Синтез композиционных сорбентов на основе фторированных полибутадиенов для выделения нуклеиновых кислот

В последние годы в лабораторной практике широко применяются методы выделения и очистки, конкурирующие с традиционными хроматографическими колоночными схемами. К таким методам можно отнести капиллярный электрофорез, градиентную тонкослойную хроматографию и пр. Однако до сих пор невозможно представить полноценную лабораторию без использования методов жидкостной хроматографии как в аналитических, так и в препаративных целях. Более того, по оценке специалистов [1] хроматографическим методам принадлежит не менее 80% всех используемых в этих целях методик.

Несмотря на высказывавшиеся предложения строго классифицировать все типы применяющихся колонок и сорбентов с целью максимального сокращения их числа, последнее не представляется возможным, так как многообразие частных задач при разделении смесей различных веществ и реализуемых при этом условий практически невозможно свести к жестко ограниченному минимуму. Кроме того, анализ работ в области разработки теории хроматографии и математического моделирования процессов, происходящих при взаимодействии компонентов разделяемых смесей с поверхностью сорбента, свидетельствует об отсутствии комплексного подхода с учетом всех факторов, влияющих на эти процессы [2, 3], что также не позволяет провести жесткую унификацию и сокращение набора применяемых сорбентов.

Учитывая сказанное выше, а также в связи с дальнейшим развитием высокоэффективной жидкостной хроматографии и внедрением в практику крупномасштабных хроматографических процессов, целесообразен поиск новых счрбентов, выдерживающих высокое давление в колонках, не снижающих эффективности при смене условий разделения, обеспечивающих при этом высокие выходы разделяемых компонентов при сохранении ими нативных свойств, что особенно важно при работе с биологически активными соединениями.

Перспективными в этом отношении оказались полимерсодержащие кремнеземные сорбенты, применяемые в первую очередь для выделения биополимеров. Химическая модификация кремнеземов во многих случаях позволяет снижать неспецифическую сорбцию биополимеров на поверхности кремнеземной матрицы, а также вводить в состав сорбента необходимые функциональные группы. Создание тонкого (порядка нескольких нм) слоя полимерной фазы на поверхности неорганической матрицы делает возможным в одном композиционном материале объединить механическую прочность, жесткость, контролируемую пористость неорганической матрицы с инертностью, высокой емкостью, биосовместимостью, присущими традиционно используемым мягким органическим гелям.

Разработка композиционных полимерсодержащих сорбентов — комплексная проблема на стыке химии полимеров, физической и биоорганической химии. Методики получения таких материалов, способы иммобилизации полимерной фазы на неорганической поверхности пористой матрицы, механизм полимеризации и используемые мономеры в каждом конкретном случае весьма различны. При этом наряду с традиционными хроматографическими колонками широкое распространение получили компактные регенерируемые или одноразовые пластиковые и стеклянные картриджи, пригодные для проведения экспресс-анализа в диагностических целях. Удачными оказываются также упрощенные методы выделения биологически активных соединений, заключающиеся в сорбции примесей сорбентами в перемешиваемом объеме (в режиме «Ла/с/г-процесса») [4]. Перечисленные методики, как правило, реализуются с использованием модифицированных полимерсодержащих композиционных сорбентов.

Особые требования предъявляются к сорбентам, применяемым при выделении, очистке, концентрировании биополимеров, прежде всего нуклеиновых кислот и белков. Готовые препараты таких соединений не должны содержать примесей, в полной мере сохранять биологическую активность, а сама процедура выделения — занимать минимум времени. Использование фторсодержащих полимеров в качестве модификаторов кремнеземных носителей позволило получить ряд композиционных сорбентов, характеризующихся высокой хемостойкостью, гидролитической стабильностью и уникальными сорбционными свойствами. В то же время трудности, возникающие при полимеризации фторсодержащих мономеров, относительно высокие экономические, технологические затраты при масштабировании процессов получения фторполимерсодержащих композиционных сорбентов стимулируют поиск и реализацию новых подходов к созданию таких материалов. Одним из таких подходов является фторирование предварительно иммобилизованных на поверхности носителя тонких полимерных пленок с применением дифторида ксенона, что позволяет получать сорбенты с повышенным содержанием фтора. Такие сорбенты при значительном снижении неспецифической сорбции характеризуются высокой селективностью в процессах выделения высокочистых препаратов нуклеиновых кислот из различных источников.

Настоящая работа является частью структурно-функциональных исследований новых композиционных полимерсодержащих материалов, проводимых в лаборатории «Полимеры для биологии» Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН. Цель работы состоит в получении новых композиционных полифторбутадиенсодержащих сорбентов для выделения и очистки нуклеиновых кислот. В более узком смысле целью настоящей работы является разработка методики эффективного модифицирования внешней и внутренней поверхностей дисперсных объемно-пористых частиц кремнезема тонкой полибутадиеновой пленкой (толщиной 6 несколько десятков ангстрем) и последующая обработка этой пленки парами дифторида ксенонаопределение оптимальных параметров при получении таких сорбентов, а также исследование их структурных характеристик и адсорбционных свойств в процессах выделения ДНК из различных источников при различных вариантах проведения хроматографического анализа.

Обзор публикаций с 70-х г. г. до последнего времени позволяет проследить, как изменялись требования, предъявляемые к сорбентам в связи с расширением сферы их применения и увеличением числа материалов, используемых при получении композиционных сорбентов, а также как совершенствовались подходы к их синтезу. Получение полимерсодержащих сорбентов и изучение их свойств способствовали как развитию теоретической базы при разработке теории хроматографического процесса, так и решению прикладных задач.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ГЛАВА 1.

НОСИТЕЛИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИМЕРСОДЕРЖАЩИХ СОРБЕНТОВ.

Для получения композиционных полимерсодержащих сорбентов чаще всего используют два основных типа носителей: пористые и поверхностно-пористые (тонкослойные или иные). К числу пористых носителей относят силикагель, диатомиты и пористые стекла. К поверхностно-пористым, состоящим из частиц с непроницаемой сердцевиной и тонкой пористой оболочкой, относятся зипакс — носитель с контролируемой поверхностной пористостью, корасил и поверхностно-травленные стекла [5]. В наибольшей степени для модификации полимерами подходит кремнезем, то есть диоксид кремния во всех его формах: кристаллических, аморфных или гидратированных. В гидратированных формах, имеющих состав п8Ю2*хН20, содержание воды определяется в основном присутствием групп 8ЮН, называемых силанольными. Для модификации используют аморфный кремнезем, т.к. кристаллический имеет неразвитую поверхность. Аморфный кремнезем состоит из тетраэдров 8ЮН4, ориентированных в пространстве случайным образом. Структурные характеристики кремнезема зависят от способа его получения. Наличие связанных и отдельно стоящих гидроксильных групп, их положение на поверхности аморфного кремнезема, степень дегидроксилирования поверхности, степень ее упорядоченности обусловливают различие свойств кремнеземов при их дальнейшей модификации.

На поверхности кремнезема в различных соотношениях может находиться до 5 типов групп: силанольная (связанная) вода — свободные отдельно стоящие ОН-группыфизически связанная вода — молекулы воды, связанные водородными связями с силанольными группамидегидратированные оксиды — силоксановые группыблизнецовые (геминальные) ОЯ-группы, связанные с одним атомом кремнияреакционноспособные вицинальные? Ж-группы, преобладающие в тонкопористых кремнеземах — соседние, близко расположенные ОН-группы, связанные между собой водородными связями.

При повышении температуры прогрева кремнезема силанольные группы способны конденсироваться, образуя при этом силоксановые группы, а вода удаляется в виде пара. Прежде всего удаляется физически связанная вода, а затем происходит конденсация силанольных групп. Четко разграничить эти процессы не удается, т.к. они могут происходить одновременно.

Особая форма аморфного кремнезема — пористые стекла. Их получают при спекании диоксида кремния с другими оксидами с последующим вытравливанием растворимых в кислоте или щелочи продуктов.

Промышленностью выпускается несколько типов пористого стекла. Его готовят, расплавляя гомогенное боросиликатное стекло с последующим выдерживанием расплава при более низкой температуре для разделения на две несмешивающиеся фазы. При соответствующем образом подобранном составе эти фазы могут образовывать взаимопроникающие сетки. Затвердевание системы можно проводить на нужной стадии, чтобы остановить процесс огрубения структуры обеих фаз. Соединения бора и примеси других металлов, содержащиеся в стекле, можно растворить в сильной кислоте. Прлучаемое таким образом вещество представляет собой довольно чистый вьюокопористый кремнезем, называемый пористым стеклом. Размер пор в пористом стекле может быть получен в интервале от одного до нескольких сот нм. Каркас пористого стекла образован кремний-кислородными тетраэдрами исходного стекла, т.к. в процессе дальнейшей обработки связи Л'-О-Л/ не разрушаются. В исходном стекле имеются области, отличающиеся по химическому составу, т.к. атомы бора и кремния не образуют общей сетки. Наличие небольшого количества оксида натрия также обусловливает образование при температуре 700 °C крупных неоднородностей. Совокупность этих неоднородных областей и структуры кремнезема определяет размер пор при обработке этих стекол кислотой. При действии щелочи силикагель, отложившийся на стенках пор при воздействии кислоты, растворяется, остается лишь кремнеземный каркас. Общий объем пор при этом увеличивается, а удельная поверхность заметно уменьшается. После обработки щелочью поры имеют диаметр от 20 до 200 нм. Изменяя продолжительность контакта с соляной кислотой, можно получить как объемно-пористые, так и поверхностно пористые стекла, причем средние размеры пор при этом не изменяются, изменяется лишь глубина травления.

Свойства сорбентов сильно отличаются в зависимости от размеров пор. Различают сорбенты с макропорами, эффективные диаметры которых превышают 50 нмс мезопорами — размеры которых лежат в пределах от 2 до 50 нмс микропорами — с диаметрами меньше 2 нм. При изучении диффузии макромолекул внутри пористого носителя прежде всего необходимо учитывать влияние строения пористой структуры на интенсивность диффузии. Пористость носителя, равная объему свободного пространства в единице объема пористой массы, определяет долю сечения гранулы носителя, доступную для диффузии. Извилистость пор характеризует увеличение среднего пути диффузии относительно длины в направлении, перпендикулярном внешней поверхности гранулы. Размер пор определяет механизм диффузии [6, 7]. Если диаметр поры превосходит длину среднего свободного пробега молекул, то перенос вещества будет осуществляться по закону молекулярной диффузии в свободном пространстве. Если размер пор значительно меньше длины среднего свободного пробега молекул, то такая диффузия называется кнудсеновской. Это справедливо для газов. На режим диффузии жидкостей размер пор не оказывает влияния, пока не станет соизмеримым с размером молекул жидкости [8].

Большой размер молекул биополимеров обуславливает существенное уменьшение коэффициентов диффузии по сравнению с неполимерными молекулами. Так, у белков эти значения в 10−30 раз меньше, чем у аминокислот. Поэтому расширение зон и ухудшение разрешения пиков при хроматографии макромолекул объясняются главным образом трудностью установления равновесия обмена между фазами. Это обстоятельство, в свою очередь, требует уменьшения скорости элюции при хроматографии. При достаточно малых размерах молекул скорость элюции удается увеличить (за счет повышения давления), и в этом случае возрастает опасность денатурации макромолекул в результате их сжатия. При хроматографии биополимеров существует также проблема доступности всего объема неподвижной фазы внутри гранул. За исключением метода гель-фильтрации, это обстоятельство не только снижает емкость сорбентов, но и существенно затрудняет установление равновесия в неподвижной фазе. При этом обычные микрои мезопористые сорбенты не пригодны [9].

По структуре и по характеру диффузионных процессов, протекающих в порах сорбентов, последние делят на три основные группы. Во-первых, выделяют поверхностно-пористые сорбенты, характеризующиеся размером частиц 20−40 мкм, причем приповерхностный слой толщиной 2−3 мкм пронизан системой пор, а ядро частицы непористое. Во-вторых, объемно-пористые сорбенты, к которым относят большинство применяемых носителей, а также, в-третьих, макропористые микрочастицы, диаметром 310 мкм, применение которых позволяет повысить эффективность колонок.

Исходя из свойств носителя, конструкция композиционного полимерсодержащего материала для выделения биологических полимеров в общих чертах должна удовлетворять следующим требованиям:

• каркас неорганического носителя должен быть настолько плотно покрыт привитым полимером, чтобы взаимное расположение и конформация цепей привитых (или адсорбированных) макромолекул препятствовали непосредственному контакту поверхности кремнезема с молекулами биополимера.

• иммобилизуемый полимер должен обладать минимальной адсорбционной активностью по отношению к молекулам биополимеров, подлежащих выделению. При этом, как правило, он должен содержать якорные и функциональные группы, необходимые для проведения хроматографического разделения.

• иммобилизация полимера не должна приводить к сильным изменениям пористой структуры исходного кремнезема.

• полимерное покрытие должно быть химически чистым и биологически стабильным, достаточно прочно прикрепляться к неорганической поверхности.

Способы получения кремнеземных композиционных полимерсодержащих сорбентов, применяемые в настоящее время, можно условно разделить на три основные группы. К первой группе можно отнести способы получения сорбентов, основанные на физической адсорбции полимеров из растворов на поверхности кремнеземов с последующей дополнительной сшивкой или без таковой. Ко второй группе можно отнести способы получения сорбентов, заключающиеся в проведении хемосорбции полимеров, приводящей к образованию устойчивых химических связей полимерной фазы с поверхностью носителя. В первых двух случаях на поверхность носителя иммобилизуется предварительно полученный полимер (олигомер). Наконец, ряд способов получения композиционных полимерсодержащих сорбентов основывается на проведении радикальной или ионной полимеризации мономеров в присутствии кремнеземного носителя.

Необходимость применения полимерсодержащих сорбентов в хроматографии обусловлено тем, что полимерная фаза значительно изменяет свойства поверхности жесткой матрицы, идет ли речь о гидрофильных либо гидрофобных, а также ионогенных или неионогенных полимерах. Таким образом, обеспечивается возможность получать композиционные материалы с комплексом заданных свойств.

При хроматографическом процессе, как известно, имеет место разделение компонентов разделяемых смесей за счет диффузионной миграции, т. е. за счет различных скоростей перемещения молекул. При этом одновременно можно контролировать большое число параметров процесса. Таким образом, хроматографический процесс является многоканальным источником информации, чем определяется столь широкое его использование в аналитике и в препаративных целях. Среди хроматографических методов жидкостная хроматография развивается наиболее быстро [10], что касается как исследования и анализа простых и сложных смесей тяжелых органических и биологически активных соединений, так и полимерных композиций. В подавляющем большинстве случаев и по настоящее время используется высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), что требует применения высокооднородных сорбентов, обеспечивающих в условиях высокого давления удовлетворительных скоростей разделения. Ранее считалось, что в сравнении с газовой хроматографией число сорбентов для ВЭЖХ ограничено. Сегодня предлагаются новые сорбенты для решения специфических задач, таких как разделение белковых смесей, выделение и очистка нуклеиновых кислот, определение лекарственных препаратов и продуктов их метаболизма в сыворотке крови, разделение Ьи Б-изомеров и пр.

Для ВЭЖХ как в качестве самостоятельных сорбентов, так и в качестве неорганических носителей для синтеза композиционных материалов используются преимущественно микрочастицы диаметром 3−10 мкм как нерегулярной, так и сферической формы с повышенной (до 90%) степенью однородности геометрии внутренней поверхности с возможностью ее регулирования. Эти частицы характеризуются средним диаметром пор в диапазоне от 6 до 10 000 нм, удельной площадью поверхности 10−600 м2, удельным объемом пор от 0,3 до 1,8 см3/г, с повышенной прочностью, с возможностью регулировать емкость материалов [11, 12].

По химической природе сорбенты можно разделить также на три основные группы. В качестве примеров неорганических сорбентов можно привести силикагели, макропористые стекла, оксид алюминия, оксид титана. Примерами органических сорбентов являются многочисленные модификации гелевых и макропористых полимерных (сополимерных) материалов. Наконец, так называемые сменные (композиционные) сорбенты представлены материалами, представляющими собой неорганические частицы, инкапсулированные полимерным слоем, либо с привитыми полимерными цепям, либо с привитыми ионогенными группами и пр. Композиционные сорбенты представляют наибольший интерес с точки зрения возможности разнообразить композиции как для повышения селективности разделения компонентов смесей, так и для увеличения стойкости самих сорбентов и возможности их неоднократной регенерации без значительной потери полезных свойств. При получении композиционных материалов также следует учитывать технологичность их производства, возможность и относительную легкость масштабирования процессов их синтеза.

Прежде, чем обсуждать особенности процессов, происходящих при участии поверхности частиц сорбента, а также рассматривать проблемы, возникающие при их синтезе, необходимо определить требования, предъявляемые к сорбенту, как конечному продукту синтеза. Эти требования изменялись по мере расширения сферы их применения, совершенствования методик синтеза и расширения числа применяемых при этом материалов.

Разработка определенных типов сорбентов для решения различных аналитических и препаративных задач привела к возникновению более частных, чем приведенные выше, классификаций сорбентов (по используемому материалу, пористости, форме частиц, размеру частиц), в соответствие с чем формулировались и требования к синтезируемым.

ГЛАВА 2.

АДСОРБЦИЯ ПОЛИМЕРОВ НА ПОВЕРХНОСТИ НЕОРГАНИЧЕСКИХ НОСИТЕЛЕЙ.

Обобщение требований, предъявляемых к свойствам композиционных сорбентов, возможно при наличии упорядоченных данных по фундаментальным вопросам взаимосвязи структуры и свойств таких материалов. То, как накапливались эти данные, в определенной мере отражает и хронологию исследований в данной области.

В конце 80-х г. г. Андре [13], изучая взаимодействие белков крови с полиэтиленоксидом (ПЭО), привитым к поверхности твердой матрицы, предложил качественное объяснение эффекта, наблюдаемого при адсорбции белка на нейтральном водорастворимом полимере. По его мнению, одним из механизмов подавления адсорбционных свойств исходной матрицы полимерной фазой может быть низкая поверхностная свободная энергия водорастворимых полимеров и гелей. Эти значения, определенные в более ранних работах японскими исследователями [14], составили для поливинилового спирта, например, 3,1 мДж/м2, а для полиэтилена 52,6 мДж/м2. Кроме того, они обнаружили, что сывороточный альбумин адсорбируется в значительно большей степени при увеличении межповерхностной свободной энергии полимера, взаимодействующего с белком. В работе [15] изучался уровень адсорбции (мкг/см2) для различных белков как функции поверхностной энергии субстрата из растворов с различными значениями свободной межповерхностной энергии. При этом при возрастании поверхностной энергии субстрата (т.е. с уменьшением межповерхностной свободной энергии) уровень адсорбции падал в случае системы с фосфатным буфером (более высокие значения межповерхностной энергии) в сравнении с водно-диметилсульфоксидными смесями (более низкие значения свободной межповерхностной энергии).

Если отсутствуют специфические взаимодействия (рецептор — лиганд), изменение свободной энергии Гельмгольца при адсорбции определяется уравнением:

ДРа<�ц=УргУрГУ& где члены правой части уравнения представляют собой значения межповерхностного натяжения при взаимодействии белка и твердой фазы, белка и жидкости, а также твердой фазы и жидкости соответственно [16]. Следовательно, свободная энергия адсорбции белка на поверхности сорбента определяется не только поверхностной энергией белковой молекулы и твердой фазы, но и поверхностной энергией растворителя. Если поверхностное натяжение растворителя ниже, чем у белка, то с увеличением поверхностной энергии субстрата уменьшается изменение свободной энергии Гельмгольца, определяя тем самым повышение адсорбции белка на полимере. Поэтому носители для эксклюзионной и аффинной хроматографии должны быть максимально гидрофильными для максимального снижения нежелательной адсорбции. Если же поверхностное натяжение растворителя выше, чем для белка, то с увеличением этой величины для субстрата величина энергии Гельмгольца повышается, а адсорбция, следовательно, уменьшается. При равенстве значений поверхностных натяжений растворителя и белка изменение свободной энергии Гельмгольца равно нулю независимо от значения поверхностного натяжения субстрата.

В [17] на основании обсуждения гипотетической структуры поверхности с минимальной поверхностной энергией сделан вывод, что поверхности, сформированные адсорбированными водорастворимыми полимерами, являются идеальными. Конформация адсорбированных носителем полимерных цепей оказывает определяющее влияние на подавление адсорбционной активности субстрата. Т.к. цепи имеют «хвосты» и «петли», вероятность реализации некоторых конформационных изменений в молекуле сорбата мржет снижаться, что приводит к снижению свободной энергии межповерхностного взаимодействия [17]. При этом вследствие снижения подвижности закрепленных групп общая энтропия системы может уменьшаться. Снижение энтальпийного фактора при взаимодействии цепей в хорошем растворителе (вода) также вносит вклад в значение свободной энергии системы. Поэтому адсорбированные макромолекулы переориентируются в соответствии с микроокружением, облегчая контакт с белковой молекулой.

Рядом исследователей [18, 19] изучались как теоретические аспекты, так и экспериментально полученные данные по адсорбции макромолекул. В конечном счете они были сведены в [20] к балансу энтропийного и энергетических факторов. Для нейтральных полимеров имеют значение четыре фактора: энергия сегментальной адсорбции, являющаяся движущей силой адсорбцииэнтропия конформации цепей (соответствует уменьшению энтропии макромолекул в адсорбированном состоянии по сравнению с макромолекулами в растворе) — так же, как и энтропия смешения сегментов и растворителя (которая определяет границу между сконцентрированной поверхностью и разбавленным раствором) — действуют в противоположном направлении. Четвертый фактор — взаимодействие между сегментами (определяется взаимодействиями полимер-полимер, растворитель-растворитель и полимер-растворитель) — обычно способствует накоплению сегментов в растворе. Равновесие при конечной концентрации приводит к существованию адсорбированных макромолекулярных слоев с «петлями» и «хвостами».

При адсорбции полиэлектролитов дополнительно появляется электростатический фактор. В случае заряженной поверхности сорбата энергия сегментальной адсорбции может быть больше или меньше, что определяется знаком и величиной заряда. Полиэлектролит адсорбируется при этом лишь в случае, если энергия адсорбции превышает энергию межсегментального взаимодействия и взаимодействия между сегментами и поверхностью. Электростатическое взаимодействие между сегментами снижает уровень адсорбции. Кроме того, адсорбция полиэлектролитов сильно зависит от ионной силы раствора. В растворах со слабой ионной силой сегменты стремятся максимально удалиться друг от друга, адсорбированный слой утончается, снижается количество «хвостов».

Дуглас [21], изучая адсорбцию полимеров на неровных поверхностях, обнаружил, что адсорбция усиливается на фрактальных поверхностях, поскольку при этом снижены «энтропийные затраты» и неровная поверхность способна адсорбировать полимер, в то время как соответствующая гладкая поверхность из того же материала не адсорбирует его. Неровности (другими словами, возрастание фрактальности), приводят к утолщению адсорбированного полимерного слоя. С другой стороны, макромолекулы с более гибкими цепями адсорбируются сильнее, чем жесткие полимеры.

Обширный экспериментальный материал позволил выявить некоторые закономерности, проявляющиеся при адсорбции полимеров. Так, Хоммель [22] установил зависимость конформации цепей полиэтиленоксида (ПЭО) при адсорбции на силикагеле от степени прививки, т. е. от площади поверхности, приходящейся на одну молекулу. В этой работе был применен один из методов формирования полимерной поверхности на неорганической твердой матрице, впоследствии с успехом использованный при синтезе сложных композиционных сорбентов, а именно — упаривание водного раствора полимера при отсутствии химической пришивки полимера к поверхности. В сформированные таким образом полимерные слои ПЭО исследовали, вводя спиновую метку в концевые группы полимера. При этом при низких поверхностных концентрациях ПЭО полимер присутствовал в виде двух типов молекул, различающихся по подвижности. Малоподвижные молекулы взаимодействовали с полярными силанольными группами, более динамичные молекулы были представлены цепями, экспонированными в раствор. При увеличении поверхностной концентрации в два раза обнаруживали только подвижные цепи, т. е. конформация цепей становилась более «рыхлой».

При изучении диффузионной подвижности полистирольных латексных частиц [23] в водных растворах ПЭО в зависимости от концентрации последнего было показано, что толщина гидродинамического слоя адсорбированного полимера, вычисленная на основании данных по уменьшению диффузионной подвижности частиц, возрастает при повышении поверхностной концентрации ПЭО. Эти данные согласуются с теорией Флира [18, 20], утверждающей, что основной вклад в толщину гидродинамического слоя вносят длинные петли и «хвосты», экспонированные в раствор.

Примерно в это время Фурусава и Ямамото [24], изучая адсорбцию полистирола с различными молекулярными массами и молекулярно-массовым распределением на пористом стекле с диаметром пор 1000 А, обнаружили, что способность адсорбированного полимерного слоя к обмену компонентами между твердой фазой и раствором сильно зависит не только от молекулярной массы адсорбированного полимера, но и от исходной концентрации раствора полимера, причем, макромолекулы, адсорбированные из растворов с высокой концентрацией, обмениваются интенсивней, чем молекулы из растворов с низкой концентрацией. Приняв, что способность молекул к обмену определяется числом сегментов, взаимодействующих с поверхностью, можно сделать вывод, что при адсорбции из концентрированных растворов макромолекулы взаимодействуют с поверхностью меньшим числом сегментов, чем в случае разбавленных растворов. Поэтому в последнем случае макромолекулы связываются с поверхностью большим числом сегментов и имеют более «распластанную» конформацию [25]. Ранее Косгров [26] рассчитал, что полимерная цепь экспонируется в раствор при условии, что энергия связывания мономерного звена с поверхностью превышает 2 кТ. В более концентрированных растворах макромолекула, особенно, если она не первая взаимодействует с поверхностью, имеет доступ к меньшей площади и адсорбируется меньшим числом сегментов и, соответственно, с большим числом «хвостов» и петель, и поэтому довольно легко десорбируется.

Учитывая вышесказанное, можно предсказать некоторые свойства прлимерсодержащих композиционных сорбентов. Так, стерически «распластанная» конформация макромолекул в достаточной степени способствует экранированию активных центров на поверхности носителя «петлями», подавляя таким образом неспецифическую сорбцию биополимеров поверхностью носителя. Поскольку части полимерных цепей экспонированы в раствор от поверхности носителя, функциональные группы полимерных макромолекул становятся доступными, кроме того, облегчается «адаптация» вариабельных макромолекул биополимеров к поверхности сорбента, что способствует сохранению их нативной структуры.

Обращает на себя внимание обстоятельство, что композиционные сорбенты, полученные физической адсорбцией нейтральных полимеров на кремнеземных матрицах с успехом использовались для выделения и очистки биополимеров начиная с 70-х г. г. Примерами таких необратимо адсорбированных благодаря большому числу слабо взаимодействующих с поверхностью матрицы сегментов стационарных фаз являются полиэтиленоксиды [27, 28] и поли-Ы-винилпирролидон [29]. В работе [27], например, сообщалось о получении сорбента посредством обработки водным 0,4% раствором ПЭО массой около 100 000 пористого стекла с диаметром пор 1250 А. Затем на таком материале были очищены некоторые вирусы, причем было обнаружено, что изготовленный исследователями материал предотвращает адсорбцию вирусов на макропористом стекле. При модификации аналогичной матрицы полиэтиленгликолем массой 20 000 [28] был получен сорбент для препаративного выделения вируса миелобластоза из плазмы цыпленка методом эксклюзионной хроматографии. Однако белки с р1>7,5 необратимо сорбировались из-за взаимодействия с поверхностью матрицы. Иммобилизованная подобным способом на кремнеземной матрице полимерная фаза поливинилпирролидона [29] оказалась нестабильна при использовании хлороформ-метанольных смесей, традиционно применяемых при элюции в ВЭЖХ.

Для выработки подходов к повышению стабильности полимерных покрытий ирследователи обратились к изучению адсорбции заряженных полимеров на неорганических поверхностях. Электростатическое взаимодействие и множественные водородные связи являются, вероятно, причиной необратимой сорбции на поверхности пористых стекол поли-1,2,4-триазола [30]. Полученные таким образом сорбенты применяли для выделения ряда вирусов, которые сохраняли при этом антигенные и иммунные свойства.

Стабильные покрытия были получены также на основе катионогенных производных декстрана, активированных бромцианом для дальнейшей иммобилизации антигена [31]. Такой сорбент эффективно регенерировался без изменения емкости и специфичности. В работе [32] силикагели модифицировали декстранами различных молекулярных весов, различающихся содержанием ДЭАЭ-групп. Оказалось, что молекулярный вес не оказывает влияния на нейтрализацию поверхностных силанольных групп кремнеземов, однако число ДЭАЭ-групп сильно влияет на хроматографические свойства сорбентов, причем, имеется оптимальное их содержание. Так, при содержании указанных групп ниже 4% полной нейтрализации отрицательного заряда поверхности носителя не достигалось, а содержание более 10% создавало излишний положительный заряд на поверхности, что нарушало гель-проникающий механизм и придавало сорбенту анионообменные свойства.

Для увеличения стабильности иммобилизованного полимерного покрытия было предложено проводить химическую сшивку адсорбированных макромолекул бифункциональными и олигофункциональными реагентами. В работе [33] адсорбированный на поверхности силохрома с диаметром пор 1000−1300 А поливиниловый спирт сшивали эпоксидной смолой, затем вводили алкильные радикалы. Полученный материал использовали при выделении микробных липаз. Иммобилизованные на цеолите макромолекулы поливинилового спирта сшивали эпихлоргидрином, затем иммобилизовали на полученной поверхности краситель Cibacron Blue 3G-A, являющийся группоспецифичным лигандом для выделения киназ и дегидрокиназ [34]. Альперт и Ренье [35] адсорбировали на поверхность пористых силикагелей разветвленный полиэтиленимин с массой 600 Да из растворов в метаноле. Такие покрытия дополнительно сшивали для повышения стабильности полимерной фазы тетраглицидиловым эфиром пентаэритрита, а также диглицидилэтиленгликолем [36] и глутаровым альдегидом [37]. В работе [35] также приведены данные по зависимости величины необратимой сорбции полимера от диаметра пор силикагеля. В соответствие с этими данными, поверхность широкопористого силикагеля более доступна для сорбирующихся макромолекул полиэтиленимина, т. к. адсорбция, рассчитанная на единицу площади поверхности, оказывается выше для широкопористого силикагеля. В то же время величина необратимой сорбции выше для узкопористых силикагелей. Аминогруппы в подобных материалах можно кватернизовать, обрабатывая иммобилизованный полиэтиленимин метилиодидом. Полученные таким образом сорбенты позволяют разделять несколько тРНК, а при добавлении в элюент 15% ацетонитрила — разделять олигонуклеотиды с длиной цепи от тридцати до пятидесяти звеньев [38].

Наряду с физически сорбированными полимерными фазами изучалась возможность ковалентной пришивки полимерных молекул к поверхности носителя. При хемосорбции полимера помимо снижения неспецифической сорбции носителем, достигается цель получения стабильного высокоемкого аффинного сорбента посредством введения макромолекулярного спейсора между поверхностью носителя и биоспецифическим лигандом, как было показано при модифицировании сефарозы полилизином и поливиниламином [39]. Оказалось возможным синтезировать композиционные сорбенты, используя, например, сополимеры винилсиланов с мрномерами, несущими функциональную группу, способную ковалентно связываться с поверхностными силанольными группами в результате конденсации с образованием «якорных» связей с поверхностью носителя. В работах Даванкова с сотр. [40] с этой целью применяли сополимер стирола с метилэтилдиэтоксисиланом. Для синтеза использовали кремнеземы с различными диаметрами пор. При этом обнаружили, что замедление диффузии полимера в узкие поры приводит к снижению поверхностной концентрации полимера. Топологию полимерного покрытия (объем пор и распределение пор по размерам) изучали методами ртутной порометрии и эксклюзионной хроматографии с применением полистирольных стандартов. В последнем случае оказалось, что хемосорбированное покрытие приводит к значительному уменьшению диаметра пор, в то время как при проведении ртутной порометрии снижение этой величины было незначительным. Поскольку при хроматографическом процессе полимерная фаза находится в «набухшем» состоянии и полимерные цепи сольватированы молекулами растворителя, проницаемость полистирольного стандарта ухудшается, при порометрическом же анализе полимерная фаза сорбента не набухает. Однако, поскольку полученные хроматограммы свидетельствуют о наличии адсорбционных взаимодействии между полистирольными молекулами в растворе и на поверхности кремнезема, неизбежны искажения результатов. Структуру полученных таким образом полимерных покрытий с большой степенью приближения можно считать «монослойной».

Большое число работ посвящено исследованию сорбентов с различной степенью гидрофобности. Такие сорбенты получали, например, модифицируя силикагель с хемосорбированным полиэтиленимином, который затем обрабатывали 2-(карбометокси)-этилтрихлорсиланом (КМЭТС), ацилировали ангидридом дикарбоновой кислоты [41]. С той же целью силикагель, модифицированный КМЭТС и тетраэтиленпентамином, ацилировали хлорангидридами жирных карбоновых кислот [42]. При хроматографии с применением этих сорбентов все белки (кроме лизоцима) выходили в свободном объеме при низкой ионной силе элюента. Для проведения катионообменной и гидрофобной хроматографии белков была осуществлена хемосорбция высокомолекулярного нейтрального полисукцинимида на аминопропильном силикагеле [43]. Такой сорбент может быть затем гидролизован с образованием полиаспарагиновой кислоты либо подвержен конденсации с Р-аланином в водном растворе с образованием ковалентно пришитого сополимера 2-карбоксиэтил аспартамида и аспартамовой кислоты. На таких сорбентах удовлетворительно разделяли смеси белков в градиенте хлорида натрия. Высокая ионообменная емкость и способность десорбировать полипептиды объясняли гидрофильностью и так называемой «пептидностью» полимерной фазы, т. е. наличием развитой полимерной поверхности с ионизованными группами, локализованными на концах цепей на удалении от поверхности носителя.

В середине 70-х г. г. внимание исследователей привлекли силикагели, модифицированные полиэтиленоксидом (ПЭО), в качестве сорбентов для гидрофобной хроматографии белков и нуклеиновых кислот. Например, реакционноспособными силанами, полученными посредством реакции гидросилилирования между аллиловыми эфирами олигоэтиленоксида и диметилхлорсиланом, обрабатывали силикагели [50] с целью получения сорбентов с различной гидрофобностью для разделения смесей стандартных белков в понижающемся градиенте сульфата аммония в растворе ацетата аммония. Выход всех белков превышал 90%. Исследования сорбентов, полученных на основе силикагелей, модифицированных 3-глицидоксипропилтриметоксисиланом и полиэтиленгликолем, позволили подобрать условия разделения белков посредством линейного градиента сульфата аммония при понижении концентрации последнего [51]. Было установлено, что природа соли в составе элюента, а также структура силана и молекулярный вес ПЭО оказывают различное влияние на эффективность разделения в зависимости от молекулярного веса сорбата [52]. Подобные «мягкие» стационарные фазы могут применяться для выделения высокочувствительных ферментов без потери активности последних.

Возможность «конструирования» композиционных сорбентов с заданными свойствами была реализована также при синтезе широкопористых кремнеземных материалов Ивановым, Зубовым и др. [44, 45] при ацилировании аминопропил-кремнеземов полимерами N-винилпирролидона и акрилоилхлорида, полученными сополимеризацией по свободно-радикальному механизму. Остаточные хлорангидридные группы обрабатывали моноэтаноламином с образованием 2-гидроксиэтиламидных групп. Эти материалы с успехом применяли для выделения различных вирусов, а также РНК из смеси, содержащей рибосомальные фрагменты 70S с количественным выходом. Полимерные фазы таких сорбентов диффузны и гидрофильны, поскольку образованы водорастворимыми полимерами. При этом 90% активных групп хлорангидрид-содержащего сополимера, который хемосорбируется аминопропил-кремнеземом, остаются свободными. Они содержатся в «петлях» и «хвостах» макромолекул [45].

Стабильные сорбенты также были получены в результате хемосорбции поли-п-нитрофенилакрилата на аминопропил-кремнеземе [46]. Поскольку при хемосорбции происходит выделение в раствор п-нитрофенола, оказалось возможным изучение конформационных изменений посредством УФ-спектроскопии. Первоначально макромолекула взаимодействует с поверхностными реакционными группами несколькими звеньями цепи. Затем происходит адаптация макромолекулы к поверхности. Если при этом в реакционную смесь ввести уксусный ангидрид, то при данных условиях ацилированию подвергается более 70% аминопропильных групп и первичные аминогруппы становятся нейтральными ацетиламидными группами, что способствует существенному снижению уровня неспецифической сорбции в сравнении с исходным носителем [47]. Далее п-нитрофенильные группы могут взаимодействовать с первичными аминами с образованием амидной связи. В качестве побочного продукта реакции при этом выделяется нитрофенол. В работах [48, 49] получены подобные гидрофобные сорбенты, модифицированные бутиламином и фениламином. Эти материалы оказались эффективны при ВЭЖХ белков, а бутилированный сорбент проявил максимальную емкость при выделении различных вирусов.

ГЛАВА 3.

СИНТЕЗ КОМПОЗИЦИОННЫХ СОРБЕНТОВ С ПРИВИТОЙ ПОЛИМЕРНОЙ ФАЗОЙ.

Возможности «конструирования» композиционных сорбентов были значительно расширены применением метода графт-полимеризации, благодаря которому на поверхности неорганической матрицы можно сформировать полимерную фазу, не прибегая к стадии адсорбции предварительно полученного полимера. При этом происходит не только рост полимерных цепей от поверхности носителя в ходе полимеризации, но и пришивка «живых» цепей к поверхности подложки. Полимерные молекулы диффундируют к поверхности твердой фазы, поэтому диффузионные и стерические затруднения могут снизить степень модификации и выход графт-полимеризации. Но поскольку размеры молекул малы, эти факторы при графт-полимеризации не имеют столь определяющего значения и существует возможность формировать фазы с высокой концентрацией полимера.

Необходимыми условиями для осуществления графт-полимеризации являются наличие и доступность активных участков модифицируемой поверхности. При этом можно формировать активные центры непосредственно на поверхности кремнезема с концентрацией силанольных групп 4,6−4,8 (9#-групп/нм2 [6, с.23]. С другой стороны, возможно предварительно химически модифицировать поверхностные гидроксильные группы с целью создания новых активных участков, образованных, например, силоксановыми мостиками. В качестве таких модификаторов широко используются органосиланы, обычно общей формулы ЯЯгХз, где X — гидролизуемая группа (галоген, алкоксии пр.), а К — негидролизуемая органическая функциональная группа, которая и определяет химическую природу получаемого сорбента.

Следует заметить, что реакционноспособные центры могут быть получены также в результате активации поверхности носителя механохимическими реакциями, когда носитель (наполнитель) подвергается истиранию, расщеплению [53]. Однако эти методы, наряду с активацией поверхности минеральных носителей с помощью плазмы [54] используются преимущественно в создании высоконаполненных композиционных систем при наполнении полимеров на стадии синтеза. В то же время, образование реакционных центров и протекание графт-полимеризации может происходить при радиационном облучении либо под действием инициаторов свободных радикалов. Механизмы подобных процессов, позволяющих получать композиционные полимерсодержащие сорбенты, рассматриваются в ряде работ [55- 58].

Радиационно-инициированная полимеризация может проводиться различными способами [59]:

• прямым облучением системы носитель-мономер. Мономер при этом может находиться как в жидком состоянии (в чистом виде или в виде раствора), так и в газообразном или парообразном;

• прививкой на предварительно облученную в инертной атмосфере или в вакууме поверхность («пост-полимеризация»). При этом мономер обычно присутствует в газообразном или парообразном состоянии.

Радиационно-инициированная полимеризация в присутствии твердого носителя протекает в слоях мономеров, адсорбированных на ее поверхности. В случае силикагелей их поверхностные силанольные группы образуют радикалы БЮ* и при облучении.

Таким образом полимеризуются, например, стирол, метилметакрилат, акрилонитрил и аллилглицидиловый эфир на поверхности силикагеля [60].

При прямом облучении образуется значительное количество гомополимера из-за присутствия низкомолекулярных радикалов Н* и ОН*, химически не связанных с поверхностью. Поэтому необходимо предварительно обрабатывать силикагель нерастворимыми органосиланами для формирования более устойчивой полимерной фазы. Напротив, полимеризация мономеров в газовой фазе помимо низкого количества образующегося гомополимера характеризуется еще одним преимуществом: прививка к поверхности осуществляется даже при низком выходе активированных участков на кремнеземе после радиолиза. Количество привитого полимера увеличивается с увеличение дозы облучения и имеет предельное значение [61].

Еще большие преимущества дает низкотемпературная пост-полимеризация, поскольку при этом повышаются как выход полимера, так и эффективность прививки. В работе [62] сообщалось о полимеризации тетрафторэтилена на кремнеземной поверхности с эффективностью прививки свыше 30%. Однако при этом необходимо поддерживать условия полимеризации, предотвращающие закупорку пор матрицы.

Поскольку инициирование полимеризации винилсодержащих мономеров на поверхности силикагеля может проводиться посредством введения инициаторов свободно-радикальной полимеризации, различают несколько способов введения инициатора в систему:

• введение инициатора путем образования ковалентной пришивки к подложкепри этом увеличивается выход привитого полимера, но образуется также значительное количество гомополимера;

• физическая адсорбция инициатора на поверхности кремнезема из раствора;

• введение инициатора в мономер или в раствор мономера.

Вообще говоря, при получении однородных устойчивых полимерных покрытий, как правило, придерживаются нескольких правил. Во-первых, следует использовать мономеры с реакционноспособными группами. Например, при обработке макропористого стекла 2,3-эпоксипропилметакрилатом с последующей полимеризацией удалось получить однородное полимерное покрытие с сохранением пористости исходного носителя [63]. Во-вторых, поверхность предварительно активируют органосилильными соединениями, способными сополимеризоваться с винилсодержащими мономерами (метилметакрилат, акрилонитрил, акриловая и метакриловая кислоты, стирол, М-винилпирролидон, бинарные смеси триэтоксивинилсиланстирола или триэтоксивинилсилан-метилметакрилата с винилсодержащими мономерами и др.) для прививки полимеров на кремнеземные матрицы [64−69]. В-третьих, применяют бифункциональные сшивающие агенты (например, дивинилбензол в присутствии азо-бис-изобутиронитрила), вводя их в систему с суспендированными частицами носителя, причем, образующийся в жидкой фазе полимер адсорбируется на частицах твердой фазы и затем сшивается с образованием трехмерной сетки на поверхности частиц [70, 71].

Таким образом, подбор условий проведения полимеризации имеет большое значение, т.к. корреляция между условиями синтеза и свойствами конечного продукта менее очевидна, нежели при адсорбции полимеров. Вместе с тем обычно прививочная полимеризация проводится с меньшим числом стадий синтеза по сравнению с методиками, основанными на адсорбции полимеров.

Литературные данные свидетельствуют о том, что модификация поверхности кремнеземов олигомерами и полимерами позволила за последнее время создать поколение новых хроматографических материалов, сочетающих в себе высокую механическую и физико-химическую стабильность со способностью эффективного фракционирования сложных смесей биополимеров без существенной деградации их природных свойств.

Подобные материалы все чаще используются как для аналитических, так и для препаративных целей.

Мчедлишвили с сотр. [71] изучали свойства пористых стекол, модифицированных сополимерами N-винилпирролидона и диметакрилатов этилени триэтиленгликоля. Эти сорбенты применяли для гель-фильтрации вирусов гриппа и бешенства от примесных белков, причем выход разделяемых компонентов был близок к количественному, что подтверждает равномерность и плотность распределения полимера по поверхности стекла. Предполагая равномерность полимерного покрытия и принимая во внимание данные элементного анализа, была рассчитана средняя толщина полимерного слоя, равная 15−20 А. Пористая структура по данным ртутной порометрии значительно изменялась лишь в случае стекол со средним диаметром пор 200 А.

При у-облучении деаэрированной смеси цеолита с водным раствором 2-оксиэтилметакрилала (11%) и 14,№-метиленбисакриламида (0,15%) [34] с последующей иммобилизацией красителя Cibacron Blue F-3A был получен материал, способный сорбировать из раствора сывороточный альбумин.

Аффинные сорбенты, содержащие привитые сополимеры N-метилоилакриламида с N-замещенными акриламидами, содержащими активированные сложноэфирные группы (N-оксисукцинимидные), а также с аллиламином и N-аллилбромацетамидом на основе широкопористых силикагелей, химически модифицированных диольной фазой, описаны в работе [72]. При нагревании в присутствии каталитических количеств кислот метильные группы способны взаимодействовать с гидроксилами глицерилпропильной фазы с образованием простых эфирных связейтакже могут иметь место реакции с отщеплением воды и образованием связи между атомами азота через промежуточную метиленовую группу, что обеспечивает сшивку адсорбированных молекул между собой и одновременное прикрепление их к носителю. В качестве аффинного лиганда к активированным носителям присоединяли гепарин, концентрация которого в иммобилизованном состоянии находилась в пределах 10−12 мг/г сорбента. На полученных таким образом сорбентах выделяли антитромбин-Ш, протеиназу из сыворотки крови, специфически связывающуюся с гепарином. Количество связанного антитромбина-III не зависит от концентрации лиганда внутри указанного интервала ее значений. Количество связанного белка оказалось в 4−5 раз выше, чем на гепарин-сефарозе С1−6 В.

В распределительной хроматографии аминокислот использовали пористые носители, содержащие алифатические гидрокси-группы, модифицированные прививкой полиакриламида, которую осуществляли под действием окислительно-восстановительного инициирования [73].

Фирмой Toyo Soda Manufacturing разработаны композиционные сорбенты типа TSK-GEL SW, имеющие сферические частицы размером 10+2 мкм и диаметр пор 130, 240 и 450 А [74]. Эти сорбенты подвергались окислению периодатом и обработке гексаметилендиамином, что позволило иммобилизовать на их поверхности 7-пентанамидоцефалоспориновую кислоту [75]. Поэтому, вероятно, в состав покрытия TSK-GEL SW сорбентов входят гидроксил-содержащие полимеры. Элюция белков в 0,07 М фосфатном буфере (рН=6,8) в присутствии 0,1 М NaCI происходит на этих сорбентах по молекулярно-ситовому механизму, однако на основе этих сорбентов получены также анионообменные производные [76]. Этой же фирмой разработаны способы прививки виниловых мономеров на пористые материалы под действием |> и у-излучения [77]. Мономер адсорбировали на пористой матрице и облучали на источнике 60Со. Количество привитого полимера, как правило, увеличивалось с уменьшением дозы облучения. Оптимальная доза зависит от типа мономера и обычно составляет 1−10 Мрад при температуре образцов до 50 °C. Эмпирически подобранная величина адсорбции мономера составила 6−7 мономолекулярных слоев.

В некоторых работах проведению полимеризации предшествует стадия адсорбции паров мономера на поверхности носителя. Так, по данным работы [78] при воздействии на кремнеземы ионизирующего излучения мощностью дозы до 40−100 рад/сек в присутствии паров акриловой кислоты и винилацетата с последующей активацией функциональных групп привитых полимеров удалось получить носители для иммобилизации ферментов, липидов, нуклеотидов, причем удавалось вводить до 4 ммоль функциональных групп на 1 г сорбента, что в 8 раз превышает аналогичный показатель для сорбентов, полученных путем обработки матриц кремнийорганическими реагентами.

Имеются данные [79] ртутно-порометрического анализа и тепловой десорбции азота для целого ряда модифицированных пористых стекол с диаметрами пор от 400 до 2000 А0, которые свидетельствуют об однородном распределении привитого полимера к внутренней поверхности частиц матрицы по крайней мере с диаметром пор не ниже 400.

А.

Известно также [80], что в области низких концентраций мономера на поверхности кремнеземов образуется полимер, представляющий собой систему не взаимодействующих между собой макромолекул, связанных с твердой поверхностью. При переходе к большим концентрациям адсорбированного мономера в привитых макромолекулах уменьшается доля сегментов, связанных с поверхностью водородными связями. Так, при концентрации винилацетата 0,1 ммоль/г сорбента их количество составляет 70%, а при семикратной концентрации — 40%. Это явление, обусловленное конкуренцией привитых макромолекул за связывание с поверхностью носителя, косвенно указывает на их взаимное переплетение, как это имеет место при адсорбции полимера из раствора [81].

Методами прививочной полимеризации получают сорбенты со значительно большим количеством привитой органической фазы и со значительно большими молекулярными массами (до 10б и более) в сравнении с методами адсорбции полимеров [60]. Однако при этом регулировать величину молекулярной массы значительно сложнее,.

33 кроме того, необходимо проводить дополнительные эксперименты по оптимизации количества адсорбированного мономера.

Прививка на поверхность пористого носителя винилсодержащих полимеров состава СВ2=СНСОЖ (СН2)2ЩСН3)2, СН2=СНСОЖ (СН2)2ЩС2Н5)2,.

СИ2- СНС (ЖН (СН2)2N' (СНз)&bdquoСН2=СНСОО СН2=СНС0ЖС (СН3)2СН2803 позволяет получить ряд композиционных ионообменных сорбентов [82]. Плотность прививки полимера определяется плотностью гидроксильных групп на поверхности носителя, длина же привитой цепи определяется количеством мономера. Привитые цепи, как правило, не имеют разветвлений и образуют слои со щеточной структурой. При сорбции белков и нуклеиновых кислот оптимальная толщина такого слоя составляет 5−50 звеньев. Подобные материалы называются «щупальцевыми» и имеют повышенную селективность к белкам, поскольку молекулы сорбата вблизи поверхности такого сорбента легко «оплетаются» иммобилизованными молекулами полимерной фазы за счет оптимальных электростатических взаимодействий и тем самым обеспечивается взаимодействие сорбата с полимерной фазой на удалении от поверхности носителя при отсутствии неспецифической сорбции.

ГЛАВА 4.

ПОЛУЧЕНИЕ КОМПОЗИЦИОННЫХ СОРБЕНТОВ С НЕТРАДИЦИОННЫМИ.

ПОЛИМЕРНЫМИ ФАЗАМИ.

Необходимость иметь в распоряжении лабораторий сорбенты, выдерживающие воздействие агрессивных сред, частую смену элюента и многократно регенерируемые без потери полезных свойств, обусловила разработку нового поколения полимерсодержащих композиционных материалов, в частности, фторсодержащих сорбентов. Эти материалы нашли широкое применение как при выделении низкомолекулярных соединений, так и при выделении и очистке биополимеров. Ранние работы в этой области были направлены на изучение функционализованных частиц полихлортрифторэтилена ПХТФЭ, который характеризуется хемостойкостью, гидрофобностью и высокой механической прочностью.

При обработке ПХТФЭ литийи магний-органическими соединениями (н-бутиллитий, ариллитий, алкил-магний, арилмагний) получали материалы с пониженным содержанием хлора, содержащие алкильную группу [83]. Оптимальный выход реакции наблюдали при трехкратном избытке металлоорганического компонента, при комнатной температуре в среде ТГФ. Полученный таким способом н-бутил-ПХТФЭ применяли при разделении смесей ароматических соединений в водно-метанольных смесях [84], в то время как немодифицированный материал не дал положительных результатов. Работы по изучению свойств фенил-ПХТФЭ подтвердили обращенно-фазовый механизм удерживания, поскольку зависимость селективности к метиленовому звену от вида и содержания органического компонента в элюенте была линейной [85]. Модификацией ароматического ядра в цепи фенил-ПХТФЭ были получены сильные катионои анионообменники с емкостью около 0,2 ммоль/г [86]. Эти материалы характеризовались сочетанием обращенно-фазовых и ионообменных эффектов. Подобные материалы находили применение при разделении близких по строению лекарственных соединений пиридоксин, пиридоксамин и т. п.), а также при концентрировании следов органических соединений из водных растворов [87].

ПХТФЭ, модифицированный триалкил (С8-С10) метиламмонием либо четвертичным аммониевым соединением КРС-5 использовали в разделении т-РНК, нуклеотидов, нуклеозидов, ДНК-фрагментов [88−90]. Однако такие покрытия оказались недостаточно стабильными. ПТФЭ-частицы (или пленку) использовали также для иммобилизации различных ферментов (уреаза, лактат дегидрогеназа), однако емкость таких материалов оказалась невысока, вероятно, в связи с малым размером пор [91, 92]. В то же время колонки с подобными материалами оказались очень стабильными при различных значениях рН,.

Создание композиционных сорбентов на основе неорганических пористых матриц с фторполимерсодержащими покрытиями открыло новые перспективы для применения композиционных материалов при очистке биологически активных соединений. Модифицировав силикагель (гептадекафтордецил)диметилсиланом (ГФД), Берендсен [93] сравнил полученный им материал с силикагелями, модифицированными пропили н-децил-углеводородными аналогами. Основным преимуществом ГФД-фазы оказалось хорошее удерживание на ней фторсодержащих соединений. Бензол и фторбензол удалось разделить на ГФД-фазе, в то время как на не содержащих фтор аналогах такое разделение не удавалось. При этом с увеличением числа атомов фтора удерживание усиливалось.

Было также показано [94], что ГФД-фаза слабее удерживает ароматические соединения, нежели С18 фазы. Однако эффект этот вызван не укорочением углеродной цепи лиганда. Было найдено, что при добавлении в подвижную фазу фторсодержащего компонента (трифторэтанола) селективность ГФД-фазы к фторсоединениям подавлялась, в то время как ряд не содержащих фтор соединений (ацетофенон, например) удерживались на ГФД сильнее, чем на С18 фазе. В удерживании полициклических ароматических углеводородов перфторэтоксиэтанольной фазой обнаружен вклад индукционных взаимодействий между С-Р диполями и электронами сорбатов [95]. Аналогичные результаты получены при изучении пентафторфенил-модифицированных силикагелей, в особенности сильно сорбировавших галоген-содержащие соединения [96]. Данная тематика рассматривается в ряде публикаций [97- 99].

Поскольку фторсодержащие сорбенты, как правило, сорбируют неполярные соединения слабее, чем сорбенты, содержащие углеводородные полимерные фазы, было предложено десорбировать белки с фторсодержащих сорбентов, уменьшая содержание органического компонента в элюенте, что, кроме прочего, позволило бы выделять белки в неденатурирующих условиях. Это предположение оправдало применение ГФД-модифицированных сорбентов [100].

Довольно обстоятельное исследование было проделано в работе [93], в которой изучались аспекты адсорбции фторсодержащих соединений, в том числе биополимеров, на фторированных полимерных матрицах. В работе сделан вывод, что природа взаимодействия предварительно полученного перфторалкилсодержащего белка с фторсодержащей углеродной поверхностью неизвестна. Предполагалось, что при этом имеет место особое, так называемое, «фтор-обусловленное» взаимодействие, отличное от обычно наблюдаемых при обращенно-фазовом разделении эффектов.

Весьма устойчивый так называемый бифильный сорбент был создан модификацией наружной поверхности частиц перфторбутилэтилендиметилсилильными группами для уменьшения адсорбции липофильных сорбатов (белков крови, например), в то время как внутренняя поверхность пор модифицировалась октадецильными группами для адсорбции низкомолекулярных соединений [101]. Такой материал позволил определять различные лекарственные препараты в крови человека. Этот сорбент по своему строению принципиально сходен с известными т. н. сорбентами Пинкертона [102], внешняя поверхность которых гидрофилизована и не удерживает компоненты смесей лекарственных препаратов и пептидов в биологических жидкостях, а внутренняя поверхность пор (до 98% всей поверхности) гидрофобизована трипептидом глицинфенилаланинфенилаланила. Протеины не проникают внутрь частиц сорбента в виду больших размеров, в то время как метаболиты лекарственных соединений хроматографируются во внутреннем объеме пор.

Альтернативный способ синтеза композиционных фторполимерсодержащих сорбентов был предложен в работах [103−105]. Способ заключается в радиационной постполимеризации тетрафторэтилена на пористых кремнеземах. Эти материалы очень устойчивы в широком диапазоне рН, в различных органических растворителях, при высоких температурах (до 200°С). Методика синтеза позволяет сохранить пористость исходной матрицы. Эти сорбенты использовали при селективной адсорбции биологических молекул, либо для адсорбции нежелательных примесей. Оба эти процесса оказалось возможным регулировать, изменяя полярность элюента при обращенно-фазовой хроматографии. Эти материалы можно применять также для эксклюзионной хроматографии. Эффективность применения такого сорбента можно продемонстрировать на примере отделения плазмидной ДНК от сопутствующих белков и РНК, причем, РНК и белки обратимо сорбируются. Плазмидная ДНК выходит в первой фракции при элюции 7Э-буфером (рН 7,5). При последующей элюции 50% метанолом РНК и белки также выходят в первой фракции. При отделении всех нуклеиновых кислот от белков требуется проведение градиентной элюции ацетонитрилом в смеси 0,01 М Тш-НС1. Нуклеиновая кислота выходит одним пиком при 10% концентрации ацетонитрила. В качестве примера можно привести очистку плазмиды рВК 322 от РНК и белков. Эту процедуру можно выполнять также в пластиковом картридже, содержащем всего около 300 мг сорбента. Начальный раствор в 0,01 М Тш-НСЛ буфере (рН 7,5−8,2) прокачивали с помощью шприца через картридж. Плазмидная ДНК выходила вместе с элюатом, РНК и белки сдрбировались на поверхности сорбента. Элюцию РНК проводили 5% и 10% ацетонитрилом. РНК фракция содержала РНК молекулы различной молекулярной массы, которые выходили последовательными пиками и давали две зоны в 1% агарозном геле.

В работах [106−108] для получения композиционных трифторстиролсодержащих сорбентов радикальной сополимеризацией в массе синтезировали сополимер трифторстирола и метилвинилдиэтоксисилана альтернативными методами. Так, силикагель ЗИшогЪ 300 модифицировали сополимером, вводя раствор сополимера в суспензию навески силикагеля в абсолютном толуоле с последующим кипячением, фильтрацией через ПТФЭ-мембрану и промывкой горячим абсолютным толуолом. Блокирование остаточных силанольных групп проводили кипячением сорбента в толуоле в присутствии гексаметилдисилана. Кроме того, силикагель, предварительно модифицированный тетрафторэтиленом, помещали в ампулу, присоединяли к вакуумной установке, охлаждали до 77 К и облучали^{-источником} (дозой 3−5 Мрад). Затем образец постепенно нагревали до 333 К и в систему впускали парообразный трифторстирол. Ампулу термостатировали 18 часов при 333 К. Сорбент затем промывали толуолом для удаления димера трифторстирола.

Показано, что политрифторстиролсодержащие сорбенты, синтезированные двумя способами, имеют близкие адсорбционные и хроматографические свойства и занимают промежуточное положение по этим свойствам между кремнеземами, модифицированными политетрафторэтиленом и стиролом. Синтез сорбентов путем последовательной^{-инициированной} пост-полимеризации тетрафторэтилена и трифторстирола на поверхности кремнеземов позволяет получать материалы, обладающие высокой гидролитической стабильностью. На их основе синтезировали катионои анионообменники с широким диапазоном концентраций ионообменных групп.

Таким образом, фторполимерсодержащие сорбенты, благодаря своим свойствам (высокая хемои термостойкость, низкая адсорбционная активность, высокая селективность к соединениям различных классов) перспективны для различных типов ВЭЖХ биополимеров.

В качестве альтернативы фторполимерсодержащим сорбентам можно привести пример композиционного сорбента на основе макропористого стекла, модифицированного полипараксилиленом [110]. Исходным мономером при этом служит п-ксилилен СН2-С6Н4-СН2-СН2-С6Н4-СН2, который в обычных условиях существует в виде циклического димера. Пиролизом при 600° С его переводят в мономерное состояние в газовой фазе, в присутствии неорганической матрицы с развитой поверхностью происходит интенсивная полимеризация с образованием тонкой (порядка 25−50 А толщиной по данным ртутной порометрии) сплошной пленки полимера на поверхности носителя, причем экранирование поверхности матрицы весьма существенно повышает устойчивость данного сорбента в условиях щелочного гидролиза и при этом сохраняется пористость исходной матрицы. Возможность ввода различных заместителей в мономер существенно расширяет применимость данной методики синтеза для получения сорбентов с заданными свойствами, однако относительная дороговизна исходных материалов и необходимость в установке для пиролиза несколько ограничивают темпы разработки таких материалов.

В работе [5] сообщалось также о синтезе композиционного сорбента с применением другого нетрадиционного материала. Комплекс полидиметилдиаллиламмоний хлорида (ПДМДААХ), с предварительно иммобилизованным инициатором полимеризации (пероксид водорода), наносили на поверхность пористой неорганической матрицы (МПС-2000 ГХ), удаляя растворитель, а з^тем вводили раствор акриламида в количестве, необходимом и достаточном для формирования набухающего пришитого к ПДМДААХ акриламидного геля. По результатам предварительных экспериментов сорбент оказался селективен к паре нуклеиновая кислота-белок, при этом белковые компоненты выходят с фронтом элюента, а нуклеиновые кислоты сорбируются неподвижной фазой.

Еще одним нетрадиционным мономером для синтеза композиционных сорбентов оказался анилин. Полианилин, как известно, впервые был описан еще в 1910;1912 г. г. (открыт в 1862 г.) как существующий в четырех окисленных состояниях, каждое из которых имеет октамерную структуру. В 1950;1960;х г. г. появились статьи по олигомерам полианилина и электрохимическому окислению. Термин «полианилин» сегодня относится к полимерам, состоящим из более чем 1000 звеньев, которые можно рассматривать как производные полимера с основной формулой, представленной на рис. 1 [111, 112], и содержащего чередующиеся восстановленные повторяющиеся единицы и окисленные повторяющиеся единицы. Иминные атомы азота в любом образце могут быть протонированы полностью или частично. Степень протонирования определяется окисленным состоянием полимера и рН водной кислоты. Полианилин может существовать в виде различных окисленных состояний, в форме основания или соли (протонированная форма). В форме основания различают три окисленных состояния полианилина: лейкомеральдиновое (ЛЭО), эмеральдиновое (ЭО) и пернигранилиновое (ПГО) основания. ЭО представляет собой полимер, в котором чередуются мономерные звенья в восстановленной-ЛЭО и в окисленной-ПГО формах.

Рис. 1. Основные формы полианилина и их взаимопревращения. АРБперсульфат аммония.

Единственной устойчивой протонированной формой полианилина является эмеральдиновая соль ©. В зависимости от метода получения можно выделить два вида полиэмеральдина [113]. Они отличаются друг от друга структурой протонированной формы. Обе формы получают с использованием различных окислителей и растворителей. Они имеют различные электрофизические и магнитные свойства. Частично протонированную соль полианилина можно получить полимеризацией в кислой среде с помощью окисляющих агентов, например, персульфата аммония в водном растворе соляной кислоты в виде осадка эмеральдиновой соли (эмеральдин гидрохлорид) темно-зеленого цвета, в состав которого входит 42% протонированных атомов азота. Этот полимер можно депротонировать водным раствором гидроксида аммония с образованием черно-синего эмеральдинового основания. Если депротонирование проводить в атмосфере инертного газа, основание будет несколько восстановлено. Если же проводить процесс на воздухе, то основание будет частично окислено. Кроме того, полианилин в допированной форме является электропроводящим полимером [114].

Уже это простое перечисление форм, в которых может существовать полианилин, указывает на сложности, сопряженные с синтезом полианилинсодержащих сорбентов и, вместе с тем, на возможности, открываемые применением таких сорбентов. Первые сообщения о принципиальной возможности использования полианилина как материала для хроматографических сорбентов относятся к 90-м г. г. [115, 116]. Наряду с этим появлялись работы по изучению уникальных свойств полианилиновых растворов и пленок. Так, в работе [117] обсуждается приготовление и свойства химически модифицированного пленочного элемента из поли-(п-хлор-анилина) для детекции pH. В некоторых работах, например в [118], указывается на возможность получения пленок полианилина с весьма упорядоченной однородной структурой. Эти свойства в будущем, несомненно, найдут применение при синтезе сорбентов.

Простота и преимущества синтеза полианилинсодерджащих сорбентов определяются прежде всего мягкими условиями полимеризации (комнатная температура, водная среда, отсутствие дорогого и сложного оборудования). Сложности заключаются в недостаточной изученности кинетики процесса, что определяет, в основном, эмпирический подход к подбору состава реакционной смесив превалировании побочных реакций при определенных условиях и формировании сильно разветвленных структур полимера на поверхностив нерастворимости полианилина в подавляющем большинстве органических растворителей (в этом, вместе с тем, заключается определенное преимущество полианилина как компонента композиционного сорбента), в связи с чем сильно затруднено изучение характеристик полимера. Однако преимущества, даваемые таким сорбентом (/¿-//-управляемая неподвижная фаза, визуализация разделения, комбинирование в одном сорбенте в зависимости от условий проведения элюции эффектов гель-фильтрации, обращенно-фазового разделения и ионнообменного механизмов) объясняют необходимость оптимизации методик синтеза и применения полианилин-содержащих сорбентов.

Приведенный в настоящей работе обзор литературных данных, конечно же, не исчерпывает всего многообразия синтетических композиционных материалов на основе макропористых полидисперсных неорганических носителей. Однако информация, представленная в нем, свидетельствует о том, что сегодня такие материалы находят широкое применение в проведении все более сложных анализов как с помощью ВЭЖХ, так и с применением альтернативных методов, вплоть до самых нетрудоемких, и вместе с тем весьма результативных. Потребность в таких материалах обусловливает значительное расширение набора модифицированных сорбентов. Прогресс в этой области привел, например, к появлению материалов, различным образом модифицированных по внешней и внутренней поверхностям, сорбентов, изменяющих топологию поверхности, а следовательно, и сорбционные характеристики при изменении рН среды либо температуры (так, в [119] описывается методика проведения противоточной хроматографии со сформированными /"//-зонами для предсказания гидродинамического механизма процессов разделенияпоявились весьма устойчивые к агрессивным средам и стабильные в широком интервале рабочих условий сорбентыизучаются и используются возможности регулирования гидродинамических процессов в колонках с псевдоожиженным слоем под воздействием магнитного поля [120], предлагаются способы проведения хроматографического процесса с использованием так называемых колонок с контролируемым электрическим зарядом, в которых между слоем твердого электропроводящего сорбента и электродом, соединенным с корпусом колонки, накладывают электрический потенциал, что обеспечивает эффективное разделение компонентов при хроматографии [121]). Снизилась, по общим оценкам, себестоимость композиционных материалов и трудоемкость методик их синтеза.

Таким образом, создание современных композиционных материалов является актуальной междисциплинарной проблемой, которую невозможно успешно разрешить, не обращаясь к изучению химических, физико-химических, биохимических, технологических аспектов в их комплексе, обобщая и анализируя все данные, накопленные при использовании каждого конкретного подхода.

В связи с этим поиск новых доступных и перспективных материалов для получения композиционных сорбентов, разработка оптимальных и масштабируемых методик синтеза, а также методов тестирования полученных композиционных материалов представляются закономерными и необратимыми.

АВТОР ЗАЩИЩАЕТ:

1. Способ получения композиционных полифторбутадиенсодержащих сорбентов на основе дисперсных объемно-пористых носителей, отличающихся высокой селективностью при выделении и очистке нуклеиновых кислот.

2. Оптимальные условия получения сорбентов, обеспечивающие иммобилизацию равномерной тонкой пленки полимера на поверхности объемно-пористых частиц носителя, а также повышенное содержание фтора в иммобилизованных полимерных пленках.

3. Дифторид ксенона в качестве фторирующего агента для получения композиционных полифторбутадиенсодержащих сорбентов с повышенным содержание фтора, обусловливающим низкий уровень неспецифической сорбции при выделении нуклеиновых кислот.

4. Оптимальные значения молекулярной массы и состав исходных олигобутадиенов, используемых при иммобилизации тонких полимерных пленок на поверхности объемно-пористых носителей для последующего фторирования.

5. Композиционные полифторбутадиенсодержащие сорбенты на основе кремнеземов для получения чистых препаратов ДНК из различных источников с высоким выходом.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ИСХОДНЫЕ ВЕЩЕСТВА, РЕАГЕНТЫ, МАТЕРИАЛЫ.

Макропористые стекла: МПС-2000ГХ, МПС-1150ГХ, МПС-500ГХ, МПС-250ГХ (производства Горьковского опытного завода ВНИИНП, Россия, фракция 0.25−0.5 мкммакропористые стекла предварительно замачивали в 18% соляной кислоте в течение 3 сут, отмывали водой до нейтральных значений pH, сушили до постоянного веса в вакуумном сушильном шкафу 17 ч при 70°) — CPG-10−500 (производства фирмы Proligo, Германия, фракция 100 мкм) — GPB-500-Trisopor™ (производства фирмы Shuller, Германия, фракция 100−200 мкм).

Олигобутадиен, молекулярная масса 5000, сод. 1,2 — звеньев — 20%, сод. 1,4 -звеньев — 80%, Aldrich, Германия. н-Пентан — марки х.ч., ГОСТ.

Метиловый спирт, ГОСТ 5962–67.

Кислота соляная — марки х.ч., ГОСТ.

Вода — стандарт Milli Q.

Ферменты: РНКаза (Calbiochem, Швейцария), рестриктазы Ecu RI, Hinfпредоставлены фирмой MIRA-Diagnostica, GmbH, Германия.

Бактериальные штаммы предоставлены фирмой MIRA-Diagnostica, GmbH, Германия.

Образцы плазмид предоставлены лабораторией генной инженерии Учебного центра ИБХ им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН.

Препараты человеческой крови предоставлены Научно-исследовательской лабораторией прикладной экологии Минздравмедпрома РФ, Москва.

Лизирующая система (буфер для лизиса клеточной стенки, оболочки и протеолиза, а также смесь детергентов) — предоставлены фирмой MIRA-Diagnostica, GmbH, Германия.

Набор для выделения бактериальных ДНК QiaAmp (Qiagen, Германия).

Реагенты для проведения электрофореза: агароза (Fluka, Швейцария), акриламид (Merk, Германия), А^ТУ'-метилен-бис-акриламид (Merk, Германия), Трис (Merk, Германия), Na г. ЭДТА (Sigma, Германия) — додецилсульфат натрия (Sigma, Германия), персульфат аммония (Sigma, Германия), ТЕМЕД (Sigma, Германия), красители (оранжевый Ж, этидиума бромид, бромфеноловый синий, кумасси (Roti-blue) — все фирмы Merk, Германиябуфер Laemmly (Aldrich, Германия), глицерин (Aldrich, Германия), ß—меркаптоэтанол (Aldrich, Германия), кислота уксусная (Aldrich, Германия), сульфат аммония (Sigma, Германия), глицин (Aldrich, Германия) — маркер (белковая смесьлизоцим, 12 кДа, ß—лактоглобулин, 19 кДа, угольная ангидраза, 28 кДа, овальбумин, 45 кДа, бычий сывороточный альбумин, 68 кДа, фосфорилаза В, 107 кДа, миозин (Я-цепь), 208 кДа) — предоставлен фирмой MIRA-Diagnostica, GmbH, Германия.

Реагенты для проведения ПЦР: растворы нуклеотидов, буфер (Perkin Elmer, США) — праймеры — предоставлены фирмой MIRA-Diagnostica, GmbH, Германия.

Буферный растворы: ТЭ, pH 1А (Трис, М^-ЭДТА), боратный буфер, pH 9.0, ТБЭ, pH 8.0 (Трис, борная кислота, М^-ЭДТА).

АППАРАТУРА.

Ртутный порометр Pore Sizer 9300 (Micromeretics, США) — ультразвуковая ванна-УФ-спектрофотометр DU-70 (Весктап, США) — /7#-метр ОР-211/1 (Radelkis, Венгрия) — ИК-спектрофотометр Specord IR 75 (Carl Zeiss, Jena, Германия) — центрифуга Centrifude 5414 (Labomed Eppendorf, Германия) — прибор для настольного электрофореза GNA-10 (Pharmacia, Швеция) — фотосканер (Perkin Elmer, США) — термостат Julabo.

Labortechnik, GMBM, Германия), хроматограф жидкостный (Весктап, США) — амплификатор (Perkin Elmer, США) — весы электронные (Sartorius-120, Великобритания) — насос перистальтический Varioperpex 2120 (.LKB, Швеция) — хроматографические колонки для жидкостной хроматографии 5×10 см (Pharmacia, Швеция) — пластиковые картриджи со сборниками Lila (Турция) — предоставлены фирмой MIRA-Diagnostica, GmbH, Германия.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Синтез полифторбутадиенсодержащих сорбентов проводили на установке, представляющей собой вакуумируемый сосуд (объемом 100 мл), содержащий навеску носителя (10−15 г), соединенный со снабженным поршнем цилиндром, содержащим предварительно подготовленный раствор олигобутадиена (0.125−1.25 г /г носителя, т. е. исходя из загрузки, эквивалентной моно- - десяти-молекулярным слоям олитгобутадиена на поверхности носителя в зависимости от площади поверхности носителя) в н-пентане (45−50 мл) (рис. В). Сосуд снабжен также трубкой с вентилем, соединенной с линией вакуумного насоса. После вакуумирования линю насоса перекрывали, затем подавали раствор олигомера через трубку, устроенную таким образом, что раствор, проходя сквозь слой носителя, смачивает его, интенсивно впитываясь в поры частиц. При этом образуется равномерно смоченный плотный слой носителя. Сосуд затем помещали на 15 мин в ванную для обработки ультразвуком при атмосферном давлении. После озвучивания суспензии растворитель отгоняли на роторном испарителе (3 ч, 30 об/мин) с использованием водяной бани (70°С). Образовавшийся полупродукт был окрашен в белый цвет и не смачивался водой. Проводя последующую сушку в вакуумном сушильном шкафу при комнатной температуре в течение 6 ч, получали полупродукт, который подвергали фторированию.

Фторирование полимерной фазы, адсорбированной на поверхности пор носителя, проводили на специальной установке в режиме «псевдоожижения», продувая аргон в течение 1−4 ч через реакционную трубку, заполненную навеской сорбента и парами возгоняемого при 65° С в специальной камере дифторида ксенона (рис. 5,6). Полученный сыпучий образец сорбента белого цвета не смачивается водой. Для удаления летучих побочных продуктов продукт в безкислородных условиях переносили в вакумируемую камеру, которую вакуумировали в течение 1.5 — 4 ч при температурах 25 -80°С.

Для оценки гидролитической стабильности сорбентов два образца МПС, немодифицированного и модифицированного фторполибутадиеном, одинаковой массы предварительно замачивали в 70% метаноле на ночь, затем добавляли равный объем буфера (рН 9,5), содержащего 0,025 М борат натрия и 0,1 М гидроксид натрия, осаждали сорбент, центрифугируя в течение 1 мин при 3000 об/мин, отбрасывали супернатант, вновь добавляли буферный раствор до получения 10% суспензии сорбента (по массе) и инкубировали образцы в этом буфере при комнатной температуре в течение 8 ч. Добавляли раствор 0,05 М молибдата натрия, подкисленный серной кислотой (1/200 объема раствора молибдата натрия) и перемешивали суспензию 10 минпосле осаждения сорбента пипеткой отбирали аликвоты надосадочной жидкости и измеряли интенсивность поглощения при Л=320 нм, снимая спектрограммы на спектрофотометре Векстап.

Элементный анализ проводили проводили в МИТХТ им. М. В. Ломоносова.

Ртутную порометрию образцов сорбента проводили на приборе «Роге Зггег 9300» (Млсготегейсв, США). Образец сорбента помещали в чашку пенетрометра, представляющего собой цолый открытый с двух концов стержень со стеклянной чашкой на одном конце, вакуумировали и приводили в контакт с металлической ртутью. Ртуть заполняла внутренний стержень пенетрометра и объем чашечки, свободный от частиц сорбента, затем к открытому концу пенетрометра прикладывали давление. При этом ртуть вдавливалась в поры сорбента, а внутренний объем стержня пенетрометра частично освобождался. По разнице электрической емкости конденсатора, «пластинами» которого служат металлическая поверхность стержня пенетрометра и поверхность столбика ртути, рассчитывали объем вдавленной в поры ртути. Численные значения среднего диаметра и удельного объема пор для построения порограмм определяли, используя разработанный в лаборатории «Полимеры для биологии» ИБХ им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН алгоритм расчета для ЭВМ. Зависимости объема вдавленной ртути при данном давлении от диаметра пор представляли в виде дифференциальных кривых вдавливания ртути или, что-то же самое, в виде кривых распределения пор по эффективным диаметрам.

Степень удерживания иммобилизованной полимерной фазы поверхностью носителя в растворителе, являющимся хорошим для немодифицированного олигомера, определяли, инкубируя образцы сорбентов в герметических сосудах в н-пентане при перемешивании в течение 48 ч, а затем отбирали аликвоты надосадочных жидкостей и измеряли остаточные массы перешедшего в раствор олигомера. При этом сравнивали образцы модифицированных при различных режимах фторирования сорбентов с нефторированным образцом.

Микроскопию образцов сорбентов проводили, используя микроскоп Olympus Vanox-T со встроенной фотосистемой. Исследовали образцы суспензий сорбентов в 50% метаноле. Масштабную линейку наносили на отпечаток.

ИК-исследование образцов сорбентов проводили методом ИК-микроспектроскопии на ИК-спектрометре с преобразованием Фурье SPECTRUM 2000 с ИК-микроскопом I-серии фирмы 11 Per kin-Elmer" (США). Условия съемки — диапазон -4000* 500 см" 1, разрешение — 4 см" 1, число сканирований — 200. Пробоподготовка заключалась в раздавливании образца в алмазной кювете высокого давления фирмы «Highg Pressure Diamond Optics, 7JVC» (CIIIA).

УФ-исследование проводили на УФ-спектрофотометре DU-70 (Весктап, США) по стандартной схеме с использованием 1.5 кварцевых кювет.

Очистку плазмидной ДНК осуществляли, нанося раствор (400 мкл), содержащий ДНК, РНК и сопутствующие белки в ТЭ-буфере после щелочной экстракции клеточного лизата (очистка была более эффективной, если из препаратов дополнительно удаляли с помощью хлорида лития рибосомную РНК) на сорбент, содержащийся в пластиковом картридже (7×25 мм) вмещающем 0.3 г сорбента. Фракции элюата собирали в микропробирки (по 400 мкл в каждую). Наличие ДНК во фракциях подтверждали спектрофотометрически при 2=260 нм и по результатам электрофореза в 0.8% агарозном геле в ТБЭ-буфере. ДНК окрашивали бромидом этидиума и фиксировали при облучении длинноволновым УФ-светом.

Получение препарата ДНК ядросодержащих клеток крови. 15 мл крови центрифугировали для отделения форменных элементов, эритроциты лизировали, ядросодержащие клетки концентрировали центрифугированием. Проводили лизис клеток и их ядер с одновременной обработкой протеиназой К при 37 °C в течение ночи.

Выделение ДНК из крови человека проводили, нанося 200 мкл исследуемого образца, на колонку 7×26 мм, содержащую сорбент МПС-2000ГХ-ПФБД. Использовали линейный градиент изопропанола (0 — 70%, 60 мин) в ТЭ-буфере.

Очистка ДНК сорбцией примесей в объеме проводили, разбавляя в два раза ТЭ-буфером препарат, полученный после лизиса клеток и обработки протеиназой К, вносили в пробирку, содержащую примерно такой же объем суспензии сорбента в ТЕ-буфере, встряхивали 5−10 мин, инкубировали раствор с сорбентом еще 10 мин (все операции проводили при комнатной температуре), седиментировали 2 мин на настольной центрифуге центрифугированием при 3000 об/мин и отбирали супернатант. Далее сорбент заливали новой порцией ТЭ-буфера (равной объему сорбента) и процесс повторяли.

Лизис бактериальных клеток проводили, по методике, разработанной фирмой MIRA-Diagnostica, GmbH, Германия. 1.5 мл клеточной суспензии в разведении 104 центрифугировали 2 мин при 13 000 об/мин, осадок обрабатывали лизирующими буферами. Метод включал обработку клеточных осадков буфером, содержащим протеиназу, РНКазу, а также буфером, содержащим смесь детергентов. Процедура занимала не более 25 мин.

Выделение бактериальных ДНК, проводили, нанося полученный лизат (200 мкл) на картриджи с сорбентом (не более 0.3 г) и центрифугируя картриджи, вставленные в центрифужные колонки-сборники в течение 1 мин при 2000 об/мин.

Процедуру выделения ДНК из бактериальных культур на колонках типа Qia Amp (iQiagen) проводили по стандартной методике фирмы Qiagen.

Выход ДНК в собранных элюатах определяли спектрофотометрически, а также проводя агарозный (0.8−1%) электрофорез при 75 А в ТБЭ-буфере. Пробы наносили по 1015 мкл в лунку. Пробы окрашивали бромидом этидиума, визуализировали в УФ-свете и фотографировали с помощью фотосканера.

Белковый электрофорез проводили, используя 12.5% разделяющий гель (1.5 М Трис-НС1, рН 8.8, 40% акриламидную смесь, 10% додецилсульфат натрия, 10% персульфат аммония, 1% ТЕМЕД), а также концентрирующий гель (0.5 М ТрисЯС/, рН 6.8, 40% акриламидную смесь, 10% додецилсульфат натрия, 10% персульфат аммония и 0.5% ТЕМЕД). Пробы готовили с использованием Laemmlyбуфера. Электрофорез проводили при 25−35 А для выхода проб из лунок, при 75 А — до входа в разделительный гель, при 120 А — до окончания процесса. Гель окрашивали в растворе Кумасси (Roti-blue).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

1. Предложен новый способ получения композиционных фторполимерсодержащих сорбентов, заключающийся в проведении фторирования предварительно иммобилизованной на поверхности дисперсных объемно-пористых носителей полимерной фазы.

2. Определены оптимальные условия для иммобилизации и фторирования полимерной фазы на поверхности дисперсных объемно-пористых носителей.

3. Впервые при получении композиционных полифторполимерсодержащих сорбентов на основе объемно-пористых кремнеземов использован дифторид ксенона в качестве фторирующего агента.

4. Показано, что при использовании дифторида ксенона в качестве фторирующего агента возможно в мягких условиях получать композиционные ПФБД-содержащие сорбенты, сохраняющие пористость и механическую прочность, присущие исходному носителю, и вместе с тем отличающиеся повышенным содержанием фтора, что исключает неспецифическую сорбцию при выделении нуклеиновых кислот.

5. Показано, что полученные композиционные сорбенты обладают повышенной гидролитической стабильностью в щелочных средах.

6. Показано, что полученные композиционные ПФБД-содержащие сорбенты характеризуются низким уровнем неспецифической сорбции и высокой селективностью при выделении нуклеиновых кислот. Предложены эффективные методы использования полученных сорбентов при выделении ДНК из различных источников.