Особенности клеточного иммунного ответа при мукозальных способах аппликации антигенов условно патогенных микроорганизмов

Актуальность темы

Метод мукозальной иммунизации, предложенный в конце XIX, начале XX веков Д. К. Заболотным, И. Г. Савченко, A.M. Безредка, привлекал внимание исследователей на протяжении всех этапов развития вакцинологии.

Полученные данные касались разных методов введения вакцин через слизистые оболочки и были проанализированы в рамках тех теоретических представлений, которые преобладали в иммунологии того времени [1, 9, 21, 22, 33, 43 и др.]. В этот период были выявлены основные характеристики мукозальных методов иммунизации, в том числе меньшее сенсибилизирующее действие антигенов по сравнению с парентеральным способом их введения.

Последние десятилетия характеризуются прорывом в исследованиях клеточных и молекулярных механизмов иммунитета, особенно роли врождённого иммунитета и его инструктивного значения в развитии адаптивного иммунитета. Данные исследования проведены в основном при использовании парентеральных методов и лишь фрагментарно касаются мукозальных методов иммунизации [3, 179, 181].

В настоящее время возникла необходимость в обобщении данных по молекулярно-клеточным механизмам, задействованным в формировании мукозального иммунитета, так как до 90% патогенов проникают в организм через слизистые оболочки. Важное преимущество мукозальная иммунизация приобретает в условиях расширяющегося Национального календаря прививок. В настоящее время один ребенок получает в год до 20−30 прививок.

Однако число разрешенных для применения в практике мукозальных вакцин невелико, что связано с теоретическими и технологическими сложностями конструирования таких препаратов, а также недостаточностью данных по характеристике иммунитета, создаваемого при их применении [47, 48, 178].

Значительную роль на первых этапах распознавания микробных антигенов играет способ введения, определяющий набор рецепторов, взаимодействующих с лигандами микроорганизмов, и соответственно, сигнальные пути дальнейших этапов развития врожденного, а в последующем адаптивного иммунитета [31, 85, 150, 180].

Для изучения особенностей мукозального иммунитета на молекулярно-клеточном уровне в качестве антигенной модели в данной работе использована поликомпонентная вакцина Иммуновак-ВП-4 из антигенов условно патогенных бактерий. Этот препарат обладает широким набором патоген-ассоциированных молекулярных структур (ЛПС, пептидогликан, тейхоевые кислоты и др.), являющихся лигандами для клеточных рецепторов, включая семейство То11-подобных рецепторов. Установлены основные показатели активации врожденного иммунитета при его подкожном введении [3].

До настоящего времени остались не изученными молекулярно-клеточные механизмы активации врожденного иммунитета на локальном и системном уровнях при мукозальной иммунизации.

Цель исследования: Изучение особенностей клеточного иммунного ответа при мукозальных способах аппликации антигенов условно патогенных бактерий.

Задачи:

1. Определить особенности экспрессии То11-подобных рецепторов и иммунофенотип мононуклеарных лейкоцитов на клетках лимфоидных органов и тканей при мукозальных методах аппликации антигенов условно патогенных бактерий.

2. Выявить морфогистохимические изменения в лимфоидных органах и эпителиоассоциированной лимфоидной ткани при мукозальных методах иммунизации.

3. Изучить функциональную активность натуральных киллеров и продукцию цитокинов иммунокомпетентными клетками при мукозальных методах введения антигенов.

4. Оценить неспецифическую защитную активность вакцины Иммуновак-ВП-4 из антигенов условно патогенных бактерий при мукозальном введении в отношении патогенов, не входящих в состав вакцины.

5. Исследовать специфическую протективную активность Иммуновак-ВП-4 в отношении возбудителей, антигены которых входят в состав вакцины при мукозальных методах введения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Антигены условно патогенных бактерий действуют на различные сигнальные пути клеточной активации в зависимости от метода их введения: при интраназальной и пероральной аппликации увеличивается численность клеток с экспрессией TLR4 и TLR9, при подкожном введении — TLR2, 4, 9.

2. Мукозальные методы иммунизации приводят к увеличению количества ключевых эффекторов мукозального иммунитета (Туб, Bt лимфоцитов), а также CD3+, CD4+, CD8+, CD19+, CD25+ клеток не только в регионарных лимфоидных органах, но и в селезёнке. Данные факты свидетельствуют о развитии системного иммунитета, что подтверждается морфологическими исследованиями, показавшими формирование локальных иммунных реакций и генерализацию иммунного процесса.

3. Непарентеральное введение антигенов условно патогенных бактерий индуцирует увеличение численности и цитотоксической активности NK, причём наибольшей цитотоксичностью характеризуются клетки, полученные из лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником после пероральной иммунизации.

4. При мукозальных методах введения антигенов условно патогенных микроорганизмов в сыворотке крови мышей повышается уровень IL-1(3, IL-6, IL-5, IL-12- при подкожном введении, кроме указанных цитокинов, увеличивается продукция IFNy.

5. Антигены условно патогенных бактерий при мукозальных методах иммунизации стимулируют эффекторную систему врождённого иммунитета, приводя к быстрому формированию неспецифической резистентности к гетерологичным микроорганизмам и развитию адаптивного иммунитета.

Научная новизна работы.

На молекулярно-клеточном уровне выявлены особенности активации лимфоидной ткани разной локализации при мукозальных методах аппликации антигенов условно патогенных бактерий.

Впервые установлено, что при мукозальных способах введения антигенов, в отличие от подкожного, не происходит увеличения численности клеток, экспрессирующих TLR2, регулирующего продукцию IgE, что объясняет меньшее сенсибилизирующее действие антигенов при введении через слизистые оболочки. Выявленные различия предполагают существование различных сигнальных путей активации при мукозальном и парентеральном методах иммунизации. Установлено, что численность клеток, экспрессирующих TLR4, TLR9, сопоставима при мукозальном и подкожном методах иммунизации.

Показано, что при всех исследованных методах введения антигенов происходит активация ключевых эффекторов мукозального иммунитетаТуб и В] лимфоцитов, но степень их активации и локализация различны. При интраназальном и подкожном методах увеличивается их содержание в лимфоидной ткани, ассоциированной с органами дыхания, и в селезёнке, при пероральном — в лимфоидной ткани, связанной с органами дыхания и желудочно-кишечным трактом.

Выявлено, что при мукозальной аппликации антигенов повышается численность лимфоцитов с экспрессией CD3, CD4, CD8, CD19, CD25 не только в лимфоидных образованиях, ассоциированных с органами дыхания и желудочно-кишечного тракта, но и в селезёнке. Это подтверждается морфогистохимическими исследованиями, указывающими на наличие пролиферативных процессов как в регионарных к месту введения, так и в 9 отдалённых от него лимфоидных органах и тканях, включая селезёнку. Полученные данные свидетельствуют об активации не только местного, но и системного иммунитета.

Впервые установлено, что при мукозальных методах иммунизации увеличивается количество и цитотоксическая активность натуральных киллеров (natural killer — NK) во всех изученных органах и тканях. Наиболее высокой цитотоксичностью характеризовались NK, полученные из лимфоидной ткани кишечника после пероральной иммунизации (75,4± 1,83%), что согласуется с существенным (в 46 раз) нарастанием популяции NK при данном методе введения антигенов. Динамика NK при подкожном введении практически отсутствовала.

Независимо от способа аппликации антигенов выявлено повышение уровня провоспалительных (IL-ip, IL-6) и регуляторных (IL-12, IL-5) цитокинов в сыворотке крови мышей. При всех исследованных методах почти одинаково усиливался синтез IL-5, регулирующего продукцию IgA.

Продемонстрировано, что антигены условно патогенных бактерий при мукозальном введении стимулируют эффекторную систему врождённого иммунитета и приводят к быстрому формированию неспецифической резистентности, установленной на модели вируса гриппа H5N2. Также подтверждено развитие адаптивного иммунитета в острых опытах защиты от патогенов (K.pneumoniae, P. vulgaris, S. pneumoniae) при пероральном методе аппликации изученных антигенов.

Научно-практическая значимость.

Полученные данные расширяют представление о мукозальной системе иммунологической защиты, которая обеспечивается не только иммунными реакциями мукозо-ассоциированной лимфоидной ткани дыхательного и желудочно-кишечного трактов, но и системным иммунитетом.

Результаты, полученные в ходе исследования, могут быть использованы при разработке неинвазивных методов вакцинации, являющихся оптимальным способом безопасной и массовой профилактики.

10 инфекционных заболеваний. Данные о механизмах формирования мукозального и системного иммунитета при непарентеральных способах вакцинации открывают перспективы для конструирования вакцин и иммуномодулирующих препаратов, а также способствуют расширению спектра и методов их применения.

Апробация материалов диссертации.

Основные материалы диссертации представлены и обсуждены на 11-ом Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 2009) — Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009) — XIII Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2009» (Санкт-Петербург, 2009) — VII Российской конференции иммунологов Урала (Архангельск, 2009) — 1st Congress of the confederation of the european otorhinolaryngology head and neck surgery (Barcelona, Spain, 2011) — 17-ом съезде педиатров России (Москва, 2013) — V Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2013) — конференции молодых учёных ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН (Москва, tVi.

2013) — 15 International Congress of Immunology (Milan, Italy, 2013).

Апробация диссертации состоялась 25 апреля 2013 г. на конференции отдела иммунологии ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН и 11 июня 2013 г. на заседании кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А. Вагнера» Минздрава России.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, 6 — в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

.

Материалы работы изложены на 133 страницах машинописного текста и состоят из введения, главы «Обзор литературы, 4 глав «Собственные исследования», заключения, выводов и списка литературы, включающего 181 источник (62 отечественных и 119 зарубежных). Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 19 рисунками.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Мукозальная иммунизация (нанесение антигена на слизистую оболочку) имеет ряд преимуществ перед парентеральными методами введения вакцин. Они заключаются в почти полном отсутствии отрицательных реакций на прививку, способности развития иммунных реакций в месте входных ворот инфекции, простоте применения вакцин, а также в возможности широкого охвата прививками населения. Не менее важное преимущество эти методы приобретают в условиях расширяющегося «Национального календаря прививок» при ежегодном увеличении числа вакцинальных инъекций детям. В настоящее время один ребенок получает до 20−30 прививок в год. В связи с этим разработка неинвазивных методов вакцинации является основой для внедрения оптимального способа безопасной и массовой профилактики инфекционных заболеваний, в первую очередь у детей.

С теоретической точки зрения мукозальная иммунизация представляется идеальным способом защиты от инфекций, особенно если учесть, что около 90% патогенов попадают в организм, пересекая слизистые барьеры [54]. Однако число мукозальных вакцин, разрешенных для применения в практике, остается небольшим. Это связано с теоретическими и технологическими сложностями конструирования таких препаратов, а также с недостаточностью данных по характеристике создаваемого при данном виде вакцинации иммунитета. Так, к началу 2009 г. на глобальном и региональном уровнях использовалось 9 мукозальных вакцин [132]. В их число входили: живая оральная полиомиелитная вакцина из штаммов.

Сэбина, две вакцины против холеры (живая и инактивированная), живая вакцина против брюшного тифа, аденовирусная вакцина для военнослужащих, оральная вакцина против туберкулеза (Бразилия), ротавирусная вакцина и холодоадаптированная гриппозная вакцина для.

12 назального применения. В бывшем Советском Союзе разработана и прошла клинические испытания оспенная вакцина [9].

Разнообразие методов введения препаратов через слизистые оболочки (пероральный, назальный, ректальный, аэрозольный и др.) также является неоспоримым преимуществом мукозальной иммунизации. Выбор пути введения определяется свойствами вакцины и целью её применения. Рассматривают возможность комбинации инъекционного и мукозального методов вакцинации [132, 174]. Ректальный путь введения вакцины целесообразно использовать при иммунопрофилактике инфекций, передаваемых половым или вертикальным путем [95].

При создании мукозальных вакцин решаются две задачи: формирование эффективной системы защиты вводимого антигена от агрессивного действия внутренней среды желудочно-кишечного тракта и разработка методов предупреждения толерантности слизистых, развивающейся при повторном контакте с антигеном. В настоящее время разрабатывается несколько десятков мукозальных вакцин. Однако особенности создаваемого иммунитета при неинвазивных методах введения изучены недостаточно, особенно в отношении пределов вовлечения в процесс лимфоидной ткани, отдаленной от места введения вакцины, наличия иммунологической памяти, мукозальноклеточных механизмов, обеспечивающих местный и системный иммунитет. К новым мукозальным вакцинам предъявляют следующие требования: одни должны фиксироваться на клетках слизистой (оптимально в зонах М-клеток) — активировать систему врожденного иммунитета и, естественно, обладать протективной активностью [144].

Обнадеживают результаты исследований, в которых изучалась возможность применения в качестве мукозальных адъювантов агонистов.

Толл-подобных рецепторов [120,141]. С этой целью испытывали природные лиганды микробного происхождения (липополисахарид — ЛПС, липид А, пептидогликаны, тейхоевые кислоты и др.) и разнообразные синтетические.

13 препараты, прежде всего, аналоги природных лигандовмонофосфорилированный липид A (MPL®) — агонист TLR4 и цитозин-гуанин олигодезоксинуклеотиды (CpGODN), являющиеся агонистами TLR9. Исследуется также возможность включения в мукозальную вакцину комбинации агонистов TLRs.

выводы.

1. Антигены условно патогенных бактерий действуют на различные сигнальные пути клеточной активации в зависимости от метода их введения: при интраназальной и пероральной аппликации увеличивается экспрессия ТЫ14 и ТЫ19 и отсутствует активация ТЬЯ2- при подкожном введении повышается экспрессия всех изученных рецепторов — Т1П2, 4, 9.

2. Активация ключевых эффекторов мукозального иммунитета (Туб и В] лимфоцитов) наблюдается не только при непарентеральных методах иммунизации, но и при подкожном введении тех же антигенов.

3. При мукозальных методах введения антигенов условно патогенных микроорганизмов происходит увеличение количества СОЗ+, СЭ4+, СЭ8+, С019+ лимфоцитов и пролиферация иммунокомпетентных клеток как в регионарных к месту введения (в лимфоидной ткани, ассоциированной с органами дыхания и желудочно-кишечного тракта), так и в отдалённых органах иммуногенеза (в селезёнке), что обеспечивает, наряду с местным, развитие системного иммунитета.

4. Отличительной особенностью мукозальных методов аппликации антигенов условно патогенных бактерий является увеличение численности и цитотоксичности >ЛС-клеток. При интраназальном введении усиливается цитотоксическая активность клеток лимфоидной ткани, ассоциированной с дыхательным и желудочно-кишечным трактами. При подкожной и пероральной иммунизации цитотоксический потенциал ИК-клеток повышается во всех исследуемых лимфоидных органах, причём наиболее высокой активностью обладают клетки, полученные из лимфоидной ткани кишечника после перорального введения вакцины.

5. При мукозальном введении антигенов условно патогенных бактерий увеличивается синтез 1Ь-1[3,1Ь-5,1Ь-6,1Ь-12, П^-у, при этом продукция 1Ь-12 и ШТчГ-у менее выражена, чем при подкожном методе иммунизации.

6. Мукозальная иммунизация антигенами условно патогенных микроорганизмов является активным стимулятором эффекторной системы врождённого иммунитета, что обеспечивает быстрое формирование неспецифической резистентности, тестируемой в отношении вируса гриппа.

7. Антигены условно патогенных бактерий при мукозальных методах введения обладают протективным действием, установленным в отношении K. pneumoniae и P. vulgaris, что свидетельствует о развитии адаптивного иммунитета.

8. Совокупность полученных данных позволяет расширить стратегию использования вакцины Иммуновак-ВП-4 из антигенов условно патогенных бактерий с применением непарантеральных методов иммунизации для создания защиты от широкого спектра патогенов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Первой линией защиты от патогенов, для которых слизистые оболочки являются входными воротами инфекции, служит врождённая мукозальная иммунная система, обладающая для выполнения этой функции многофакторными эффекторными механизмами, позволяющими в нормальных условиях поддерживать гомеостаз между организмом и окружающей средой. Эффективный ответ мукозальной иммунной системы играет ключевую роль в борьбе с инфекциями, включая биоагенты массового поражения, такие как микроорганизмы/экзотоксины [73].

Лимфоидная ткань слизистых оболочек широко представлена в желудочно-кишечном и респираторном трактах в виде структурированных элементов, к которым относятся лимфатические узлы, ассоциированные с этими органами, пейеровы бляшки, солитарные лимфоидные узелки и диффузно расположенные иммунокомпетентные клетки, инфильтрирующие эпителий, собственную пластинку слизистых оболочек и подслизистую основу [42, 57, 64, 114].

Значительную роль в первичных этапах распознавания микробных антигенов играет метод введения их в макроорганизм, определяющий набор рецепторов, взаимодействующих с лигандами микроорганизмов, и, соответственно, сигнальные пути дальнейщих этапов развития врожденного иммунитета. То11-подобные рецепторы (ТЬЯб) млекопитающих являются членами семейства паттерн-распознающих рецепторов (РЮ^) и играют ключевую роль в инициации эффекторов врожденного иммунного ответа и в последующем адаптивного иммунитета к микробным патогенам [37, 91, 156].

Экспериментальные и клинические данные демонстрируют, что экспрессия и активация ТЬЯб в организме осуществляются при помощи сложных иммунорегуляторных механизмов [152], особенно в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ), где формируется уникальная среда микроокружения (присутствие комменсальной микрофлоры и патогенных микроорганизмов). В ЖКТ данная регуляция проявляется в: 1) сниженной регуляции поверхностной экспрессии ТЬЯб кишечного эпителия- 2) специфическом тканевом распределении и компартментализации ТЬЯ-экспрессирующих клеток в кишечнике- 3) высоком уровне экспрессии ТЬЯ-антагонистов/ аттенуирующих факторов, подавляющих экспрессию и активацию ТЬЯв на клеточной поверхности. Данные механизмы обеспечивают возможность слизистой ЖКТ уходить от ненужной активации ТЬЯб комменсальными бактериями, сохраняя при этом способность к детекции патогенов, быстрому усилению эффективного иммунного ответа [108].

В настоящее время расширился интерес к исследованию возможности регуляции сигнальных путей ТЬЯб при помощи иммунотропных средств, несущих в своем составе РАМРб микроорганизмов и обеспечивающих при этом определенную степень защиты от различных патогенов [50, 53], а также активаторов и супрессоров ТЬЯб, и их антагонистов (РРА11у) [108]. Проводятся исследования в области генотерапии с целью коррекции генных дефектов ТЪЯ, однако, множество путей сигнального каскада еще предстоит изучить [129]. Данный вопрос остается актуальным в области иммунотерапии и вакцинопрофилактики для выявления механизмов действия различных иммуномодулирующих и вакцинных препаратов на экспрессию и активацию ТЬЯб. При этом разработка непарантеральных (мукозальных) методов вакцинации является оптимальным способом безопасной и массовой профилактики инфекционных заболеваний особенно у детей.

Широкий набор лигандов к ТЫШ2,4,5,6,9 (РАМРб) в вакцине Иммуновак-ВП-4, содержащей комплекс антигенов условно патогенных микрорганизмов, обусловливает высокую активность этого препарата в отношении врождённого иммунитета, установленную в экспериментах на молекулярно-клеточном уровне при подкожном введении [3] и на различных инфекционных моделях [15, 27]. В этих исследованиях, однако, остался не изученным вопрос о степени влияния Иммуновак-ВП-4 и других иммуномодуляторов микробного происхождения на экспрессию ТЬЯб клетками селезёнки и лимфоидных органов и тканях, ассоциированных с органами дыхания и желудочно-кишечным трактом, что определяет особенности формирования врождённого и адаптивного иммунитета при непарентеральных методах иммунизации. В связи с этим, одной из задач исследования явилось определение степени экспрессии ТЬЯб клетками лимфоидных органов и тканей при разных методах введения Иммуновак-ВП-4, использованную в качестве модели действия антигенов условно патогенных микрорганизмов. Во всех исследованиях вакцину вводили мышам интраназальным, пероральным и подкожным способами, по 0,5- 2 и 0, 2 мг соответственно.

Выявлена стимуляция экспрессии ТЬЯэ на клетках всех исследованных лимфоидных органов и тканей, однако, степень их экспрессии была отличной в различных органах в зависимости от дозы и методов введения. При интраназальном введении использована доза всего в 2,5 раза превышающая дозу, вводимую пожкожно, поскольку ввести мышам большую дозу данным методом было технически невозможно. При пероральном введении доза введения препарата в 10 раз превышала подкожную, что отразилось на степени экспрессии То11-подобных рецепторов. При этом методе введения антигенов условно патогенных бактерий уровень экспрессии ТЬИ^ на клетках всех изученных органов и тканей был значительно выше, чем при интраназальном способе аппликации. Как при однократном, так и при 3-кратном введении антигенов наиболее активно при всех методах введения экспрессировался ТЫ19, не только на клетках лимфоидных органов, ассоциированных со слизистыми оболочками (МАЬТ/ВАЬТ), но и селезёнки. Выявлена несколько меньшая степень экспрессии ТЬЯ4. Обращает на себя внимание, что при нерпрентеральных методах отсутствовала существенная динамика экспрессии ТЬЯ2, которая была на высоком уровне только при подкожном введении вакцины во всех исследованных органах (кроме кишечника). Этот факт очень важен, поскольку исследования последних лет свидетельствуют о том, что ТЪЯб не только принадлежит ключевая роль на различных этапах развития врождённого иммунитета, но они имеют важное значение в выборе пути формирования адаптивного иммунитета [173], так как программа активации антигенпредставляющих клеток запускается сразу после распознавания и взаимодействия патогена с ТЬЯ. При этом показано, что активация Т1Л4 и ТЫ19 вызывает дифференцировку Т-хелперов 1 типа, тогда как ТЬЯ2 активируют Т-хелперы 2 типа, и приводят к сдвигу в системе ТЬ-1 и ТЬ-2 в сторону ТЬ-2 пути [173].

Лиганды ТЫ14 (ЛПС, липид А) вызывают индукцию синтеза высокого уровня 1Ь-12, лиганды ТЫ12 (пептидогликан, липотейхоевая кислота, зимозан) стимулируют синтез 1Ь-4 и лишь слабую индукцию 1Ь-12, и таким образом, ТЪЯб в зависимости от действующего на них лиганда могут направлять различные пути развития адаптивного иммунитета.

В настоящих исследованиях при неинвазивных методах иммунизации антигенами условно патогенных микрорганизмов активировалась индукция ТЫ14 и ТЫ19 при отсутствии динамики со стороны Т1Л2. Это, возможно, является одним из этапов в расшифровке механизма действия непарантеральных методов иммунизации, обеспечивающих при достаточной дозе выраженную защитную активность препарата при существенно меньшей степени сенсибилизации немедленного и замедленного типов, чем при подкожном введении тех же препаратов.

Характерно и то, что при пероральном методе иммунизации экспрессия ТЬЯб была установлена во всех исследованных органах, в том числе в селезёнке. Участие селезёнки в этом процессе позволяет предполагать формирование не только местного, но и системного иммунитета.

Подкожное введение Иммуновак®ВП-4, судя по экспрессии всех 3-х исследованных ТЬЯб (ТЬЯ4, ТЬЯ9, Т1Л12), обусловливает клеточную дифференцировку по ТЬ-1и ТЬ-2 пути. Мукозальное введение антигенов, вероятно, предполагает поляризацию иммунного ответа преимущественно по ТЬ-1 пути, так как усиливается экспрессия ТЬЯ4 и ТЬЯ9, соответственно этому — индукция синтеза ШИ-у, ингибирующего синтез 1Ь-4. Таким образом, можно полагать, что различная степень сенсибилизации при разных путях введения одних и тех же антигенов условно патогенных бактерий предопределена уже на этапе взаимодействия лиганда с ТЬЯ.

Связывание лигандов с ТЬЯ ведет к димеризации последних и их взаимодействию с адапторными молекулами, влекущему за собой запуск каскадной передачи сигнала с активацией клеток [72].

При мукозальиой иммунизации важная роль в осуществлении защитной реакции принадлежит Туб и Bt лимфоцитам, заселяющим эпителий и собственную пластинку слизистых оболочек [57, 50, 64, 178].

Для выявления механизмов, обеспечивающих активацию мукозального иммунитета и способность развития при этом не только местного, но и системного иммунитета к бактериальным лигандам условно патогенных микроорганизмов, были проведены эксперименты по изучению динамики дифференцировки, локализации различных популяций лимфоцитов при разных методах аппликации (интраназальной, пероральной и подкожной) Иммуновак-ВП-4 в эксперименте на мышах.

При однократном введении мышам вакцины через 24 часа оценивали субпопуляционную структуру лимфоцитов в селезёнке, лимфоузлах, ассоциированных с органами дыхания (NALT/BALT) и лимфоидной ткани слизистой тонкого кишечника (GALT).

Эксперименты показали, что метод введения оказывает существенное влияние на клетки, экспрессирующие дифференцировочные, активационные маркеры и молекулы антигенного представления. Например, при интраназальном введении антигенов условно патогенных микроорганизмов активация шла преимущественно в лимфатических узлах, ассоциированных с органами дыхания NALT/BALT, где отмечалось повышение количества Туб лимфоцитов более чем в 30 раз. Этот метод аппликации включал механизмы, ответственные за индукцию ТЬ-1типа ответа врождённого звена иммунитета — NK (повышение почти в 4,5 раза), а также Th-2 типа — В и В]-лимфоцитов (соответственно в 7,75 и 1,5 раз), являющихся важнейшими показателями активации адаптивного иммунитета. Повышение численности Туб (в 4,5 раза) лимфоцитов в селезёнке при данном методе введения указывает на развитие системного иммунного процесса.

Только пероральное введение Иммуновак-ВП-4 увеличивало в лимфоидном аппарате тонкого кишечника (GALT) количество активированных клеток (CD25+), В и Туб-клеток более 10 раз, чего не наблюдалось при других методах аппликации. Но данный метод также оказывал влияние на лимфоузлы NALT/BALT, где численность клеток, экспрессирующих все исследуемые маркеры, возрастала в 2−3 раза, a NKT клеток — в 5 и Ту5-клеток — в 21 раз. В селезёнках мышей при пероральном введении препарата отмечено повышение CD4-, CD5- экспрессирующих клеток более, чем в 3 раза.

Подкожная аппликации Иммуновак®в большей мере активировала эффекторы лимфоузлов, ассоциированных с дыхательным трактом, где было отмечено повышение численности клеток, экспонирующих Туб (почти в 40 раз), NKT (в 15 раз), CD5 (в 8,7 раз) и CD3 (в 6,6 раз). Количество В] и Туб лимфоцитов было увеличено и в селезёнке мышей (почти в 8 раз).

Следует отметить, что при всех методах аппликации повышалась численность Bi и Туб-лимфоцитов в селезёнке и лимфоузлах (NALT/BALT), а при пероральном методе и в лимфоидной ткани кишечника (GALT), которая, рассматриваются большинством исследователей как первая линия защиты от различных патогенов.

При однократной энтеральной иммунизации антигены условно патогенных бактерий активировали преимущественно врождённую эффекторную систему мукозального иммунитета. Подкожное введение препарата на первые сутки приводило к преимущественной активации эффекторов врождённого иммунитета, которая приобретала системный характер.

Так, интраназальное введение Иммуновак активировало NK, связанные с дыхательным трактом, пероральное введение — NK слизистой кишечника, а при подкожном введении происходила генерализация процесса. Это подтверждают результаты экспериментов, где у мышей возрастала цитотоксическая активность NK клеток по отношению к линии клеток эритробластного лейкоза человека К562 в регионарных лимфоидных органах, связанных с местом введения, а при парентеральном методе иммунизацииво всех лимфоидных органах и тканях.

Данные морфологических иследований подтвердили результаты, полученные при изучении иммунофенотипа клеток-эффекторов иммунитета в лимфоидных органах и тканях мышей при однократной аппликации антигенов условно патогенных микрорганизмов в зависимости от метода их введения,? результате морфологических исследований установлено, что при всех способах введения условно патогенных антигенов в организм мышей происходит активизация иммунокомпетентных клеток как в эпителиассоциированной лимфоидной ткани, так и в структурированных лимфоидных органах. Причём степень и топография активизации зависит от способа введения вакцины. При непарантеральных способах аппликации Иммуновак наиболее выраженная реакция наблюдается в ближайших к месту введения лимфоидных образованиях. При интраназальном — в регионарных лимфатических узлах и эпителиоассоциированной лимфоидной ткани верхних дыхательных путей и бронхиального дерева. Пероральное введение препарата приводит к наиболее яркой пролиферативной реакции клеток лимфоидного ряда в брызжеечных лимфоузлах и кишечно-ассоциированной лимфоидной ткани. Однако, следует отметить, что нерапантеральная аппликация вакцины вызывает заметные изменения и в отдалённом от места введения вторичном лимфоидном органе — селезёнке, что свидетельствует о генерализации иммунного процесса как при интраназальном, так и в большей степени пероральном введении антигенов. Подкожное введение вакцины Иммуновак характеризуется распространённостью активации лимфоидной ткани на все лимфоидные органы, NALT/BALT и GALT.

В следующей серии экспериментов мышам вакцину вводили трехкратно интраназально (по 500 мкг) и перорально (по 2 мг), а подкожно 2 раза (по 200 мкг). Вакцинацию во всех случаях проводили с интервалом в 3 дня. Через 1 сутки после последнего введения вакцины у мышей, как и в предыдущих экспериментах, исследовали иммунофенотип клеток селезенок, лимфатических узлов, ассоциированных со слизистой носовой полости и органами дыхания (NALT, BALT) и лимфоидной ткани тонкого кишечника.

Отличительными особенностями многократного интраназального метода введения вакцины было значительное повышение исследованных показателей на клетках-эффекторах лимфатических узлов NALT/BALT и селезёнки. В лимфатических узлах NALT/BALT содержание лимфоцитов Ту8 и Bi (CD5) было выше (соответственно в 2 и 1,3 раза) чем в селезёнке, что, возможно, необходимо для формирования эффективного иммунного ответа во «входных воротах» инфекции. При этом, наоборот, содержание Th (CD4) в селезёнке превосходило их количество в NALT/BALT почти в 7 раз. Эти данные демонстрируют, что наряду с активацией мукозального иммунитета, в лимфоидных органах наблюдалась индукция адаптивного иммунного ответа.

При пероральном многократном введении вакцины во всех исследованных органах отмечены выраженные изменения. В лимфоидной ткани кишечника относительное число эффекторов мукозального врожденного иммунитета (Туб, Bj лимфоцитов и NK клеток) увеличилось более чем в 40 раз, что приводило к активации других эффекторов адаптивного иммунитета (CD3, CD4, CD8, CD 19). При данном методе введения аналогичные изменения были отмечены и в лимфатических узлах NALT/BALT, но в отличие от интраназального в селезёнке иммунизированных мышей иммунный ответ был слабее. Следовательно, при пероральной аппликации мишенями активации эффекторных клеток, прежде всего, являются лимфоидная ткань тонкого кишечника и лимфоузлы респираторного тракта, где происходит индукция как врождённых, так и адаптивных механизмов мукозального иммунитета.

При подкожном многократном методе вакцинации отмечено существенное повышение численности Туб в лимфатических узлах NALT/BALT и селезёнке (соответственно в 240 и 31,2 раз) — также выявлен высокий уровень повышения В] лимфоцитов в этих органах при меньшей степени увеличения содержание CD25, CD4. Таким образом, при подкожном методе введения бактериальных антигенов происходила существенная активация клеток-эффекторов врожденного иммунитета в селезёнке и лимфатических узлах NALT/BALT. Значительно меньшая динамика этих показателей, как и при интразальном методе введения, выявлялась в лимфоидной ткани тонкого кишечника.

Таким образом, при всех методах многократного введения антигенов условно патогенных бактерий, как и при однократной иммунизации, происходила активация эффекторов мукозального иммунитета Ту8, Bi (CD5) лимфоцитов, а также других иммунокомпетентных клеток: CD3+, CD4+, CD8+. Пероральный метод иммунизации характеризовался также повышением NK и CD19+. Для всех методов было характерно увеличение количества клеток с экспрессией маркера активации МНС II.

Данные эксперименты демонстрируют, что лимфоидные клетки мигрируют из регионарных лимфоузлов слизистых через лимфу/кровь в лимфоидные органы и ткани, что обеспечивает при мукозальной иммунизации развитие не только местного, но и системного иммунитета. При многократном интраназальном введении вакцины цитотоксическая активность NK клеток усиливалась в лимфатических узлах NALT/BALT и в GALT (соответственно в 2,1 и 4,2 раз). При подкожной и пероральной иммунизации функциональная активность NK возрастала во всех исследуемых лимфоидных органах и тканях. Обращает на себя внимание то, что наиболее высокой цитотоксичностью характеризовались клетки, полученные из лимфоидной ткани слизистой кишечника после пероральной иммунизации (75,4±1,83)% (повышение в 37,7 раз). Это согласуется с тем, что только в этом случае было выявлено существенное нарастание популяции NK-клеток после иммунизации.

Цитокиновый профиль сывороток мышей показал, что независимо от метода введения Иммуновак, происходила активация эффекторов иммунной системы, о чем свидетельствует повышение уровня провоспалительных.

IL-ip, IL-6 и регуляторных — IL-12, IL-5 цитокинов. Важнейшим связующим звеном между врожденным и адаптивным иммунитетом является IL-12. Он играет центральную роль в иммунной дифференцировке Т-лимфоцитов в Т-хелперы 1 типа, стимулирует формирование функционально активных цитотоксических Т-клеток, активирует NK-клетки [6, 19, 68, 99].

При подкожном введении концентрация цитокинов была выше, чем при мукозальных методах аппликации, а также происходила индукция IFN-y, который является мощным активатором антимикробных функций фагоцитов и играет ключевую роль в резистентности ко многим патогенным бактериям, вирусам, грибкам и внутриклеточным паразитам [163]. При действии этого цитокина В-лимфоциты продуцируют IgG антитела.

Таким образом, интенсивная активация клеток наблюдалась именно в тех органах, которые имели непосредственное отношение к методу введения. При этом происходил интенсивный обмен между лимфоидными клетками не только в лимфоузлах, ассоцированных с дыхательным аппаратом, и лимфоидных образованиях слизистой тонкого кишечника, но и в селезёнке, что свидетельствует об интеграции тонких механизмов регуляции мукозального и системного иммунного ответов.

Пероральная иммунизация у мышей вызывала значительное повышение резистентности к возбудителям, антигены которых входят в состав вакцины — K. pneumoniae, P.vulgaris. Значительный интерес представляют данные о защите в отношении S. pneumoniae тип 3, антигены которого не входят в состав вакцины, в то же время этот возбудитель является важнейшим этиологически значимым фактором хронических воспалительных заболеваний органов дыхания. Активация иммунокомпетентных клеток кишечника, регионарных лимфатических узлов, генерализация этого процесса и распространение эффекторов в лимфоидные органы, отдаленные от пути введения вакцины, является основным моментом, обеспечивающим защиту от пневмококка. Возможно, иммунитета, что обеспечивает не только быстрое формирование неспецифической резистентности, но и развитие адаптивного иммунитета. Последнее в наших исследованиях подтверждено в острых опытах защиты от патогена (K.pneumoniae, P. vulgaris, S. pneumoniae) мышей, вакцинированных перорально, и зараженных подкожно. Мукозальные вакцины, конструируемые на основе таких антигенов, обеспечивают активацию врождённого и адаптивного иммунитета, их применение апробировано с хорошим эффектом в клинической практике [37, 38]. Использование микробных антигенов в качестве мукозальных вакцин, иммуномодуляторов и адъювантов является перспективным направлением современной клинической иммунологии.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что происходит интенсивный обмен лимфоцитами не только между лимфоидными образованиями, ассоциированными со слизистыми оболочками (BALT/NALT, GALT), но и с селезёнкой, что обеспечивает при мукозальной иммунизации развитие не только местного, но и системного иммунитета. Мукозальная вакцинация должна имитировать естественную инфекцию по ее способности стимулировать мощный локальный иммунный ответ в верхних отделах респираторного тракта. При этом необходимо, чтобы вакцина активно индуцировала как Th2 — иммунный ответ в IgA-индуктивных зонах слизистых, так и Thl-иммунный ответ в виде увеличения функциональной активности локальных ЦТЛ и экспрессии цитокинов, отвечающих за индукцию IgG-AT. По-видимому, с этой точки зрения, наиболее эффективным является интраназальный путь введения вакцин и разработка непарантеральных методов вакцинации является оптимальным способом безопасной и массовой профилактики инфекционных заболеваний.