Актуальность вопроса.
По данным ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется до 275 млн. диарей-ных заболеваний среди детей и взрослых, занимая второе место по частоте после острых респираторных вирусных инфекций. В Российской Федерации (РФ) ежегодно регистрируется около 1 млн. случаев острых кишечных инфекций (ОКИ), при этом показатель заболеваемости в 2007 -2008 гг. составил 509,8 — 512,3 на 100 тыс. населения и не имеет тенденции к снижению [32]. В структуре кишечных инфекций удельный вес сальмонеллеза составил 6,96% -6,97% в 2007;2008 гг. В последние годы наиболее часто выявлялись Salmonella Enteritidis [32, 77]. Всё это наносит существенный вред здоровью людей и экономический ущерб обществу [98- 119].
В условиях повсеместного распространения и многолетней тенденции к росту заболеваемости особую озабоченность вызывает низкая эффективность профилактических мер при данной инфекции, это связывают с видовым разнообразием сальмонелл, высокой' их жизнеспособностью и значительной’генетической пластичностью, что существенно затрудняет лабораторную диагностику и борьбу с ними. Сохраняется актуальность госпитального сальмонеллеза [3, 27, 88], обусловленного антибиотикорезистентными штаммами бактерий [99], наличием R-плазмид [39, 75]. Однако, в последние годы учёные все чаще высказывают предположения о существовании генетических механизмов изменения патогенности сальмонелл, которые связывают с циркуляцией между клиническими штаммами энтеробактериймобильных генетических элементов, в том числе «островов» патогенности, отвечающих за синтез различных факторов патогенности, что, в свою очередь, даёт микробам селективное преимущество и конкурентоспособность [6, 16, 28, 75, 147, 158, 165].
Появились новые данные, указывающие на немаловажную роль липо-полисахаридов (ЛПС) грамотрицательных бактерий, включая Salmonella spp., в патогенезе и модификации иммунного ответа при вызываемых ими заболеваниях [9, 38, 45, 80, 104].
Всё изложенное выше послужило основанием для проведения соответствующих исследований.
Цель работы — установить наличие и характер взаимосвязей между частотой встречаемости фрагментов генов «островов» патогенности" энтеро-бактерий, антибиотикорезистентностью выделенных штаммов сальмонелл и клиникой заболевания у взрослых, определить липополисахарид-эндотоксинемию в динамике болезни для разработки дополнительных критериев оценки тяжести, прогноза и рационального подхода к терапии сальмо-неллеза.
Задачи исследования.
1. Установить клинико-лабораторные особенности сальмонеллеза с учётом степени тяжести заболевания.
2. Определить концентрацию липополисахарида (ЛПС) в сыворотке крови больных сальмонеллёзом. в двух возрастных группах и установить взаимосвязи между уровнем ЛПС и показателями периферической крови в динамике болезни.
3. Молекулярно-генетическая детекция фрагментов генов «островов» патогенности, ассоциируемых с патогенностью Е. coli (гены, кодирующие а-гемолизины — hly (hlyA и hlyB) и адгезины — sfa (sfaA и sfaG)), у штаммов S. Enteritidis, выделенных от больных гастроинтестинальной формой сальмо-неллёза, с целью выявления дополнительных маркёров патогенности сальмонелл.
4. Выявить устойчивость к антибактериальным препаратам у клинических штаммов сальмонелл и установить взаимосвязи между антибиотикорезистентностью и тяжестью течения сальмонеллеза.
5. Установить клинико-лабораторные особенности в двух группах пациентов, от которых выделены штаммы S. Enteritidis, содержащие в геноме бактериальной клетки фрагменты генов «островов» патогенности hlyA и hlyB Е. coli, кодирующие гемолизины (первая группа) и фрагменты генов «островов» патогенности sfaA и sfaG Е. coli, кодирующие адгезины (вторая группа).
Основные положения, выносимые на.защиту.
1. Динамика ЛПС-эндотоксинемии при гастроинтестинальной форме сальмонеллёза среднетяжёлого течения имеет отличие в различных возрастных группах.
2. Клинические штаммы сальмонелл в 97,3% случаев, в том числе S. Enteritidis — в 97,1%, характеризует наличие фрагментов генов «островов» патогенности (ФГОП), ассоциируемых с патогенностью E. coli (а-гемолизины — hly (hlyA и hlyB) и адгезины — sfa (sfaA и sfaG)).
3. Тяжёлые формы сальмонеллёза отличает более частое выделение возбудителей с множественной резистентностью к антибактериальным препаратам.
Научная новизна исследования.
Показано наличие у 97,1% клинических штаммов S. Enteritidis, выделенных от взрослых больных гастроинтестинальной формой сальмонеллёза, фрагментов генов «островов» патогенности (ФГОП), ассоциируемых с патогенностью Е. coli, определяющих способность последних синтезировать фимбрии типа S (sfaA и sfaG) и а-гемолизины (hlyA и hlyB). Выявлены корреляционные связи между количеством фрагментов генов «островов» патогенности (ФГОП) в геноме бактериальной клетки и степенью тяжести заболевания. Установлено, что при обнаружении у S. Enteritidis фрагментов ДНК, гомологичных генетическим детерминантам гемолизинов Е. coli (hlyA и hlyB), чаще встречаются резистентные к антибактериальным препаратам штаммы возбудителя.
Показана взаимосвязь между частотой выявления генетических детерминант а-гемолизина E. coli у клинических штаммов сальмонелл и некоторыми особенностями клинического течения заболевания, лабораторными показателями (тромбоцитопения в острой стадии болезни (р<0,001) и снижение уровня гемоглобина крови в период реконвалесценции (р<0,023)) — также между наличием генетических детерминант адгезинов Е. coli у возбудителя и развитием более выраженного кишечного синдрома и осложнений в виде инфекционно-токсического и гиповолемического шока (р<0,05), лейкоцитозом в анализе крови в начале заболевания (р<0,034).
Практическая значимость работы.
Показано, что наличие фрагментов генов «островов» патогепности: sfaG, sfaA, hlyA, hlyB, ассоциируемых с патогенностью Е. coli, у клинических штаммов сальмонелл может выступать в качестве интегрированного маркера их патогенности. Частота обнаружения указанных генетических детерминант у возбудителей коррелирует с рядом особенностей течения сальмонеллёза, клинико-лабораторными показателями, степенью тяжести, прогнозом заболевания, их определение может использоваться при маркировании сальмонелл и выборе рационального лечения.
Указанные генетические маркёры могут использоваться при оценке роли возбудителя в эпидемическом процессе, а в сочетании с результатами определения антибиотикорезистентности сальмонелл позволяют повысить эффективность этиотропной терапии.
Апробация работы.
Основные положения диссертации доложены на Российской научно — практической конференции «Инфекционные болезни: актуальные вопросы в клинике и эксперименте» (Махачкала, 2008) — Российской научно — практиче ской конференции «Актуальные вопросы клинической медицины: инфекционных и неинфекционных болезней в клинике и эксперименте» (Махачкала, 2009) — I, II, III Всероссийском Ежегодном Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2009, 2010, 2011) — Российской научно — практической конференции «Национальные лабораторные дни» (Москва, 2010) — Республиканской научно — практической конференции, посвящённой 100 — летию муниципального учреждения инфекционной клинической больницы № 4 г. Уфы (Уфа, 2010).
Работа апробирована на межкафедральном заседании сотрудников кафедры инфекционных болезней с курсами дерматовенерологии и косметологии НПО, лабораторной диагностики ИПО, фундаментальной и прикладной микробиологии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ.
Внедрение результатов работы в практику.
Материалы диссертации опубликованы в.печати. Данные, полученные в результате проведённых исследований, дополняют знания о возбудителях сальмонеллёза и о патогенезе вызываемого ими заболевания. Результаты исследований внедрены в работу клинической инфекционной больницы № 4 г. Уфы, используются в педагогическом процессе кафедр инфекционных болезней с курсами дерматовенерологии и косметологии ИПО, лабораторной диагностики ИПО, фундаментальной и прикладной микробиологии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 3 статьив журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объём и структура диссертации.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», трёх глав собственных результатов, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 39 таблиц, 8 рисунков.
Список литературы
включает 216 источников: 105 — отечественных и 111 — зарубежных авторов.
выводы.
1. Среди пациентов, госпитализированных в инфекционный стационар с диагнозом «острая кишечная инфекция», в 37,1% случаев подтверждался сальмонеллез. Заболевание чаще регистрировалось у лиц в возрасте до 40 лет (66,7%), женского пола (61%). Клинически сальмонеллез протекал в гастро-интестинальной форме с преобладанием гастроэнтеритического варианта заболевания (83%), среднетяжёлой формы (60%). Специфические осложнения развивались в 10−8% случаев.
2. Концентрации липополисахарида в крови больных сальмонеллсзом среднетяжёлой формы в двух возрастных группах (от 18 до 50 лет и от 50 до 70 лет) повышались в динамике болезни — в 1,8 и 2,7 раза, соответственно, что отражалось на особенностях клинического течения заболевания и показателях периферической крови в виде сегментоядерного нейтрофилеза (р<0,001) в острый период болезни в первой группе и более выраженной тромбоцитопении (р<0,043) во второй группе пациентов.
3. У клинических штаммов S. Enteritidis в 97,1% случаев обнаруживались фрагменты генов «островов» патогенности (гены, кодирующие а-гемолизины — hly (hlyA и hlyB) и адгезины — sfa (sfaA и sfaG)), ассоциируемые с патогенностью Е. coli, которые выявлялись в геноме бактериальной клетки по отдельности и в различных комбинациях по 2, 3 и 4 генетических детерминант одновременно. Увеличение их количества в геноме S. Enteritidis коррелирует со степенью тяжести сальмонеллёза.
4. Установлено, что 68 (66,7%) клинических штаммов S. Enteritidis резистентны к антибактериальным препаратам, из них 35 (51,5%) — к 1−3 препаратам, 27 (39,7%) микробов — к 4−5, 6 (8,8%) — к 6 и более препаратам одновременно. Выявлена корреляционная связь средней силы и статистически достоверное сильное влияние на степень тяжести сальмонеллёза в группе возбудителей с множественной устойчивостью к антибактериальным препаратам (г*=0,57, Г|2=32%, F=22,8, р<0,001).
5. Частота выявления у клинических штаммов сальмонелл фрагментов генов, гомологичных фрагментам ДНК «островов» патогенности hlyA и hlyB Е. coli, коррелирует с множественной резистентностью культур к антибактериальным препаратам (р<0,05), тяжестью синдрома интоксикации у пациентов, тромбоцитопенией в острой стадии болезни (р<0,001) и снижением уровня гемоглобина в периоде реконвалесценции (р<0,023), а наличие у сальмонелл фрагментов генов, гомологичных sfaA и sfaG Е. coli, — с тяжестью кишечного синдрома, лейкоцитозом в начале заболевания (р<0,034) и частотой развития инфекционно-токсического и гиповолемического шока (р<0,05).
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.
1. В качестве молекулярных маркеров патогенности клинических штаммов сальмонелл, коррелирующих с тяжестью течения и прогноза заболевания, рекомендуется определение фрагментов генов «островов» патогенности ЫуА, Ь1уВ, sfaA и эГав, ассоциированных с патогенностью Е.соН.
2. Выявленные корреляционные связи между увеличением количества фрагментов генов «островов» патогенности (ФГОП) в геноме 8. ЕгйегШсИз, множественной резистентностью к антибактериальным препаратам и степенью тяжести сальмонеллеза определяют изменения в тактике ведения больных (назначение антибиотиков широкого спектра действия, проведение интенсивной дезинтоксикационной терапии).
