В современных условиях отмечается снижение иммунологической реактивности населения в целом (по некоторым данным до 70% людей имеют отклонения в деятельности иммунной системы) и, соответственно, повышение заболеваемости острыми и хроническими болезнями, обусловленными оппортунистическими микроорганизмами [9]. Кроме того, возрастает частота аллергических [60], онкологических [46], аутоиммунных [86], а в нашей стране также острых и хронических инфекционных заболеваний, вызываемых облигатными патогенами, например дифтерия и туберкулез [41]. Поэтому, возникает необходимость в расширении арсенала лекарственных средств, позволяющих корректировать нарушения иммунного статуса организма, и не оказывающих побочных эффектов. Спектр иммунотропных средств и препаратов постоянно расширяется. Потребность в этом продиктована с одной стороны конкретной клинической ситуацией, когда вмешательство в патологический процесс требует комплексного воздействия: сочетания противовирусного и иммуностимулирующего влияния (подобное воздействие оказывают например интерфероногены, препараты интерферона) — противобактериального и иммуностимулирующего (рулид, диуцифон) — противовоспалительного и иммуностимулирующего (галавит), а с другой стороны — необходимость получения выраженного клинического эффекта при минимальном негативном токсическом влиянии на организм [74]. Все, сказанное выше, обосновывает важность и необходимость работ, направленных на создание отечественных лекарственных средств, обладающих иммунотропной активностью при минимальной токсичности, конкурентоспособных на мировом фармацевтическом рынке. Это позволит обеспечить население и учреждения здравоохранения России эффективными и недорогими лекарственными препаратами и создаст условия для независимости от импорта иммуномодулирующих лекарственных средств.
Объектами исследования данной работы являются четыре соединения новой группы синтетических веществ МАК, представленных хиральными кватернатами 3-оксихинуклидина: МАК-15, МАК-17, МАК-25 и МАК-30. Вещества МАК-17, МАК-25 и МАК-30 являются структурными аналогами: МАК-17 8(+)-изомеромМАК-30 11(-)-стереоизомером, а МАК-25 рацематом. От МАК-17, МАК-25 и МАК-30 вещество МАК-15 отличается наличием в положении 3 гетроцикла атома хлора, а не гидроксильной группы. Технология синтеза веществ группы МАК была разработана в Государственном научно-исследовательском институте органической химии и технологии (ФГУП «ГосНИИОХТ», г. Москва) к.х.н. И. JI. Михалевой и д.х.н. Д. И. Панковым. Эти соединения характеризуются низкой токсичностью, высокой стабильностью в водных растворах и относительно простой технологией химического синтеза. Основанием для исследования иммунотропных свойств этой группы веществ послужили предварительные данные, полученные в ФГУП «ГосНИИОХТ», о разносторонней биологической активности некоторых представителей хиральных кватернатов 3-оксихинуклидина [42].
Исследования иммунотропной активности проводились в соответствии с методическими указаниями Фармакологического комитета Российской Федерации по изучению соответствующих свойств лекарственных препаратов [20,31].
Цель представленной работы: обосновать возможность использования соединения из группы хиральных кватернатов 3-оксихинуклидина в качестве основы для создания нового иммуномодулирующего препарата с противоопухолевой активностью.
Задачи, решению которых посвящена эта работа, сводятся к следующему:
1. Провести сравнительное исследование четырех производных хиральных кватернатов 3-оксихинуклидина in vitro с целью выбора вещества, обладающего иммунотропной активностью.
2. Изучить влияние соединения, выбранного из ряда МАК, на противоопухолевую цитотоксическую активность МНК периферической крови здоровых доноров.
3. Оценить на животных с привитыми опухолями противоопухолевую активность соединения ряда МАК, обладающего иммунотропными свойствами.
4. Исследовать воздействие хиральных кватернатов 3-оксихинуклидина на фагоцитарные свойства полиморфноядерных нейтрофильных лейкоцитов периферической крови здоровых доноров.
5. Определить бактериостатические свойства соединений ряда МАК.
Положения, выносимые на защиту:
1. Из четырех исследованных производных 3-оксихинуклидина (МАК-15, МАК-17, МАК-25, МАК-30) иммунотропной активностью обладает только цетилбромид Щ-)-3-оксихинуклидина (МАК-30). Это соединение за счет стимуляции врожденного звена иммунитета проявляет выраженную противоопухолевую активность.
2. Соединения, относящиеся к хиральным кватернатам 3-окси-хинуклидина, проявляют антимикробную активность, подавляя рост патогенных и условно-патогенных штаммов различных видов микроорганизмов на плотных питательных средах.
Научная новизна представленной работы:
1. Проведено исследование иммунотропной активности нового ряда химических соединений — хиральных кватернатов 3-оксихинуклидина.
2. Установлено, что вещество МАК-30 — представитель группы хиральных кватернатов, наряду с иммунотропной, обладает противоопухолевой и антимикробной активностью.
3. Выявлено, что стимуляция клеточного иммунитета под воздействием МАК-30 проявляется только в условиях совместной инкубации лимфоцитов и опухолевых клеток.
4. Показано, что вещество МАК-30 стимулирует фагоцитарную активность нейтрофильных лейкоцитов.
Научно-практическая значимость: полученные в работе данные расширяют представления о механизме стимуляции противоопухолевого иммунитета при действии иммунотропных препаратов.
Бромид 1 -гексадецил-11(-) — З-окси-1-азониабицикло [2.2.2] октана (МАК-30) может рассматриваться как наиболее перспективное соединение ряда хиральных кватернатов 3-оксихинуклидина для создания на его основе иммуномодулирующего препарата, обладающего противоопухолевой активностью.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, пяти глав экспериментальных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 102 ссылки, и двух приложенийиллюстрирована 28 таблицами и 7 рисунками. Объем диссертации — 144 страницы машинописного текста.
ВЫВОДЫ.
1. Среди четырех исследованных веществ группы хиральных кватернатов 3-оксихинуклидина иммунотропной активностью обладает только цетилбромид R (-) — 3-хинуклидинола (МАК-30).
2. Вещество МАК-30 не оказывает прямого патогенного действия на изолированные культуры лейкоцитов человека и опухолевых клеток.
3. МАК-30 в диапазоне концентраций Ю^-Ю" 4 М стимулирует функциональную активность естественных киллерных клеток крови, что сопровождается увеличением концентрации цитокинов (ИЛ-1|3, ИЛ-2, ИНФу, ФНОа) в культуральной среде.
4. МАК-30 в дозах 0,5−0,005 мг/кг проявляет противоопухолевую активность, вызывая торможение роста опухолей различного генеза (меланомы В-16, САО-1) и увеличивая продолжительность жизни лабораторных животных.
5. Соединение МАК-30 в концентрации достоверно (в 2−3 раза) усиливает фагоцитарную активность сегментоядерных нейтрофилов крови человека.
6. Вещества МАК-17, МАК-25 и МАК-30 обладают выраженной антимикробной активностью в отношении клинических изолятов и типовых коллекционных штаммов различных видов бактерий: Е. faecalis, S. aureus, S. epidermidis, E. coli.
1.4.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
.
Несмотря на представленный широкий спектр существующих иммунотропных лекарственных средств, обладающих, в частности, свойствами иммуномодуляторов, потребность в новых препаратах остается значительной. Объяснением этому служат множество факторов: все возрастающая общемировая тенденция роста аллергических и канцерогенных заболеваний, пандемическое распространение СПИД, неблагоприятная экологическая ситуация и сопровождающие все эти процессы вторичные иммунодефициты. Для того чтобы успешно противостоять развитию данных патологий, современному врачу необходим внушительный арсенал лекарственных средств. От современного иммуностимулирующего препарата требуется способность оказывать достоверное корректирующее влияние на оптимизацию иммунного статуса, не влияя при этом негативно на системные показатели организма. Отсутствие эмбриотоксического, мутагенного и тератогенного действия, острой и кумулятивной токсичности становятся необходимыми условиями для клинического применения лекарственных средств указанного действия. Кроме того, фактором, стимулирующим исследования в данной области, является потребность в зависимости от особенностей патологического процесса в комплексном терапевтическом подходе. В данном аспекте приветствуется создание фармацевтических препаратов воздействующих одновременно на организм, усиливая его защиту, и на патоген, обезвреживая и элиминируя его из организма. Примерами такого подхода являются препараты, сочетающие иммуномодулирующее воздействие с противоопухолевым, противовирусным, антимикробным, противовоспалительным, антигельминтным эффектами.
Таким образом, потенциал создания иммуномодулирующих средств еще не исчерпан, и потребность в разработке новых препаратов, особенно отечественного производства, сочетающих высокую эффективность с отсутствием токсигенности, и, желательно, недорогих, остается высокой.
Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. II.1. ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ МАТЕРИАЛЫ.
II.1.1. Список использованных растворов, сред, тестовых систем.
Характеристика исследуемых соединений.
Исследуемые вещества ряда хиральных кватернатов 3-оксихинуклидина (МАК-15, МАК-17, МАК-25, МАК-30) были синтезированы в ФГУП «ГосНИИОХТ» (г. Москва) к.х.н. И. Л. Михалевой и д.х.н. Д. И. Панковым. н.
CI* Вг" У.
С1бнзз-" .
МАК-15 цетилбромид S (-) — 3-хлорхинуклидина).
О) н он.
Вг" .
Вг.
Вг.
С1бНзз-н.
С16Н33″ .
С1бнзз-Н.
МАК-17 цетилбромид S (+) — 3-хинуклидинола).
МАК-25 цетилбромид RS (±) — 3-хинуклидинола).
МАК-30 цетилбромид R (-) — 3-хинуклидинола).
2).
3).
4).
Из этих соединений готовили растворы, используя физиологический (0,9%) раствор хлорида натрия («Нижфарм», Россия). В исследованиях, описанных в настоящей работе, изучалась активность соединений МАК следующего диапазона конце1гграций — 10″ п-10~3 М. Растворы стерилизовали методом дробной пастеризации [48]. Среда RPMI-1640.
1 л среды содержит 324 мг глутамина и 25 мМ HEPES («ПанЭко», Россия). Перед применением в среду добавляли сыворотку эмбриональную телячью («HyClone-Perbio», США) — 0,5 мл на 100 мл среды Физиологический раствор («Нижфарм», Россия) ДМСО — диметилсульоксид («ПанЭко», Россия) Раствор МТТ.
Концентрация МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид) («ПанЭко», Россия) — 5 мг в 1 мл физиологического раствора Раствор трипанового синего.
Концентрация трипанового синего («ПанЭко», Россия) — 2 мг на 1 мл физиологического раствора.
Агар Мюллера — Хинтона («Sanofi Diagnostics Pasteur», Франция) Суспензия латексных частиц («ПанЭко», Россия) 50 000 в 1 мкл физиологического раствора (латексные частицы диаметром 1,2−1,4 мкм).
II. 1.2. Характеристика клеточных и бактериальных культур.
Мононуклеарные лейкоциты, выделяли из цитратной крови здоровых доноров, полученной из отделения переливания крови РОНЦ РАМН им. Н. Н. Блохина, г. Москва.
Клеточные культуры линии К-562, перевиваемых экспериментальных моделей меланомы В-16, аденокарциномы СаО-1, карциномы Эрлиха были любезно предоставлены сотрудником лаборатории клеточного иммунитета.
РОНЦ РАМН им. Н. Н. Блохина Доненко Ф. В.
Чистые культуры патогенных и условно-патогенных клинических изолятов бактериальных штаммов, а также типовых коллекционных штаммов АТСС (American Type Culture Collection) были любезно предоставлены Спириной Т. С. (РОНЦ РАМН им. Н. Н. Блохина, г. Москва). Культуры клинических изолятов были выделены из патологического материала (фекалии, мокрота, моча, выделения из операционных ран) стационарных больных (№№ амб. карт 20 741/3, 20 544/3, 19 755/1, 21 002/1, 20 540/3, 22 441/1, 6504/2, 20 447/3, 14 755/4, 20 621/3, 19 844/1) и идентифицированы как относящиеся к группе патогенных. Кроме того, с предметов окружающих больных в стационаре (воздух, кожа рук медицинского персонала) были выделены микроорганизмы, относящиеся к санитарной группе условно-патогенных штаммов. В настоящем исследовании использовали следующие виды микроорганизмов: P. aeruginosa, Е. coli, S. aureus, Е. faecalis, S. epidermidis, A. geminis. Степень антибиотикорезистентности патогенных и условно-патогенных штаммов была установлена в отдельной серии экспериментов. Указанные исследования проведены совместно с врачом — бактериологом Спириной Т. С. (РОНЦ РАМН им. Н. Н. Блохина, г. Москва). Из типовых коллекционных штаммов в настоящем исследовании использовали штаммы S. epidermidis АТСС 12 228, S. aureus АТСС 25 923, Е. coli АТСС 29 212, Е. faecalis АТСС 35 218.
II.1.3. Лабораторные животные.
Исследование проведено на 386 мышах линий С57В1 и СВА весом 20−25 г.
II. 2. ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ МЕТОДЫ.
Во всех проведенных исследованиях результаты опытных проб (групп) сравнивали с аналогичным показателем, полученным в контрольной пробе (группе). В контрольную пробу (животным контрольной группы) вводили вместо раствора исследуемого вещества стерильный физиологический раствор хлорида натрия.
II.2.1. Методы выделения клеток.
МНК выделяли из венозной крови центрифугированием в градиенте плотности фиколла — урографина согласно методике [35]. После центрифугирования собирали пипеткой слой клеток, содержащий МНК, разбавляли в 3−4 раза средой RPMI-1640, перемешивали и центрифугировали 5 минут в режиме 400 g при температуре 20±2 °Снадосадочную жидкость сливали. Клетки ресуспендировали и добавляли новую порцию среды RPMI-1640. Отмывание МНК от фиколла повторяли еще дважды. После заключительного центрифугирования супернатант сливали, к осадку прибавляли примерно 1 мл среды RPMI-1640. Так как для иммунологических исследований используют только живые клетки, их количество определяли пробой с раствором трипанового синего [48]. Проводили подсчет клеток с использованием камеры Горяева [81], после чего доводили концентрацию МНК во взвеси до требуемого рабочего разведения.
Для проведения необходимых исследований взвесь клеток линии К-562 готовили следующим образом. Клеточную культуру центрифугировали в конической пластиковой пробирке 5 минут в условиях 400 g при температуре 20±2 °С, надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли примерно 1 мл среды RPMI-1640, ресуспендировали и проводили подсчет концентрации живых клеток с трипановым синим в камере Горяева [81]. Далее доводили концентрацию опухолевых клеток до рабочего разведения — 50 000 кл/мл.
II. 2.2. МТТ-колориметрический цитотоксический тест.
Цитотоксическую активность естественных киллерных клеток определяли в цитотоксическом тесте [81] при различном соотношении клетокмишеней и клетокэффекторов (КМ:КЭ). 1:10 50 ООО: 500 ООО клеток в 1 мл среды.
1:5 50 ООО: 250 000 клеток в 1 мл среды.
1:2 50 000: 100 000 клеток в 1 мл среды.
Затем в каждую лунку 96-планшета к 180 мкл клеточной взвеси добавляли 20 мкл исследуемого вещества МАК в диапазоне концентраций 10'11 -10'3 М (т. е. в лунке — десятикратное разведение), в контрольные пробы вместо МАК добавлялся физиологический раствор. Взвесь клеток МНК (КЭ) и К-562 (КМ) инкубировали с исследуемыми растворами МАК в течение 1 суток в трех параллельных лунках для каждой концентрации вещества МАК при температуре 37 °C в условиях 5% концентрации СОг. По окончании срока инкубации интенсивность митохондриальной ферментативной (дыхательной) активности культивируемых клеток, определялась с помощью МТТ-колориметрического метода [81].
II. 2.3. Иммуноферментный анализ.
Было исследовано изменение концентрации ИЛ-ip, ИЛ-2, ИНФу, ФНОа в культуральной среде под действием соединений группы МАК. Коинкубацию клеток осуществляли согласно методике [81] при соотношении клеток-мишеней и клеток-эффекторов равных 1:10, 1:5, 1:2 (исследование иммуномодулирующего действия МАК-30) — 1:10 (выявление иммунотропной активности среди четырех представителей группы МАК). Затем в каждую лунку 96-планшета к 180 мкл клеточной взвеси добавляли 20 мкл исследуемого раствора МАК. Взвесь клеток МНК (КЭ) и К-562 (КМ) инкубировали с исследуемыми растворами в течение 1 суток для исследования стимулированного выброса ИЛ-ip, ИНФ-у, ФНО-а и в течение 2 суток для ИЛ-2 в трех параллельных лунках для каждой концентрации раствора МАК при температуре 37 °C в условиях 5% концентрации СОгПосле окончания инкубации отбирали культуральную среду, не захватывая клетки. До исследования пробы супернатанта хранили охлажденными при температуре —12 °С.
Количественное определение цитокинов в супернатанте проводили твердофазным иммуноферментным методом сэндвич-ИФА [73] с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента с использованием коммерческих тест — систем для каждого вида цитокинов («Biosourse», Europe S. A.) (TNF-a — кат. № КНС3012- IL-ip — кат. № 4 173 011- IL-2 — кат. № 417−3020- IFy — кат. № 417−2091).
II. 2.4. Изучение противоопухолевых свойств тестируемых веществ in vivo.
В опытах in vivo исследована противоопухолевая активность МАК-30 относительно роста перевитых опухолей различного генеза (меланомы В-16, аденокарциномы СаО-1, карциномы Эрлиха) и изменения времени жизни лабораторных мышей под влиянием этого вещества [95]. Для прививания опухоли суспензию опухолевых клеток в физиологическом растворе в дозе 2 ООО ООО клеток на мышь вводили в организм животного: меланомы В-16 и аденокарциномы яичников СаО-1 — подкожно, а опухоли Эрлиха — внутрибрюшинно. Каждая группа включала не менее 9 животных.
Исследования, включающие определение интервала терапевтических доз МАК-30, проводили на 162 мышах линии СВА с перевитой опухолью меланомы В-16. Было сформировано 5 опытных групп животных и 1 контрольная. МАК-30 вводили по 0,2 мл подкожно в дозах 0,4, 0,04, 0,004, 0,0004 и 0,4 мг/кг соответствующей опытной группе мышей на 2, 4, 6, 8 и 10 сутки после прививания опухоли. Мышам контрольной группы вместо раствора МАК вводили физиологический раствор. Результат оценивали на 12 сутки, сравнивая объем опухоли у мышей различных групп с аналогичным показателем в контрольной группе, принятым за 0%.
Опыты, демонстрирующие влияние вещества МАК-30 в дозе 0,005 мг/кг на продолжительность жизни мышей с перевитой опухолью Эрлиха проводили на 20 мышах линии СВА. МАК-30 вводили по 0,2 мл подкожно за 3 суток до трансплантации опухоли, а также на 1, 3, 5, 7, 10, 12, 14, 15, 17, 18 и 20 сутки после нее животным опытной группы. Результат опыта учитывали в течение 30 суток после перевивки опухоли мышам, сравнивая количество умерших животных в опытной и контрольной группах.
Исследование изменения выживаемости мышей с перевитой меланомой линии В-16 проводили на 54 мышах линии С57В1. Раствор МАК-30 в дозе 0,005 мг/кг (0,2 мл) подкожно вводили ежедневно в течение 10 дней после трансплантации животным опухоли. Результат учитывали в течение 25 суток после перевивки опухоли, сравнивая количество выживших животных в опытной и контрольной группах.
Противоопухолевую активность также изучали на 150 мышах-самцах линии СВА, которым перевивали аденокарциному яичников СаО-1. Опухоль была получена на потомстве мышей-самок линии СВА, которым во время беременности вводили эстрогены. Для проведения 1 экспериментальной серии формировали 3 опытных группы и 1 контрольную группу. Мышам начинали вводить МАК-30 через 24 часа после прививания опухолевых клеток. Вводили растворы подкожно по 0,2 мл. Всего было сделано 7 инъекций — на 1, 3, 5, 7, 9, 11 и 13 сутки. Растворы изучаемого вещества вводили в трех дозах: 0,005 мг/кг, 0,05 мг/кг, 0,5 мг/кг. В контрольной группе животным подкожно вводили по той же схеме по 0,2 мл физиологического раствора хлорида натрия. Оценку действия исследуемого вещества на рост опухоли проводили по регистрации различий в скорости роста объема видимой опухоли и среднего веса животных опытных и контрольной групп. Объем опухоли измеряли на 10,12 и 15, а вес — на 10 и 15 сутки после перевивки САО-1.
11.2.5. Исследование воздействия тестируемых веществ на фагоцитарную активность нейтрофилов крови.
Исследовали изменение показателей фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов цельной стабилизированной цитратом натрия крови здоровых доноров (фагоцитарное число и фагоцитарный индекс) в результате стимуляции их МАК-30 (время инкубации крови с веществом -6 ч, при постоянном встряхивании при температуре 37°С) [48]. В качестве объектов фагоцитоза использовали суспензии гранул латекса и S. aureus (5×106 кл/мл) в физиологическом растворе. Готовили мазок, окрашивали его по Романовскому-Гимзе и смотрели с иммерсией. В каждом мазке посчитывали не менее 200 нейтрофилов, вычисляя среди них процент клеток, содержащих фагоцитированные объекты (ФП), а в 20−25 фагоцитах подсчитывали количество бактерий, подвергнувшихся ферментации (ФЧ).
11.2.6. Луночно — диффузионный метод.
Принцип луночно-диффузионного метода основан на феномене ингибиции соединением поверхностного видимого роста микроорганизмов на плотной (агаровой) питательной среде. Градиент концентрации препарата в питательной среде создается в результате его диффузии из лунки, содержащей раствор вещества в определенной концентрации. Раствор МАК вносили в лунку немедленно после посева культуры тестового штамма микроорганизма. При этом, практически одновременно, начинаются два процесса: диффузия вещества из лунки и рост микроорганизмов на поверхности среды. С практической точки зрения важно то, что от лунки к периферии происходит движение «фронта» концентрации вещества равной его МИК (минимальной ингибирующей концентрации), оказывающей бактерицидное действие на исследуемый микроорганизм.
Согласно методике проведения исследования [69] готовили инокулят 18ч агаровой бактериальной культуры (среда — агар Мюллера Хинтона), которую доводили до мутности стандарта 0,5 McFarland на денситометре физиологическим раствором. Приготовленный таким образом инокулят наносили в количестве 1 мл на поверхность чашки Петри с питательной средой, равномерно распределяли по поверхности покачиванием и удаляли избыток жидкости пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивали при комнатной температуре в течение 10−15 мин. Растворы МАК помещали в лунки диаметром 6 мм и глубиной 3 мм. Чашки термостатировали при температуре 37 °C.
Учет результатов проводили через 1 сутки. Чашки помещали кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом 45°. Диаметр зон задержки роста с учетом диаметра лунки измеряли с точностью до 1 мм. Интерпретацию полученных данных проводили, опираясь на наличие и величину зон ингибиции роста, позволяющие отнести данный штамм культуры микроорганизма к одной из трех категорий: «чувствительный», «промежуточный», «устойчивый» к действию исследуемого соединения группы МАК:
• При отнесении штамма к категории «чувствительный» (++) отмечали сливной (полный) лизис (незначительный рост культуры в зоне лизиса) — его диаметр более 10 мм.
• При отнесении штамма к категории «промежуточный» (+) отмечали почти полное отсутствие зоны лизиса — диаметр меньше или равен 10 мм, но более 6 ммфеномен «шагреневой кожи».
• При отнесении штамма к категории «устойчивый» (-) — отсутствие видимого лизиса.
II.2.7. Метод серийных разведений.
Для выявления концентраций МАК, ингибирующих рост бактериальных культур тест-штаммов на питательной среде, использовали метод последовательного разведения МАК в питательной среде [48]: исследуемые растворы веществ десятикратно разбавляли расплавленным агаром Мюллера-Хинтона и выливали в чашку Петрипосле застывания агара на его поверхность, разделенную на 4 сектора, наносили ватным тампоном суспензию тест-штаммов (10 микробных тел в 1 мл физиологического раствора), термостатировали 20−24 ч, затем с помощью автоматического счетчика колоний подсчитывали количество колоний в нескольких квадратах (1 см2). Определяли МИК исследуемых соединений.
II.3. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ.
Поскольку количество учитываемых проб в каждом опыте in vitro было сравнительно небольшим, а специфика получаемых в результате экспериментов данных предполагала их большой разброс, было решено в соответствии с рекомендациями [15,64] проводить оценку первичных результатов с использованием непараметрических статистических критериев.
Обработка первичных данных проводилась на ПК с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 фирмы StatSoft Inc. (США) (модули «Basic Statistics/Tables», «Nonparametrics», «Probability Calculator», «ANOVA») [62]. Дальнейшая обработка и интерпретация результатов осуществлялись в соответствии с рекомендациями, опубликованными в обзорах [34,61,67].
Применялся следующий алгоритм обработки первичных данных:
1. Начинали с обработки первичных данных, согласно цели исследования.
• для обработки данных по исследованию стимулированной цитотоксичности ЕК-клеток, получаемых в форме показателей оптической плотности (ОП) раствора, находили значение двух показателей: индекса цитотоксической активности (ИЦА) для сравнения физиологической активности клеток в опытной и контрольной пробах, т. е. характеристика биологического объекта — формула (5) — и показателя индукции цитотоксичности (ЛИЦ), иллюстрирующего влияние исследуемого вещества на физиологическую характеристику, т. е. характеристика соединения — формула (6).
ИЦА, % = (1- (5).
ОПоп — оптическая плотность среды в лунке, содержащей раствор исследуемого вещества, клетки-мишени и клетки-эффекторы;
ОПю — оптическая плотность среды в лунке, содержащей клеткиэффекторы и раствор исследуемого вещества;
ОПкм — оптическая плотность среды в лунке, содержащей клетки — мишени и раствор исследуемого вещества.
ИЦАмак.
ПИЦ,%=(ЙЦА^ -1)*100 (6).
ИЦАМак — индекс цитотоксической активности клеток, индуцированной МАК;
ИЦАф.р. — индекс цитотоксической активности клеток, инкубированных в присутствии физиологического раствора.
• для обработки первичных данных исследования цитокин индуцирующей активности изучаемых веществ, также являющихся показателями оптической плотности среды, находили значение концентрации цитокина (КЦ (пкг/мл)) по показателю ОП, используя калибровочную кривую (ее строят с помощью показателей ОП стандартных растворов, поставляемых вместе в каждой тестсистемой), т. е. характеристику биологического объекта, а затем высчитывали значение цитокин-индуцирующей активности (ЦИА) веществ, т. е. характеристику химического соединения — формула (7). ЦИА (пкг/мл)=КЦмак-КЦф.р (7).
KLW ~~ концентрация в среде цитокина (пкг/мл), индуцированного коинкубацией с клетками раствора МАККЦф. р — концентрация цитокина в среде (пкг/мл), где клетки инкубировали в присутствии физиологического раствора. • для оценки токсичности изучаемых веществ, первичные данные, полученные как оптическая плотность раствора, преобразовывали в показатель индекса токсичности вещества (ИТВ), согласно формуле (8).
ИТВ, %=(1-)*100 (8).
ОПмак — показатель оптической плотности среды в лунке, где клетки инкубировали в присутствии раствора МАКОПф. р — показатель оптической плотности среды в лунке, где клетки инкубировали в присутствии физиологического раствора. Результат большинства экспериментов представлен в виде медианы (Md) и значений 25 и 75 квартилей (25%^75%). Эти результаты, полученные после статистической обработки экспериментальных данных опытных проб, содержащих вещество группы МАК, сравнивали с показателями контрольной пробы с использованием критерия Данна. Заданный уровень достоверности отличия опытной пробы от контрольной — р<0,01, введенное значение учитываемой ошибки примененных методов было предварительно экспериментально определено (максимальное значение 30%). Медианное значение эффективной концентрации, вызывающей увеличение определенного показателя на 30% (ЕСзо) по сравнению с действием плацебо рассчитывали в соответствии с рекомендациями А. Е. Платонова [61] после логарифмической аппроксимации кривой доза-эффект, учитывая границы доверительного интервала между 25% и 75% квартилями. Сравнение величин ЕСзо различных веществ осуществляли, используя дисперсионный анализ (р<0,01).Корреляционный анализ проводили, рассчитывая критерий Спирмена (к) каждого показателя (р<0,05).
При исследовании способности веществ группы МАК влиять на функциональную активность нейтрофилов крови, результаты были представлены в виде медианного значения ФЧ (Md), а также размаха соответствующих данных (min-rmax). Сравнения с контрольной группой проводили, используя критерий Данна (р<0,01).
После статистической обработки экспериментальных данных опытов in vivo, результаты были представлены в виде среднего значения и половинной величины доверительного интервала (M±s), при этом заданное учетное значение р<0,05. Сравнение с показателями контрольной группы осуществляли, используя однофакторный дисперсионный анализ. Таким же образом были представлены и оценены результаты опыта по изучению стимулированной МАК-30 фагоцитарной активности нейтрофилов крови in vitro ФП (M±s) при р<0,01.
Для оценки бактерицидной активности среди первичных данных, являющихся качественными категориальными, находили значение моды, и находили долю данного значения моды во всей выборке данных.
Глава III. ИЗУЧЕНИЕ ИММУНОТРОПНОЙ АКТИВНОСТИ СОЕДИНЕНИЙ МАК-15, МАК-17, МАК-25 И МАК-30.
Первый этап проведенных исследований был посвящен выявлению среди изучаемых четырех веществ наиболее эффективного соединения, оптимально сочетающего стимуляцию противоопухолевой активности естественных киллеров с отсутствием прямого токсического воздействия на мононуклеарные лейкоциты (клетки-эффекторы). Кроме того, для выявления механизма получаемого эффекта, оценивали воздействие веществ на изолированные опухолевые клетки, т. е. прямое токсическое действие на клетки-мишени. Исследования проводили, применяя цитотоксический тест с витальным красителем метилтетразолием (МТТ). Предварительно проведенные исследования показали наличие корреляции между митохондриальной ферментативной (дыхательной) активностью клеточной суспензии и жизнеспособностью клеток в ней [36].
III. 1. Оценка влияния исследуемых соединений ряда МАК на цитотоксическую активность естественных киллерных клеток крови.
Естественные киллерные клетки являются эффекторами неспецифического клеточного иммунитета. Они реализуют свои функции без участия антител, лизируя при контакте дефектные и неопластические клетки. Таким образом, ЕК крови являются клеткамиэффекторами противоопухолевого иммунитета макроорганизма. Следовательно, вещества, стимулирующие каким-либо образом активность названных клеток, усиливают и иммунный статус организма в целом.
Конечный эффект воздействия изучаемых соединений на физиологическую активность естественных киллерных клеток оценивали с помощью МТТ-колориметрического цитотоксического теста.
Эффективность цитотоксической деятельности натуральных киллеров (клеток-эффекторов) оценивается по их способности лизировать опухолевые клетки (клетки-мишени) В качестве клеток-эффекторов использовали МНК, выделенные из периферической крови доноров. Активность ЕК в популяции МНК определяли на ЕКчувствительной линии К-562. Критерием активности ЕК служила их способность лизировать опухолевые клетки К-562, выраженная индексом цитотоксической активности (ИЦА). Расчет проводился по формуле (5).
Увеличение цитотоксичности ЕК выражалось показателем индукции цитотоксичности (ПИЦ, %), отражающим повышение процента спонтанной киллерной активности клеток-эффекторов под действием исследуемых веществ. ПИЦ рассчитывали согласно формуле (6).
В данной серии экспериментов исследованы взаимодействия с растворами МАК бинарных клеточных суспензий в трех соотношениях клеток-мишеней к клеткам-эффекторам (1:2, 1:5, 1:10). В каждом опыте проводилось не менее трех параллельных измерений, из которых находили среднее значение. В каждой серии было проведено не менее 18 опытов (1845 опытов в серии). Из результатов опытных серий находили медианное значение (Md). Кроме того, находили значения 25-го и 75-го квартилей (25%V75%). Изучение результатов воздействия растворов МАК различной концентрации относительно плацебо на цитотоксичность ЕК проводились путем множественного сравнения размаха квартилей с использованием критерия Данна, что позволяло найти достоверные отличия от контроля с уровнем значимости р<0,01.
Для сравнения уровня эффективных концентраций исследуемых веществ рассчитывали ЕСзо — эффективную концентрацию МАК, вызывающую увеличение цитотоксичности на 30% по сравнению с киллерной активностью ЕК в контрольной суспензии с эквивалентным объемом физиологического раствора.
