Лекция № 6. Генетика бактерий и вирусов

Молекулярная биология, изучающая фундаментальные основы жизни, является в значительной степени детищем микробиологии. В качестве основных объектов изучения в ней используют вирусы и бактерии, а основное направление — молекулярная генетика основана на генетике бактерий и фагов.

Бактерии — удобный материал для генетики. Их отличает:

• — относительная простота генома (сопокупности нуклеотидов хромосом);
• — гаплоидность (один набор генов), исключающая доминантность признаков;
• — различные интегрированные в хромосомы и обособленные фрагменты ДНК;
• — половая дифференциация в виде донорских и реципиентных клеток;
• — легкость культивирования, быстрота накопления биомасс.

Общие представления о генетике.

Ген — уникальная структурная единица наследственности, носитель и хранитель жизни. Он имеет три фундаментальные функции.

• 1. Непрерывность наследственности — обеспечивается механизмом репликации ДНК.
• 2. Управление структурами и функциями организма — обеспечивается с помощью единого генетического кода из четырех оснований (А — аденин, Т — тимин, Г — гуанин, Ц — цитозин). Код триплетный, поскольку кодон — функциональная единица, кодирующая аминокислоту, состоит из трех оснований (букв).
• 3. Эволюция организмов — благодаря мутациям и генетическим рекомбинациям.

В узкоспециальном плане ген чаще всего представляет структурную единицу ДНК, расположение кодонов в которой детерминирует первичную структуру соответствующей полипептидной цепи (белка). Хромосома состоит из особых функциональных единиц — оперонов.

Основные этапы развития (усложнения) генетической системы можно представить в виде следующей схемы:

кодон ген оперон геном вирусов и плазмид хромосома прокариот (нуклеоид) хромосомы эукариот (ядро).

Генетический материал бактерий.

• 1. Ядерные структуры бактерий — хроматиновые тельца или нуклеоиды (хромосомная ДНК). У бактерий одна замкнутая кольцевидная хромосома (до 4 тысяч отдельных генов). Бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы (репликация ДНК) сопровождается делением клетки. Вегетативная репликация хромосомной (и плазмидной) ДНК обусловливает передачу генетической информации по вертикали — от родительской клетки — к дочерней. Передача генетической информации по горизонтали осуществляется различными механизмами — в результате конъюгации, трансдукции, трансформации, сексдукции.
• 2. Внехромосомные молекулы ДНК представлены плазмидами, мигрирующими генетическими элементами — транспозонами и инсервационными (вставочными) или IS — последовательностями.

Плазмиды — экстрахромосомный генетический материал (ДНК), более просто устроенные по сравнению с вирусами организмы, наделяющие бактерии дополнительными полезными свойствами. По молекулярной массе плазмиды значительно меньше хромосомной ДНК, содержат от 40 до 50 генов.

Их объединение в одно царство жизни с вирусами связано с наличием ряда общих свойств — отсутствием собственных систем мобилизации энергии и синтеза белка, саморепликацией генома, абсолютным внутриклеточным паразитизмом.

Их выделение в отдельный класс определяется существенными отличиями от вирусов.

• 1. Среда их обитания — только бактерии (среди вирусов, кроме вирусов бактерий — бактериофагов имеются вирусы растений и животных).
• 2. Плазмиды сосуществуют с бактериями, наделяя их дополнительными свойствами. У вирусов эти свойства могут быть только у умеренных фагов при лизогении бактерий, чаще же всего вирусы вызывают отрицательный последствия, лизис клеток.
• 3. Геном представлен двунитевой ДНК.
• 4. Плазмиды представляют собой «голые» геномы, не имеющие никакой оболочки, их репликация не требует синтеза структурных белков и процессов самосборки.

Плазмиды могут распространяться по вертикали (при клеточном делении) и по горизонтали, прежде всего путем конъюгационного переноса. В зависимости от наличия или отсутствия механизма самопереноса (его контролируют гены tra — оперона) выделяют конъюгативные и неконъюгативные плазмиды. Плазмиды могут встраиваться в хромосому бактерий — интегративные плазмиды или находиться в виде отдельной структуры — автономные плазмиды (эписомы).

Классификация и биологическая роль плазмид.

Функциональная классификация плазмид основана на свойствах, которыми они наделяют бактерии. Среди них — способность продуцировать экзотоксины и ферменты, устойчивость к лекарственным препаратам, синтез бактериоцинов.

Основные категории плазмид.

• 1. F — плазмиды — донорские функции, индуцируют деление (от fertility — плодовитость). Интегрированные F — плазмиды — Hfr — плазмиды (высокой частоты рекомбинаций).
• 2. R — плазмиды (resistance) — устойчивость к лекарственным препаратам.
• 3. Col — плазмиды — синтез колицинов (бактериоцинов) — факторов конкуренции близкородственных бактерий (антогонизм). На этом свойстве основано колицинотипирование штаммов.
• 4. Hly — плазмиды — синтез гемолизинов.
• 5. Ent — плазмиды — синтез энтеротоксинов.
• 6. Tox — плазмиды — токсинообразование.

Близкородственные плазмиды не способны стабильно сосуществовать, что позволило объединить их по степени родства в Inc — группы (incompatibility — несовместимость).

Биологическая роль плазмид многообразна, в том числе:

• — контроль генетического обмена бактерий;
• — контроль синтеза факторов патогенности;
• — совершенствование защиты бактерий.

Бактерии для плазмид — среда обитания, плазмиды для них — переносимые между ними дополнительные геномы с наборами генов, благоприятствующих сохранению бактерий в природе.

Мигрирующие генетические элементы — отдельные участки ДНК, способные определять свой перенос между хромосомами или хромосомой и плазмидой с помощью фермента рекомбинации транспозазы. Простейшим их типом являются инсерционные последовательности (IS — элементы) или вставочные элементы, несущие только один ген транспозазы, с помощью которой IS — элементы могут встраиваться в различные участки хромосомы. Их функции — координация взаимодействия плазмид, умеренных фагов, транспозонов и генофора для обеспечения репродукции, регуляция активности генов, индукция мутаций. Величина IS — элементов не превышает 1500 пар оснований.

Транспозоны (Tn — элементы) включают до 25 тысяч пар нуклеотидов, содержат фрагмент ДНК, несущий специфические гены, и два Is — элемента. Каждый транспозон содержит гены, привносящие важные для бактерии характеристики, как и плазмиды (множественная устойчивость к антибиотикам, токсинообразование и т. д.). Транспозоны — самоинтегрирующиеся фрагменты ДНК, могут встраиваться и перемещаться среди хромосом, плазмид, умеренных фагов, т. е. обладают потенциальной способностью распространяться среди различных видов бактерий.

«Острова» патогенности бактерий. Под островами патогенности принято понимать фрагменты ДНК, включающие дискретные гены вирулентности и обнаруживаемые только у патогенных микроорганизмов. Указанные фрагменты ДНК отличаются от основного (core) генома по % Г+Ц, фланкированы малыми прямыми нуклеотидными повторами (DR), способны распространяться среди одного или родственных видов бактерий путем естественной конъюгации, трансдукцией или трансформацией.

Мобильность островов патогенности (размеры от 10 до 200 kb — килобайт) связана с тем, что они могут входить в состав ДНК бактериофагов, транспозонов или плазмид (несут гены профаговых интеграз, транспозаз или IS — элементов) и интегрированы в районах хромосомы вблизи генов (3' областей локусов), кодирующих специфические тРНК. Это обеспечивает возможность горизонтального переноса генетической информации. Стабильность островов патогенности различна, поскольку гены вирулентности могут быть включены в состав бактериофага, транспозона или плазмиды. Интеграция, стабилизация и экспрессия генов вирулентности в составе островов патогенности определяет их основные функции — патогенность, метаболизм, лекарственную устойчивость, секреторные функции и др. Известны острова патогенности, несущие гены, контролирующие синтез адгезинов, инвазинов, токсинов (гемолизинов, цитотоксинов, энтеротоксинов, некротизирующего фактора и др.), усвоение ионов железа, синтез и транспорт эффекторных молекул из бактериальных клеток.

Понятие о генотипе и фенотипе.

Генотип — вся совокупность имеющихся у организма генов.

Фенотип — совокупность реализованных (т. е. внешних) генетически детерминированных признаков, т. е. индивидуальное (в определенных условиях внешней среды) проявление генотипа. При изменении условий существования фенотип бактерий изменяется при сохранении генотипа.

Изменчивость у бактерий может быть ненаследуемой (модификационной) и генотипической (мутации, рекомбинации).

Временные, наследственно не закрепленные изменения, возникающие как адаптивные реакции бактерий на изменения окружающей среды, называются модификациями (чаще — морфологические и биохимические модификации). После устранения причины бактерии реверсируют к исходному фенотипу.

Стандартное проявление модификации — распределение однородной популяции на две или более двух типов — диссоциация. Пример — характер роста на питательных средах: S — (гладкие) колонии, R — (шероховатые) колонии, M — (мукоидные, слизистые) колонии, D — (карликовые) колонии. Диссоциация протекает обычно в направлении S R. Диссоциация сопровождается изменениями биохимических, морфологических, антигенных и вирулентных свойств возбудителей.

Мутации — скачкообразные изменения наследственного признака. Могут быть спонтанные и индуцированные, генные (изменения одного гена) и хромосомные (изменения двух или более двух участков хромосомы).

Одновременно у бактерий имеются различные механизмы репарации мутаций, в том числе с использованием ферментов — эндонуклеаз, лигаз, ДНК — полимеразы.

Генетические рекомбинации — изменчивость, связанная с обменом генетической информации. Генетические рекомбинации могут осуществляться путем трансформации, трансдукции, конъюгации, слияния протопластов.

• 1. Трансформация — захват и поглощение фрагментов чужой ДНК и образование на этой основе рекомбинанта.
• 2. Трансдукция — перенос генетического материала фагами (умеренными фагами — специфическая трансдукция).
• 3. Конъюгация — при непосредственном контакте клеток. Контролируется tra (transfer) опероном. Главную роль играют конъюгативные F — плазмиды.

Генетика вирусов.

Геном вирусов содержит или РНК, или ДНК (РНК — и ДНК — вирусы соответственно). Выделяют позитивную (+) РНК, обладающую матричной активностью и соответственно — инфекционными свойствами, и негативную (-) РНК, не проявляющую инфекционные свойства, которая для воспроизводства толжна транскрибироваться (превращаться) в +РНК. Плюс — нити фнкционально соответствуют иРНК, т. е. способны транслировать закодированную генетическую информацию на рибосомы клетки хозяина, для минус — нитевых РНК — вирусов для трансляции необходим синтез комплементарной плюс — цепи. Механизмы репродукции различных вирусов очень сложные и существенно отличаются. Основные их схематические варианты представлены ниже.

• 1. вирионная (матричная) +РНК комплементарная — РНК (в рибосомах) вирионная +РНК.
• 2. — РНК вирусная (информационная) +РНК — РНК (формируется на геноме зараженной клетки).
• 3. однонитевая ДНК: +ДНК +ДНК — ДНК +ДНК — ДНК +ДНК +ДНК.
• 4. ретровирусная однонитевая РНК: РНК ДНК (провирус) РНК.
• 5. двунитевая ДНК: разделение нитей ДНК и формирование на каждой комплементарной нити ДНК.

Репликация как минус -, так и плюс — нитей РНК осуществляется через репликативную (комплементарную исходной) форму РНК под действием РНК — зависимой РНК — полимеразы. Репликативная форма РНК минус — нитевых вирусов (плюс — цепь) служит не только матрицей для синтеза дочерних вирусных РНК (минус — нитей), но и выполняет функции иРНК, т. е. передает информацию на рибосомы и обеспечивает трансляцию (синтез вирусных белков). У плюс — нитевых РНК — вирусов функцию трасляции выполняют ее копии, синтез которых осуществляется через репликативную форму (минс — нить) при участии вирусных РНК — полимераз.

У ретровирусов на матрице вирусной РНК при участии фермента обратной транскриптазы (ревертазы) образуется однонитевой ДНК — транскриптант, на нем формируется двунитевой ДНК — провирус, с которого через образование иРНК происходит реализация информации вирусного генома.

У ДНК — вирусов репликация вирусной ДНК происходит при участии клеточной ДНК — полимеразы. У однонитевых ДНК — вирусов вначале образуется комплементарная нить (репликативная форма), которая служит матрицей для дочерних молекул ДНК. У двунитевых ДНК — вирусов происходит разделение нитей ДНК и формирование комплементарных нитей. При участии ДНК — зависимой РНК — полимеразы синтезируются иРНК, которые поступают на рибосомы клетки, где синтезируются вирусспецифические белки.

Генофонд вирусов создается и пополняется из четырех основных источников:

двух внутренних (мутации, рекомбинации) и двух внешних (включение в геном генетического материала клетки хозяина, поток генов из других вирусных популяций).

Комплементация — функциональное взаимодействие двух дефектных вирусов, способствующее их репликации и горизонтальной передаче.

Фенотипическое смешивание — при заражении клетки близкородственными вирусами с образованием вирионов с гибридными капсидами, кодируемыми геномами двух вирусов.

Популяционная изменчивость вирусов связана с двумя разнонаправленными процессами — мутациями и селекцией, связанными с внешней средой как индуктором мутаций и фактором стабилизирующего отбора. Гетерогенность вирусных популяций — адаптационный генетический механизм, способствующий пластичности (устойчивости, приспособляемости) популяций, фактор эволюции и сохранения видов во внешней среде.

Генофонд вирусных популяций сохраняется за счет нескольких механизмов:

• — восстановления изменчивости за счет мутаций;
• — резервирующих механизмов (возможность перехода любых, даже негативных мутаций в следующую генерацию) — комплементация, рекомбинация;
• — буферных механизмов (образование дефектных вирусных частиц, иммунных комплексов и др.), способствующие сохранению вируса в изменяющихся внешних условиях.