимодействия сорбент-сорбат, форма слоя сорбента (техника выполнения), цель хроматографирования.

По агрегатному состоянию фаз хроматографию разделяют на газовую, жидкостную и сверхкритическую флюидную. Газовая хроматография включает в себя газожидкостную и газотвёрдофазную, жидкостная — жидкостно-жидкостную, жидкостно-твёрд офазную и жидкостно-гелевую.

Газовая — хроматография, в которой подвижная фаза находится в состоянии газа или пара.

Газожидкостная — газовая хроматография, в которой неподвижной фазой служит жидкость, нанесённая на твёрдый носитель. В её основе лежит абсорбция газов и паров, т. е. поглощение жидкостью. В этом случае колонка заполнена шихтой (нем. Schicht) — пористыми телами, которая является носителем неподвижной фазы (жидкости), абсорбирующей газы. Колонка представляет собой металлический капилляр с внутренним диаметром 0,3 — 0,5 мм и длиной 15−30 м, намотанный на катушку.

Жидкостная — хромапмрафия, в которой подвижной фазой является жидкость.

Ситовая (гельпроникающая или гсльфильтрационная) — вариант жидкостной хроматографии, когда время выхода вещества из колонки зависит в основном от геометрических и диффузионных параметров разделяемых макромолекул.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) — использование сорбентов с очень небольшим размером зерна.

(3−10 мкм), что обеспечивает быстрый массоиеренос при очень высокой эффективности разделения.

Флюидная хроматография (сверхкритическая), когда процесс протекает при сверхкритических условиях, вследствие чего газноситель ведёт себя подобно жидкости. В этом случае можно использовать колонки и детекторы, предназначенные для газовой хроматографии. Плотность же и растворяющая способность реагентов приближается к соответствующим свойствам жидкости.

По механизму взаимодействия сорбента и сорбата выделяют несколько видов хроматографии: распределительная, основанная на различии в растворимости разделяемых веществ в неподвижной фазе (газожидкостная хроматография) или на различии в растворимости веществ в подвижной и неподвижной жидких фазах; ионообменная — на разной способности веществ к ионному обмену; сорбционная — на различии в адсорбируемое™ веществ твёрдым сорбентом; эксклюзионная — на различии в размерах и формах молекул разделяемых веществ; аффинная (от лат. affinis — родственный) — на специфических взаимодействиях, характерных для некоторых биологических и биохимических процессов.

По технике выполнения выделяют колоночную (в специальных колонках) и плоскостную хроматографию, когда разделение проводится на специальной бумаге (бумажная хроматография) или в тонком слое сорбента (тонкослойная хроматография).

По цели хроматографирования выделяют аналитическую, препаративную (от лат. praeparatus — приготовленный, для получения веществ в чистом виде, для концентрирования и выделения микропримесей) и промышленную (производственную) хроматографию.

Аналитическая — хроматография, используемая для количественного и качественного анализа смесей.

Препаративная — высокоэффективный, чаще всего лабораторный метод получения веществ в чистом виде, концентрирования и выделения компонентов или фракций из смеси.

Аналитическая реакционная газовая хроматография — метод, в котором сочетают хроматографическое разделение и определение с химическим или физическим изменением состава смеси, причем все эти стадии единого процесса (включая детектирование) осуществляются в одном общем потоке газа-носителя.

Проявительная — хроматшрафия, при которой дискретно вводимое ограниченное количество разделяемой смеси вымывается из хроматографической колонки потоком непрерывно проходящего газа-носителя, сорбирующегося слабее любого из компонентов смеси.

Экстракционная хроматшрафия — когда элементарным актом является экстракция компонентов смеси в органическую фазу, закреплённую тонким слоем на инертном носителе.

Ионопарная (разновидность экстракционной) хроматография занимает промежуточное положение между ионообменной и адсорбционной (распределительной или обращённофазной) хроматографиями.

Лигандно-обменная хроматография — метод, применяемый для разделения соединений, содержащих донорные гетероатомы или кратные связи. Он основан на образовании координационных связей меду сорбентом и разделяемыми ионами или молекулами.

На рис. 8.1, а показана идеализированная хроматограмма смеси двух веществ. По оси абсцисс отложено время хроматографирования (можно отложить объём элюата), по оси ординат — аналитический сигнал, зависящий от концентрации веществ в элюатс (отклик А).

ГОСТ 17 567–81 определяет следующие основные параметры хроматографического процесса.

Время удерживания /_/( — интервал времени от момента ввода пробы в хроматографическую колонку до момента выхода из неё определяемого вещества максимальной концентрации. Значение In не зависит от количества пробы, но зависит от природы вещества и сорбента, а также плотности сорбента и может меняться от колонки к колонке, t_R = t," + t" где t_m, t_s — время пребывания вещества в подвижной и неподвижной фазах.

Расстояние удерживания /_й — длина отрезка диаграммной ленты, соответствующая времени удерживания.

Отклик А.

Рис. 8.1. Хроматограмма:

а — идеализированная хроматограмма двух веществ (пик с /о соответствует не удерживаемому компоненту); б — окно с хроматограммой.

Удерживаемый объём V_R — объём газа-носителя, прошедшего через колонку от момента ввода пробы до момента выхода определяемого вещества максимальной концентрации, измеренный при давлении и температуре на выходе колонки.

где V" — объёмный расход газа-носителя при температуре и давлении на выходе колонки.

Время нахождения молекул исследуемого соединения в газовой фазе зависит от доли пустот в насадочной или капиллярной колонке. В разных насадочных колонках плотность набивки может изменяться, в результате будет меняться и величина времени удерживания 1_К. Поэтому для характеристики истинной удерживающей способности определяют величину приведенного времени удерживания.

Приведённое время удерживания i'_R — интервал времени от момента выхода из колонки несорбирующегося вещества максимальной концентрации до момента выхода определяемого вещества максимальной концентрации.

Относительное удерживание г — отношение приведённого времени удерживания определяемого компонента к приведённому времени удерживания вещества сравнения.

где t_Rcp — время удерживания вещества сравнения; 1_ср — расстояние удерживания вещества сравнения; - расстояние удерживания несорбирующегося вещества.

Параметры удерживания, по существу, характеризуют сорбционную способность анализируемых соединений. Отличие в сорбируемости определяется различием межмолекулярных взаимодействий вещсство-сорбснт.

Любой процесс распределения вещества между двумя фазами характеризуется коэффициентом распределения D

где С_т и C_s — концентрация вещества в подвижной и неподвижной фазе соответственно.

Для разделения двух веществ необходимо, чтобы Ф D₂. Коэффициент распределения D связан с хроматографическими параметрами следующим образом:

где V, — объем подвижной фазы колонки. После ряда подстановок получим.

Исправленный объем удерживания V'_R связан с D соотношением.

Формулы (8.8) и (8.9) считают основными уравнениями хроматографии.

Эффективность хроматографической колонки — расчетная величина, характеризующая степень расширения зоны определяемого вещества на выходе колонки, она пропорциональна квадрату отношения времени удерживания к ширине хроматографического пика. Количественно эффективность колонки можно оценить числом теоретических тарелок п и высотой, экБивалентной теоретической тарелке Н. Между этими параметрами существует соотношение.

Для изотермической хроматографии эффективность определяют по числу теоретических тарелок п

где Го.5 — ширина хроматографического пика, измеренная на половине его высоты и выраженная в единицах времени; //0.5 — ширина хроматографического пика, измеренная на половине его высоты и выраженная в единицах длины диаграммы регистратора.

Чем больше число теоретических тарелок, тем эффективнее работа хроматографической колонки. Их число может составлять от нескольких сотен до нескольких тысяч.

Предел обнаружения хроматографической колонки — наименьшее содержание контрольного вещества, определяемое хроматографическим методом с заданной доверительной вероятностью.

Градуировочная хроматографическая характеристика

зависимость выходного сигнала от количества определяемого компонента, устанавливаемая опытным или расчётным путём и выраженная в виде формул, таблиц или графиков.

Таким образом, род веществ определяют по времени удерживания в колонке, а концентрацию — по площади пика.

Идентификацию разделяемых компонентов проводят преимущественно двумя методами: с использованием веществсвидетелей и времени удерживания.

Когда эти методы применить невозможно, для идентификации компонентов разделяемой смеси используют индекс удерживания Ковача /. Он характеризует удерживание вещества X на колонке с определенной неподвижной фазой при температуре / °С относительно двух //-алканов с числом углеродных атомов п и п + р. Индексы удерживания рассчитывают линейной интерполяцией логарифмов исправленных параметров удерживания при соблюдении условия t_m < /_Я(Х) < t_{R (n +р)}

На практике применяют следующие методы расчета содержания компонентов: абсолютной градуировки (калибровки), внутренней нормализации и внутреннего стандарта. Все они основаны на измерении параметров пиков на хроматограмме: их площади или высоты. Чаще измеряют площадь пика (рис. 8.2).

Количество вещества, вымываемого из колонки, можно найти ио площади иод кривой элюирования.

где С — концентрация вещества; V— объём.

Рис. 8.2. Определение площади пика на хроматограмме.

Площади пиков на хроматограмме измеряют интегратором хроматографа. Это наиболее точный метод, так как ошибка измерения площади пика составляет менее 1%. При отсутствии интегратора площадь пиков рассчитывают, измеряя их высоту и ширину или полуширину. В этом случае погрешности определения площади пиков достигают нескольких процентов.

Принимая приближённо пик на хроматограмме за равнобедренный треугольник, можно рассчитать его площадь S'.

где h — высота пика; // - ширина пика у его основания; // ц — полуширина пика.

Основание пика на хроматограмме обычно несколько размыто, поэтому на практике измеряют не ширину ника /<, а его полуширину ц ½. При таком способе рассчитанная площадь пика меньше его действительной площади на несколько процентов. К тому же пики на хроматограмме в той или иной мере несимметричны. Симметричность пиков, оцениваемая, например, на высоте, равной 0,1 высоты пика, может учитываться при расчёте их площади.

При хроматографировании одновременно происходит разделение веществ и размывание хроматографических пиков разделяемых веществ, приводящее к ухудшению разделения.

Хроматографическое разделение основано на селективности сорбента и различии в термодинамических свойствах хроматографируемых веществ.

Разделение двух соседних пиков характеризуется разрешением Лу.

и селективностью а

На рис. 8.3 показаны хроматограммы смеси двух веществ при разной эффективности колонки и селективности сорбента.

Рис. 8.3. Зависимость степени разделения смеси двух веществ от эффективности колонки и селективности сорбента: а — высокая селективность, но плохая эффективность; б — высокая эффективность, но плохая селективность; в — высокая эффективность, достаточная селективность Температура очень сильно влияет на процессы хроматографического разделения. С ростом температуры увеличивается средняя скорость движения молекул в парогазовой фазе, в результате чего уменьшается разность скоростей между «убегающими» и «отстающими» частицами одного и того же компонента. Зоны разделяемых веществ (пик на хроматограммах) становятся более узкими, менее размытыми. В целом эффективность процесса разделения возрастает. Правда, с ростом температуры несколько снижается селективность хроматографической колонки.

При сравнительно низких температурах (200 — 250 °С) разделяют и определяют относительно лсгколстучис вещества: некоторые углеводороды, спирты, эфирные масла. При более высоких температурах (250 — 400 °С) разделяют и определяют фенолы, высокомолекулярные спирты, жирные кислоты.

Иногда процессы разделения проводят с программированием температуры, постепенно повышая температуру хроматографической колонки. При этом вначале отделяются более летучие, а затем — менее летучие компоненты смеси. Используют также хроматографию с программированием расхода газа-носителя.

Объём вводимой пробы зависит от специфики используемой методики и для жидких проб составляет 0,1−1 мкл. При большом объёме пробы обычно снижается эффективность хроматографической колонки.

Газохроматографические колонки представляют собой металлические или стеклянные трубки (прямые, изогнутые, спиральные) с внутренним диаметром 0,1−5 мм и длиной до нескольких метров (рис. 8.4). Они бывают наполненные (насадочные) и капиллярные.

Рис. 8.4. Хроматографические колонки: а — наполненные; б — капиллярные Наполненные колонки — металлические (часто — из нержавеющей стали) или стеклянные трубки длиной 1 — 5 м, с внутренним диаметром 1,5−5 мм, обычно изогнутые в виде спирали. Эти трубки заполняются насадкой — частицами твёрдой основы с нанесением на их поверхность тонкого слоя неподвижной фазы.

Капиллярные колонки обычно представляют собой металлические или стеклянные (из кварцевого стекла) трубки. Неподвижная жидкость (вакуумная смазка) наносится на внутреннюю поверхность капилляра путём прокачивания её раствора через капилляр и последующего испарения растворителя. Длина капиллярных колонок может составлять от нескольких десятков сантиметров до несколько сотен метров, внутренний диаметр — от 0,1 до 0,6 мм. Капиллярные колонки обеспечивают более высокую эффективность разделения многокомпонентных смесей.

Поглотители-сорбенты должны соответствовать ряду требований:

• — обладать максимально возможной поглотительной способностью;
• — быть устойчивыми (химически инертными) по отношению к той среде, в которой их применяют;
• — быть механически прочными.

Перечисленным требованиям отвечает сравнительно небольшое число сорбентов: оксиды кремния (силикагель, т. е. высушенная желатинообразная двуокись кремния) и алюминия, фторуглероды (тефлон, полихром), полистирол, цеолиты (алюмосиликаты щелочных и щелочно-земельных металлов), ионообменные смолы — иониты (органические полимеры, в макромолекулах которых содержатся ионизированные атомы или группы атомов, способные к ионному обмену), сополимеры стирола и дивинилбензола, а также стеклянные шарики, плавленый кварц, песок, графитированная сажа (карбохром), кристаллы хлорида натрия и г. д. Оптимальный размер зёрен чаще всего колеблется в пределах 0,1−5 мм, удельная поверхность может составлять 100 — 1.000 м²/г.

Процесс сорбции на зерне сорбента складывается из трёх составляющих: внешней диффузии, внутренней диффузии и собственно сорбции, которая происходит мгновенно.

Неподвижная фаза представляет собой обычную нелетучую, высококипящую, с низкой вязкостью жидкость различной полярности и химической природы — углеводороды (гликоли или их смеси) с числом углеродных атомов в цепи от 10 до 30, полисилоксаны (силиконы), полигликоли (например, полиэтиленгликольадипинат), полиэфиры, амиды, амины, жирные кислоты и др.

Масса жидкой неподвижной фазы обычно составляет от 1 до 20% от массы твёрдого носителя (чаще всего — от 5 до 10%).