Биохимическая схема. 
Получение лимонной кислоты

Биосинтез лимонной кислоты осуществляется с помощью культуры А. niger, специально селекционированной для получения высоких выходов продукта. В качестве углеродсодержащего субстрата используют мелассу, которая кроме углеводов, содержит большой ряд органических кислот. Применение определенной питательной среды с сахарозой приводит к меньшему качественному разнообразию кислот (лимонная, щавелевая кислота).

Биохимический механизм образования лимонной кислоты основан на функционировании цикла трикарбоновых кислот. Дегидрирование уксусной кислоты приводит к образованию двух молекул СО2 и четырех пар ионов водорода. В цикле происходит также образование НАДН и АТФ. Хотя большинство реакций цикла обратимы, основным направлением течения энзиматических реакций является образование щавелево-уксусной кислоты через б-кетоглутаровую, янтарную и фумаровую кислоты.

Реакцией, лимитирующей скорость оборота цикла, является синтез лимонной кислоты, катализируемый аллостерическим ферментом цитрат-синтетазой.

Источником ацетила, который идет на синтез метаболитов цикла, является продукт цикла — лимонная кислота — легко переходящая в цитоплазму через мембрану.

Как правило, из ЦТК на нужды биосинтеза уходит значительное количество метаболитов, и пополнения их фонда и функционирования полного цикла в клетках существуют дополнительные возмещающие ферментативные механизмы, например глиоксилатный шунт.

В последнем, в отличие от ЦТК, уксусная кислота расходуется на синтез.

Следовательно, первой реакцией ЦТК является конденсация ацетила со щавелево-уксусной кислотой, катализируемая цитрат-синтетазой.

Именно активность этого фермента является контролирующим параметром, определяющим скорость метаболического потока в цикле. Ингибирующий эффект на цитрат-синтетазу оказывает НАДН.

Но основное влияние на скорость синтеза лимонной кислоты оказывает поступление субстрата (щавелево-уксусной кислоты).

Так как непрерывная «работа» ЦТК требует окисления восстановленных эквивалентов, максимальная скорость цикла наблюдается в условиях достаточного доступа кислорода в клеточную систему (т. е., при хорошей аэрации).

Аэрация имеет критическое значение для глубинной ферментации. Пропускание чистого О2 увеличивает образование лимонной кислоты, но это дорого, газовая фаза может циркулировать, если при этом поглощается СО2. Прерывание аэрации на короткое время может иметь губительное действие на продукцию лимонной кислоты, но если при этом повысить рН с 3,0 до 4,0, то ферментация может начаться снова.

Рис. 6. — Биохимическая схема синтеза лимонной кислоты:

У грибов различают трофофазу, которая характеризуется ростом мицелия и активным дыханием с выделением СО2, и идиофазу (продукционную фазу), когда рост завершен, дыхание подавлено, а оставшаяся глюкоза перерабатывается во вторичные метаболиты, в данном случае в лимонную или другие кислоты.

Образование лимонной кислоты может быть условно разделено на три процесса:

• 1 — разложение гексоз до ацетила при гликолизе;
• 2 — анаплеротическое образование оксалоацетата из пирувата и СО2 и 3 — аккумуляция цитрата в ЦТК. А. niger разлагает глюкозу по гексозодифосфатному (80%) и гексозомонофосфатному пути.

При работе первого пути СО2, образованная в результате декарбоксилирования пирувата, фиксируется при анаплеротическом образовании оксалоацетата. При работе гексозомонофосфатного пути СО2 не фиксируется. Наряду с гликолизом у A. niger частично реализуется и другой путь окисления углеводов — пентозофосфатный, называемый также пентозным, гексозомонофосфатным, или фосфоглюконатным.

Общим с гликолизом исходным продуктом является глюкозо-6-фосфат, но в дальнейшем их пути расходятся: фермент фосфофруктокиназа определяет дихотомический путь, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа — апотомический.

Конечными продуктами процесса являются 3-фосфоглицериновый альдегид и рибозо-5-фосфат. Первый из них по реакциям гликолиза превращается в пировиноградную кислоту, поэтому пентозофосфатный цикл рассматривается как шунт гликолитического пути.

Основное назначение цикла — снабжение клетки НАДН2, необходимой для восстановительных реакций синтеза липидов и стероидов, и пентозами, в основном рибозой, используемой в синтезе нуклеотидов и нуклеиновых кислот.

Гексозомонофосфатный путь и гликолиз имеют много общих ферментов. Таким образом, оба пути могут реализовываться в клетке одновременно. При превращении 6 молекул глюкозо-6-фосфата по гексозомонофосфатному пути суммарный эффект будет тот же, что и при окислении 1 молекулы гексозы в СО2 по пути гликолиза и ЦТК.

В процессе разложения глюкозы образуются промежуточные соединения: манит, ара-бит, эритрит, глицерин.

Образование лимонной кислоты тесно связано со скоростью фиксации СО2. Фиксацию СО2 у А. niger осуществляет конститутивный фермент пируваткарбоксилаза. Существуют почти стехиометрическое отношение между фиксацией СО2 и продукцией цитрата.

Фермент аконитаза, участвующий в расщеплении цитрата в ЦТК, снижает его продукцию. Считали, что при дефиците Fe или при добавлении Cu происходит ингибирование аконитазы и соответственно увеличение выхода цитрата. Однако аконитаза катализирует реакцию, сильно сдвинутую в сторону образования цитрата, и необходимости в ее ингибировании нет. Другой фермент — НАДФН зависимая изоцитратдегидрогеназа, которая теоретически должна способствовать снижению аккумуляции лимонной кислоты, ингибируется цитратом.

Правда, у А. niger имеется еще один аллостерически НАД связанный фермент — изоцитратдегидрогеназа, которая активируется цитратом.

Выход лимонной кислоты зависит от активности б-кетоглутаратдегидрогеназы. Образование из б-кетоглутарата под действием б-кетоглутаратдегидрогеназы называют узким местом ЦТК. Фермент ингибируется физиологической концентрацией щавелево-уксусной кислоты и НАДН. Увеличение клеточного оксалоацетата снижает катаболизм цитрата на уровне б-кетоглутарата и одновременно усиливает скорость его синтеза при участии цитратсинтазы.

Аккумуляция б-кетоглутарата и НАДН снижает активность НАД (НАДФ) изоцитратдегидрогеназы, что способствует увеличению накопления цитрата до уровня, при котором сам ингибирует вышеуказанный фермент. Цитрат сильно ингибирует транспорт глюкозы в клетке путем подавления активности фосфофруктокиназы.

Последнему противодействует увеличение концентрации NH4+, а накоплению NH4+ способствует дефицит Mn в среде. Полагают, что при дефиците Mn усиливается разложение белков и внутриклеточное содержание NH4+ возрастает.

Повышение концентрации аммонийных ионов внутри клеток смягчает ингибирующее влияние цитрата на фосфофруктокиназу.

Большинство исследователей склоняется к мнению, что основную роль играет ингибирование ферментов — аконитатгидратазы и изоцитратдегидрогеназы.

Ингибирование аконитатгидратазы объясняют действием самой лимонной кислоты или избытка гексацианоферрата калия, применяемого для обработки мелассных сред перед ферментацией.

При интенсивном кислотообразовании активность цитратсинтетазы возрастает приблизительно в десять раз. Однако по имеющимся данным еще нельзя решить вопрос, что является причиной накопления лимонной кислоты — ингибирование указанных двух ферментов или активирование цитратсинтетазы.

Известно, что ко вторым суткам ферментации в среде, уже покрытой тонкой мицелиальной пленкой, в ощутимых количествах содержатся янтарная и яблочная кислоты, а также не относящиеся к ЦТК кислоты: глюкановая, сахарная и малоновая.

Первые две кислоты образуются непосредственным окислением глюкозы, малоновая как промежуточный продукт на пути синтеза насыщенных жирных кислот.

Содержание этих кислот возрастает до третьих-пятых суток ферментации.

Таким образом, ингибирование аконитатгидратазы и изоцитратдегидрогеназы начинают вызывать перечисленные выше кислоты, что вызывает постепенное накопление лимонной кислоты, которая в свою очередь еще больше ингибирует данные ферменты, и усиливает их синтез.

Следует обратить внимание еще на одного возможного участника в этом механизме — малоновую кислоту, являющуюся специфическим ингибитором сукцинатдегидрогеназы.

Малоновая кислота образуется больше других кислот и содержание ее в среде возрастает до четвертых-пятых суток — времени начала наиболее интенсивного продуцирования лимонной кислоты.

В период интенсивного накопления лимонной кислоты в ЦТК преобладает анаплеротический путь метаболизма, т. е., сначала происходит карбоксилирование пировиноградной кислоты с образованием щавелево-уксусной, а затем конденсация ее с ацетила.

Интенсивность образования лимонной кислоты в этот период может быть понятна также из того, что в данном случае резко ограничиваются возможности конструктивного и энергетического обмена веществ клетки и A. niger для поддержания жизнеспособности вынужден перерабатывать значительно большее количество субстрата.

Фактором, стимулирующим аккумуляцию лимонной кислоты, служит аэрация. О2 необходим и для окисления гликолитического НАДН в процессе лимоннокислой ферментации.