Результаты и их обсуждение

Подбор твердой питательной среды для выявления микобактерий из аквариумной воды методом прямого высева.

Многочисленные методы выделения микобактерий из воды и других объектов внешней среды традиционно начинают со стадий концентрирования и деконтаминации с целью подавить жизнедеятельность сопутствующих бактерий. Для этого используют 2−4% NaOH, антибиотики, цетримид, цетавлон, H₂SO₄ и другие санирующие агенты, агрессивные в отношении бактерий. Эти воздействия, безусловно, снижают жизнеспособность всех бактерий, включая и выделяемых микобактерий. Процедуры контаминации и концентрирования включают центрифугирование бактериальной массы. Микобактерии имеют гидрофобные оболочки, поэтому центрифугирование приводит к слипанию, агрегации и в конечном итоге потере микобактерий, особенно если они находятся в низкой концентрации. По этим причинам мы решили не проводить процедуры деконтаминации и центрифугирования при выделении микобактерий из аквариумной воды, то есть сразу осуществить прямой высев воды на питательные среды, рекомендованные для выявления микобактерий.

Основная питательная среда для выделения микобактерий из различных по типу образцов, рекомендуемая во всех руководствах и основных обзорах (Le Dantec, 2002; Thomson et al., 2013) — это среда Lцwenstein-Jensen с малахитовым зеленым, подавляющим рост сопутствующих бактерий и грибов-микромицетов. Классическая пропись этой среды содержит малахитовый зеленый в концентрации 250 мкг/мл. В то же время по данным Джонса и Фалкинхама (Johnes, Falkinham, 2003) изоляты микобактерий из неклинических образцов проявляют различную, зачастую низкую устойчивость к этому красителю — от 6 мкг/мл до 120 мкг/мл.

Таким образом, становится очевидным, что классическая среда Lцwenstein-Jensen вероятнее всего, предназначена для выделения наиболее устойчивых к красителям, медленно растущих патогенных микобактерий (M. tuberculosis и M. avis). Применение малахитового зеленого для выделения микобактерий из аквариумной воды, может привести к закономерной их потере.

Действительно, наши первые попытки высева аквариумной воды на классическую среду Lцwenstein-Jensen с малахитовым зеленым по стандартной прописи дали хороший рост разноцветных бактериальных клонов (рис. 1А). Большинство колоний были в большей или меньшей степени слизеобразующими. Тем не менее, при их рассеве с целью очистки и получения чистых клонов было установлено, что большинство колоний смешанные, а отсеянные клоны оказались нежизнеспособными и погибали на 2−3 пассаже. То есть выделение микобактерий из аквариумной воды на среде Lцwenstein-Jensen с малахитовым зеленым оказалось невозможным. Поэтому было решено попытаться исключить малахитовый зеленый из состава питательной среды для первичного высева.

Анализируя прописи питательных сред для микобактерий, мы предположили, что цельный гомогенат куриных яиц, предложенный к использованию в среде Lцwenstein-Jensen в начале ХХ века, можно заменить питательным бульоном и желточной эмульсией. Это сделало бы среду более однородной, что важно при поверхностном посеве шпателем, и более воспроизводимой при ее изготовлении в лабораторных условиях.

Для проверки нашей модификации среды Lцwenstein-Jensen мы провели серию высевов аквариумной воды на среду Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией без малахитового зеленого в сравнении с классической питательной средой для микобактерий — агаром MiddleBrook (в оригинальной прописи имеется малахитовый зеленый в минимальной концентрации — 1 мкг/мл) (Middlebrook, Cohn, 1958). В этом же эксперименте аквариумную воду высевали на среду Lцwenstein-Jensen без малахитового зеленого с желтками с добавлением Твина 80 для диспергирования клеточных комков с целью получения большего количества чистых клонов. В качестве дополнительных контролей высев проводили также на стандартный питательный агар (Оболенск) и среду Lцwenstein-Jensen с малахитовым зеленым в разной концентрации. Полученные данные по численности выявленных микроорганизмов представлены в табл. 1. Внешний вид посевов представлен на рис. 1.

Из представленных данных видно, что среда Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией без малахитового зеленого дает численность и разнообразие морфотипов колоний, соизмеримые с агаром Middlebrook, рекомендованным для выделения микобактерий. Добавление в среду Твина 80 не увеличивает выявляемую численность и разнообразие морфотипов колоний.

Введение

в состав среды малахитового зеленого уже с 5 мкг/мл резко снижает численность и разнообразие колоний, увеличивает проблемы очистки клонов за счет образования слизи и увеличения доли смешанных колоний.

Питательный агар дает практически туже численность колоний, что и среда Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией без малахитового зеленого, но при этом колонии более мелкие и менее выразительные по морфологии. Можно предположить, что на этой среде медленно растущие микобактерий будут не выявлены. На основании всего вышеизложенного для выделения микобактерий из аквариумной воды мы остановились на среде Lцwenstein-Jensen с желточной эмульсией без малахитового зеленого, по качеству и селективности не уступающей коммерческой среде Middlebrook.

Таблица 1. Численность микроорганизмов, выявленных в воде аквариума № 19, при высеве на различные по составу питательные среды*

*- Высев был произведен 26.01.2016, на следующий день после очистки аквариума.

А.

Б

В

Рис. 1. Внешний вид посевов аквариумной воды на питательную среду Lцwenstein-Jensen с цельными куриными яйцами (А), на ту же среду в нашей модификации с желточной эмульсией без малахитового зеленого (Б) и на Middlbrook агар (В)