ЦАМФ-и Ca2+/кальмодулин — зависимые системы фосфорилирования нейрональных белков как мишень для действия антиконвульсантов

Актуальность проблемы:

Эпилепсия представляет собой большую группу клинических заболеваний, которым подвержено около 1% взрослого населения, при этом только 40% случаев заболевания эпилепсией поддается медикаментозному лечению, в то время как нейрохирургическое вмешательство (резекция ткани мозга у больных или нейротрансплантации) не всегда дает положительный эффект (Карлов, 1990). В настоящее время считается, что наследственные формы эпилепсий являются заболеванием мозга в целом (Богданов, 1997; Акимова и др., 2000). С этой точки зрения правомерен вопрос о том, в какой степени изменения функциональных или морфологических свойств индивидуальных нейронов, а также нейронов определенных структур головного мозга могут быть ответственны за эпилептогенез. Широкое разнообразие клинических форм эпилепсии свидетельствует о необходимости анализа клеточных и молекулярных механизмов инициации и развития заболевания.

На различных моделях эпилепсии на животных показано, что эпилептогенез сопровождаться многочисленными метаболическими нарушениями в нейронах, включающими в себя изменения экспрессии генов, внутриклеточного гомеостаза Са2+ и энергетики нейронов, изменением кластеризации и свойств различных рецепторных комплексов, в частности, ГАМКи глутаматных, изменением проводимости ионных каналов, а так же морфологическими перестройками, приводящими к созданию гипервозбудимости нейрональных сетей. Нарушение функционирования нейронов в значительной степени определяется изменениями внутриклеточной системы регуляции различных клеточных процессов — системы вторичных посредников. Конечными эффекторами системы вторичных посредников являются протеинкиназы (протеинфосфотрансферазы) — ферменты, осуществляющие регуляцию большинства рецепторных и канальных белков, а так же белков цитоскелета посредством одной из наиболее распространенных посттрансляционных модификаций — фосфорилированием. Са2+/кальмодулин- (СаМКП) и цАМФ- (РКА) зависимые протеинкиназы, а также Са2+/кальмодулин-активируемая протеинфосфатаза 2 В (кальцинейрин), локализованные как пре-, так и постсинаптически, являются ключевыми ферментами взаимомодулирующих путей реализации действия двух важных внутриклеточных вторичных посредников — Са2+ и цАМФ. Начиная с открытия Э. Сазерлендом регуляторного действия цАМФ (Sutherland, 1972), последующие исследования л, функционирования белков-эффекторов систем цАМФи Са /зависимого проведения сигнала показали, что различные пути вторичных посредников взаимомодулируют друг друга, образуя разветвленную регуляторную сеть, специфичность ответа которой определяется рецепторными комплексами, запускающими внутриклеточные каскады фосфорилирования/дефосфорилирования, набором и компартментализацией белков-эффекторов. Большой интерес представляет изучение фосфорилирования ассоциированного с микротрубочками белка 2 (МАР2), который является одним из связующих звеньев между данными регуляторными внутриклеточными системами, а также морфологией и функциональной активностью нейрона. Фосфорилирование этого белка CaMKII и РКА регулирует динамику сборки/разборки тубулинового цитоскелета и взаимодействие микротрубочек с другими элементами цитоскелета, что, в свою очередь оказывает влияние на внутриклеточный транспорт, кластеризацию рецепторов, синаптическую передачу и поддержание формы дендритов. Изменения фосфорилирования белков, а также активности или содержания CaMKII, PICA и кальцинейрина показаны при долговременной потенциации синаптической передачи, процессах, связанных с обучением и некоторыми патологическими состояниями мозга. Кратковременное увеличение уровня внутриклеточного Са2+ и цАМФ вследствие судорожной активности запускает каскад как морфологических (изменением состояния цитоскелета посредством изменения фосфорилирования цитоскелетных белков), так и биохимических изменений, приводящих к долговременной активации генома и образованию так называемых «эндогенных антиконвульсантов» — адаптационных перестроек, препятствующих развитию гипервозбудимости и являющихся мишенями действия некоторых антиконвульсантов (Post, 2004). Известно, что такие антиконвульсанты, как вальпроат натрия и мелатонин являются «универсальными» антисудорожными агентами при различных формах эпилепсии. Антиэпилептическое действие данных препаратов в основном объясняется их влиянием на ГАМК-ергическую систему мозга, однако представляется вероятным, что их эффективность может опосредоваться влиянием на систему внутриклеточной регуляции, опосредованную Са2+ и цАМФ. Комплексный анализ изменений в системах цАМФи Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков в мозге животных с наследственной предрасположенностью к судорогам, вызываемым звуком, несомненно, позволит выявить механизмы, ответственные за генерацию и поддержание судорожной активности и дать заключение о взаимосвязи между антисудорожным действием мелатонина и вальпроата натрия и изменениями в системах цАМФи Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков, что позволит обогатить существующие на сегодняшний день знания о механизмах действия антиконвульсантов широкого спектра действия и, возможно, дать дополнительное направление для разработки новых актиконвульсантов.

Цель и задачи исследования

.

Целью диссертационной работы является изучение участия систем цАМФи Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нсйрональных белков в механизмах развития и поддержания судорожной активности, а также в реализации действия антиконвульсантов широкого спектра действия мелатонина и вальпроата натрия.

Конкретные задачи исследования:

1. Выявление особенностей функционирования систем цАМФи Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования белков в мозге крыс линии Крушинского-Молодкиной (КМ), обладающих наследственной предрасположенностью к аудиогенным судорогам по сравнению с нечувствительными к звуковому воздействию крысами В и стар;

2. Сравнительный анализ изменений систем фосфорилирования нейрональных белков в мозге крыс линии КМ после однократных аудиогенных судорог и после хронического звукового воздействия (аудиогенного киндлинга);

3. Исследование влияния мелатонина и вальпроата натрия на активности протеинкиназ CaMKII и РКА in vitro;

4. Анализ влияния однократного введения мелатонина и вальпроата натрия на исследуемые системы фосфорилирования и аудиогенные судороги крыс линии КМ;

5. Изучение действия хронического потребления мелатонина и вальпроата натрия крысами КМ на параметры судорог и динамику развития миоклонуса при аудиогенном киндлинге;

6. Исследование отставленного действия введения мелатонина (50 мг/кг) крысятам КМ в критические для развития мозга периоды постнатального развития (1−7Р, 7−14Р и 14−21Р дни) на реализацию чувствительности к звуку в половозрелом возрасте, а также на системы цАМФи Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков и состояние синаптических контактов пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа.

Научная новизна.

В представленной работе впервые показано, что у животных с наследственной предрасположенностью к судорогам в различных структурах мозга, вовлеченных в реализацию судорожной активности, существует генетически детерминированное изменение содержания Са2+/кальмодулин-ре1улируемых ферментов — протеинкиназы CaMKII и протеинфосфатазы кальцинейрина, что может являться одним из механизмов, участвующих в формировании нейрональной гипервозбудимости. Показано, что даже однократное судорожное воздействие вызывает долговременные изменения содержания 8 а-субъединицы CaMKII и кальцинейрина в отдельных структурах мозга крыс КМ. Выявлено антисудорожное действие мелатонина и вальпроата натрия на различные типы аудиогенных припадков, а также потенциирующее действие мелатонина на антисудорожную активность вальпроата натрия при совместном применении антиконвульсантов. Впервые продемонстрировано, что антисудорожное действие мелатонина и вальпроата натрия при однократном введении сопровождается изменениями в системах цАМФи Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков. Показано, что применение мелатонина на ранних стадиях постнатального развития может оказывать как анти-, так и просудорожное отставленное действие в зависимости от постнатальных сроков введения, сопровождающееся изменениями исследуемых систем фосфорилирования и морфологическими модификациями синаптических контактов пирамидных нейронов поля САЗ гиппокампа, что предполагает более осторожный выбор антисудорожной терапии при лечении ювенильных эпилептических синдромов.

Научно-практическое значение.

Результаты, полученные в данной работе указывают на вовлечение систем фосфорилирования/дефосфорилирования нейрональных белков и белков цитоскелета в механизмы предрасположенности и реализации судорожных состояний и намечают подходы к разработке нового класса антиэпилептических препаратов, мишенью которых является система вторичных посредников.

Выводы:

1. Выявленные особенности содержания а-изоформы CaMKII, кальцинейрина и МАР2, а также активностей протеинкиназ CaMKII и РКА в отдельных структурах мозга крыс линии КМ по сравнению с Вистар, а также модификации функционирования систем цАМФи Са2+/кальмодулин-зависимого фосфорилирования после однократных аудиогенных судорог и аудиогенного киндлинга указывают на вовлечение этих систем фосфорилирования в механизмы инициации и генерализации нейрональной гипервозбудимости.

2. Установлено, что in vitro мелатонин и вальпроат натрия ингибируют общую активность CaMKII, константа ингибирования для вальпроата натрия по сайту связывания фермента с комплексом Са /кальмодулин составляет 35 мкМ.

3. Ослабление аудиогенных припадков при однократном введении мелатонина и вальпроата натрия сопровождается увеличением функциональной активности CaMKII в ряде структур мозга крыс КМ и, в меньшей степени, изменением активности РКА. Кроме того, введение вальпроата натрия вызывает увеличение Са2+/кальмодулин-зависимого и снижение цАМФ-зависимого фосфорилирования МАР2 в гиппокампе крыс линии КМ.

4. Хроническое потребление мелатонина не оказывает влияния на характер аудиогенных припадков крыс КМ при аудиогенном киндлинге, в то время как вальпроат натрия приводит к ослаблению судорожной реакции. Применение мелатонина совместно с вальпроатом натрия потенциирует антисудорожное действие последнего.

5. Выявлено отставленное действие введения экзогенного мелатонина крысятам КМ в ранний постнатальный период развития на реализацию судорожной готовности крыс в половозрелом возрасте: введение мелатонина с 1−7Р и 14−21Р оказывает слабое антисудорожное действие, в то время как применение препарата в период с 7−14Р имеет выраженный проэпилептогенный эффект.

6. На примере изучения антиконвульсантов двух различных фармакологических классов (мелатонин и вальпроат натрия) показано, что их действие реализуется с участием цАМФи Са /кальмодулин-зависимых систем фосфорилирования нейрональных белков. 1 2 3 4 5 6 7 8 9.

Заключение

.

Выявленные нами особенности функционирования цАМФи Са2+/кальмодулин-зависимых систем фосфорилирования нейрональных белков в мозге крыс линии КМ (изменение содержания и фосфосостояния МАР2 в неокортексе, увеличение функциональной активности CaMKII в н.б.ч. и неокортексе и активности РКА в н.б.ч., снижение содержания кальцинейрина в гиппокампе), свидетельствуют о существовании особого нейрохимического статуса ЦНС животных, обладающих генетической предрасположенностью к аудиогенным судорогам. Долговременные модификации этих систем при индукции однократных судорожных припадков и аудиогенном киндлинге, в первую очередь, значительное увеличение содержания нейроспецифической а-субъединицы CaMKII и кальцинейрина в гиппокампе крыс КМ после однократных аудиогенных судорог, служат подтверждением вовлечения цАМФи Са2+/кальмодулин-зависимых систем фосфорилирования в механизмы инициации и генерализации нейрональной гипервозбудимости. Можно предположить, что наблюдаемые нами изменения содержания а-САМКН и кальцинейрина после однократных аудиогенных припадков крыс КМ являются следствием судорожной активности, в то время как дальнейшие изменения содержания этих ферментов после аудиогенного киндлинга могут отражать сложное взаимодействие процессов эпилептогенеза и антогонистичных ему эндогенных перестроек, направленных на снижение возбудимости нейронов неокортексе и гиппокампе крыс КМ.

Следует отметить, что между исследуемыми системами фосфорилирования существует сложная взаиморегуляция, которая осуществляется через систему низкомолекулярных фосфопротеинов — ингибиторов протеинфосфатазы I (РР1) (Рис. 3.32). Впервые такое взаимодействие путей было предложено П. Грингардом для белка DARP32 дофаминергических синапсов, являющегося изоформой ингибитора I, широко распространенного в различных отделах ЦНС (Greengard et al., 1998; Rakhilin et al., 2004). PP1 дефосфорилирует как CaMKII, так и регуляторную субъединицу РКА, изменяя кинетику активации последней. В результате цАМФ-зависимого фосфорилирования ингибитор I подавляет активность РР1, что, в свою очередь, приводит к снижению дефосфорилирования активной автофосфорилированной формы CaMKII, продлевая время.

113 ее существования. В свою очередь, дефосфорилирование ингибитора I кальцинейрином устраняет его действие на РР1. Кальцинейрин также дефосфорилирует РКА (Rusnak and Mertz, 2000). цАМФ-зависимое фосфорилирование Са31-активируемой цистеиновой протеазы кальпаина, значительная часть которого в клетках заякорена на микротрубочках около МАР2, приводит к увеличению активности кальпаина, вызывая частичный протеолиз кальцинейрина и его активацию (Krebs and Graves, 2000; Wu et al., 2003). цАМФ-зависимая протеинкиназа и CAMKII имеют частично перекрывающуюся субстратную специфичность, но фосфорилируют различные остатки Ser или Thr субстрата, что также приводит к различной модуляции активности белка-эффектора.

Предполагаемая схема действия мелатонина и вальпроата натрия на уровне взаимодействия между системами цАМФи Са2Укачьмодулин-зависимого фосфорилирования нейрональных белков.

К числу таких субстратов относятся синапсин I, МАР2, субъединицы потенциал-зависимых Са2+ и Na+ каналов, а также АМРА-рецепторов и др. Изменение фосфорилирования ядерных субстратов CaMKII и РКА также регулирует активность генома. Так, субстратом РКА в ядре является, в частности, CRE-связывающий белок CREB. Недавно выявлено, что сплайсинговая варианта а"-СаМК11 имеет ядерную локализацию, хотя ее ядерные субстраты не установлены (Bayer and Schulman, 2001). Дополнительным регулирующим фактором, вероятно, может выступать уровень свободного кальмодулина, «доступного» для Са2+/кальмодулин-регулируемых ферментов (CaMKII, кальцинейрина), содержание которого в нейронах различных отделов мозга обычно меньше уровня кальмодулин-регулируемых ферментов, что предполагает наличие в клетках сложной регуляции его распределения. Таким образом, нарушение того или иного звена этой взаиморегуляции может не только вызывать нарушение фосфосостояния определенных белков в различных клеточных компартментах, но и напрямую влиять на геном.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что антисудорожное действие вальпроата натрия и мелатонина опосредуется влиянием этих антиконвульсантов на системы вторичных посредников. В отличие от вальпроата натрия, влияние мелатонина на судорожную активность определяется также его ядерными ROR/RTZ-рецепторами, регулирующими активность хроматина, поэтому применение мелатонина в критические для становления нервной системы периоды развития может оказывать не только антисудорожное, но и проэпилептогенное действие. В настоящее время модуляторное действие мелатонина и вальпроата натрия на возбудимость нервной системы связывают, в основном, с их действием на ГАМК-рецепторы (Смирнов, 2003; Johannessen, 2000). Учитывая высокую липофильность мелатонина и вальпроата натрия, выявленный нами линейный характер ингибирования ими активности CaMKII свидетельствует о возможном действии этих веществ непосредственно на уровне клеточных мишеней, например, через кальмодулин. Наиболее вероятным представляется, что наблюдаемые нами при введении антиконвульсантов изменения активностей протеинкиназ и фосфорилирования МАР2 (при введении вальпроата натрия) являются следствием сложной совокупности процессов взаимомодуляции различных структур мозга, действием мелатонина и вальпроата натрия на ГАМК-ергическую передачу и непосредственного влияния антиконвульсантов на уровне их клеточных мишеней, результатом которой является общее ослабление судорожного припадка. Учитывая универсальность цАМФи Са /кальмодулин-зависимых систем фосфорилирования, а также полифункциональность СаМКИ, РКА и кальцинейрина, введение животным мелатонина и вальпроата натрия в значительной степени меняет биохимический статус нервных клеток и может частично объяснять широкий спектр антисудорожного действия этих препаратов.