Применение биокатализа в биологических исследованиях

Применение в биолюминесценции

В качестве тест-объектов можно использовать реакции, катализируемые люциферазой, биферментной системой: НАДН: ФМН-оксидоредуктаза — люцифераза. Тесты на основе многозвенных цепей сопряжения ферментов с люциферазами позволили значительно расширить круг веществ, анализируемых биолюминесцентным методом и включить в него соединения, не принимающие непосредственного участия в биолюминесценции. Использование ферментативных реакций в качестве индикаторных систем реакции антиген антитело привело к созданию различных вариантов гомогенных и гетерогенных иммуноферментных методов, в которых в качестве ферментов маркеров наряду с пероксидазой хрена и щелочной фосфатазой используются люциферазы. Иммунобиолюминесцентные методы решают проблему избирательного анализа для веществ, не участвующих прямо или опосредованно в процессе биолюминесценции ксенобиотиков, ингибиторов биологической активности и токсикантов. В иммуноферментном биолюминесцентном анализе апробированы люциферазы почти всех светящихся организмов, причем наибольшей популярностью пользуется биолюминесцентная система светляков. Биолюминесцентный анализ используется в гистохимии для получения трехмерной картины распределения метаболитов в срезах тканей мозга, в «аутолюмографии» для определения локализации ферментов на фотопленку в полиакриламидном геле при электрофорезе и изоэлектрофокусировании. В последнее время для контроля популяций насекомых в сельском хозяйстве используют в качестве приманок их феромоны.

На основе ферментов люминесцентной реакции: люциферазы и НАДН: ФМН-оксидоредуктазы производятся комплекты реактивов для биолюминесцентного анализа. Комплект реактивов для аналитической биолюминесценции (КРАБ) используется как многокомпонентный реагент, иммобилизованный в крахмальном геле, разработаны методы определения активности NAD-зависимых дегидрогеназ лактатдегидрогеназы, алкогольдегидрогеназы, альдегиддегидрогеназы, протеаз и антипротеаз в плазме и сыворотке крови, биопсийном материале, платиноидов, и т. д. На основе КРАБа и гидрогеназы водородных бактерий разработаны методы определения активности гидрогеназы и концентрации растворенного водорода. Отличительной особенностью ферментативных биотестов по сравнению, с биотестами, выполненными на живых организмах, является возможность варьирования их чувствительностью, изменяя условия проведения анализа, а именно состав реакционной смеси (количество ферментов и субстратов, объем добавляемой токсической смеси) и последовательность добавления компонентов реакции (использование прямой или обратной ADH-реакции и т. д.). В экологических исследованиях биолюминесцентные тесты in vivo и in vitro взаимодополняют друг друга. Совместное использование биотестов позволяет расширить круг анализируемых токсикантов. В люциферазных биотестах действие токсических веществ происходит непосредственно на люциферазу ключевой фермент метаболизма светящихся бактерий. В случае светящихся бактерий прямое влияние токсикантов на люциферазу ограничено клеточной стенкой и мембраной бактерий, препятствующих свободному проникновению любых посторонних веществ в клетки, однако происходит влияние на другие важные процессы жизнедеятельности клетки, так или иначе связанные с биолюминесценцией, например, дыхание. Совместное использование биолюминесцентных биотестов in vivo и in vitro позволяет получать разностороннюю информацию о механизмах воздействия токсических веществ. Использование нескольких биотестов одновременно гарантирует полное обследование водоемов и водозаборов на токсичность независимо от структуры и физико-химических свойств токсикантов, токсичных как для целого организма, так и для клеток и ферментов. При этом в присутствии токсических веществ свечение может как уменьшаться, так и увеличиваться. Показателем наличия в среде токсичности служит изменение интенсивности исследуемого образца в сравнении со свечением в контроле.